刘旺霞[1]2002年在《自身免疫性肝炎肝脏病理损伤及纤维化机制的研究》文中进行了进一步梳理目的 自身免疫性肝炎(AIH)是危害中年女性身体健康的重要肝病之一，目前，我国尚无统一的临床诊断标准，国人AIH的的临床病理特征尚待明确，AIH肝脏免疫病理损伤及纤维化机制尚不清楚。本课题研究国际AIH诊断评分标准(IAIHG，1999)对我国AIH患者临床诊断的实用性及AIH的病理学特征；探讨AIH肝免疫损伤及肝纤维化机制。 方法 收集36例临床资料完整且有配套肝穿刺病理检查的AIH患者的外周血标本、穿刺肝组织标本，进行血清学、病理组织学及临床资料分析；对8／36例AIH患者外周血树突状细胞(DCs)进行分离、培养，超微结构观察，并用流式细胞仪对多种DC表面分子及淋巴细胞(LC)亚群进行检测；采用系列LC单克隆抗体以免疫组化方法对上述36例AIH患者肝组织原位LC亚群进行观察分析：以突触素(SYN)作为肝星状细胞(HSC)标志物，采用免疫组化方法检测HSC、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)及膜型基质金属蛋白酶(MT-MMPs)的表达；应用原位杂交(ISH)方法检测MT1-MMP mRNA及组织型金属蛋白酶(TIMPs)mRNA的表达变化。 结果 1。按国际AIH诊断评分标准(IAIHG，1999)诊断AIH病例与肝组织病理学诊断符合率为97.3％。36例AIH肝组织病理学特点为活动性慢性炎症改变，呈现界面炎范围较广且严重，桥接坏死易见，小叶性炎症显着，可见坏死区周围肝细胞“玫瑰花状”结构，部分可组织可见小叶中央区融合性坏死，炎症区内较多单个核细胞(MNC)浸润，有不同程度肝纤维化。 2．AIH组外周血源性DC细胞HLA-DR表达明显高于健康对照组，表面分子CD80、CD86、CD1a和HLA-DR明显高于乙肝组；与健康对照组比较，AIH组外周血总T细胞，CD8细胞及γδT细胞增高；AIH肝组织内浸润的MNC以T淋巴细胞比例为高，CD8~+、CD57~+细胞数随组织学活动指数(HAI)的增加而增多。 3．36例AIH肝组织内SYN阳性HSC主要分布于汇管区、细胞纤维间隔及肝小叶炎症活动部位，尤其活动性界面炎部位往往呈聚集性分布，周围易见胶原纤维沉积，SYN阳性HSC数量与AIH肝组织HAI大致呈正相关。ColⅠ、ColⅣ的表达量随AIH肝纤维化程度的增加而增加。COlⅣ主要于活动性炎症区域随塌陷窦壁呈聚集性分布，ColⅠ主要见于纤维间隔及汇军事医学科学院硕士学位论文中文摘要管区内，Coll为55一6期(K nodell)Am肝组织内主要的细胞外基质(砚M)成分。MTI一MN[P及m只NA阳性细胞主要见于汇管区周围界面炎及细胞纤维间隔边缘部位间质细胞内，周围少部分肝细胞亦呈阳性表达MTI一MMP及其mRNA表达与AIH肝组织HAI密切相关，且随AIH肝纤维化分期而增强，于54一5期(Knodell)表达量最高，其后有所下降。AIH肝组织内TIMp一1的表达变化随肝纤维化的进展大致呈递增趋势。结论 1 .1999年修改的国际AIH诊断评分标准同样适合于我国AIH患者的临床诊断。AIH肝组织较其他肝病有较特异的病理学特征。 2.本实验成功分离培养外周血源性DC。AIH组外周血源性DC表面分子检测结果提示AIH患者DC存在异常的免疫活性，Dc可能与AIH疾病的发生有密切关系。AIH外周血淋巴细胞亚群结果显示总T细胞、CDS细胞增高;AIH肝组织内浸润的MNC标记检测，结合外周血淋巴细胞亚群分析结果提示 AIH以细胞免疫为主，但不除外ADCC及Y 6T细胞介导的免疫损伤机制的参与。3 .A工H免疫损伤致反复持续性活动性炎症引起Hsc的大量活化、增殖，进而引起ECM的沉积可能是AIH肝纤维化发生和进展的重要原因之一。价lesMMP及其。RNA与Collv在炎症活动部位的平行分布或表达，推测MTlee呱尸引起CollV的降解，改变HSC周围的微环境而诱导HSC的激活可能是HSc活化、增殖的机制之一。AIH肝组织内T工MP增加且与纤维化分期相平行提示A工H ECM的降解水平相对低下可能是Am肝纤维化进展的另一重要机制之一。此外，本实验结果显示S翎为研究肝纤维化组织内HSC的一个较好的标志物。
李文文[2]2016年在《雷帕霉素对自身免疫性肝炎的作用及机制》文中研究说明一.雷帕霉素对刀豆蛋白A诱导的急性肝损伤的作用及机制目的:观察尾静脉注射不同浓度刀豆蛋白A(ConcanavalinA,ConA)后不同时间点小鼠的肝脏损伤、血清学变化,从而确定造模的最佳剂量与时间。研究Con A对脾脏树突状细胞、巨噬细胞、T、B淋巴细胞表型的影响,从而探讨Con A模拟自身免疫性肝炎的发病机制。进一步探讨雷帕霉素对刀豆蛋白A(Con A)诱导的急性肝损伤的治疗作用,并分析其发挥作用的机制。方法:1.建立急性肝损伤小鼠模型:8周龄雌性C57BL/6小鼠,平均体重20g。按Con A浓度随机分为10 mg/kg、15mg/kg、20 mg/kg叁组,分别于注射Con A后的6h、24h、48h随机取6只小鼠,检测小鼠血清生化水平(AST、ALT);肝组织进行HE染色并作出评分。2.雷帕霉素对急性肝损伤的防治作用:随机分为对照组、Con A造模组和Con A造模~+雷帕霉素(RAPA)治疗组。雷帕霉素处理2h后尾静脉注射Con A,24h后检测各组小鼠血清ALT和AST水平;肝组织行HE染色并病理评分。3.流式细胞分析术检测脾脏树突状细胞(DC,MHC-Ⅱ~+CD11C~+)的比例及表面共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达情况,同时检测CD4~+T、CD8~+T及CD4~+CD25~+调节性T细胞(Treg)的比例变化及巨噬细胞和B细胞的变化情况。结果:1.随着Con A剂量的增大对肝脏的损伤逐渐加重,10mg/kg剂量对小鼠的肝损伤不显着,可见局部点状坏死。15mg/kg剂量可引起点状或片状坏死。20mg/kg的剂量注射后24小时内小鼠会死亡。Con A组小鼠血清ALT、AST的水平较对照组(PBS组)明显升高,且Con A注射剂量与小鼠血清ALT、AST的水平呈正相关。2.ConA对脾脏免疫细胞的影响主要体现在CD4~+T细胞比例显着上调,巨噬细胞、B细胞、树突状细胞的比例呈升高趋势,且树突状细胞共刺激分子(CD80、CD86)显着上调。3.RAPA治疗组小鼠的血清AST和ALT的水平较Con A组降低,肝脏组织坏死及炎细胞浸润程度较轻;可以下调DC的CD80、CD86共刺激分子的表达,同时降低CD4~+T和CD8~+T细胞占脾脏细胞的比例,并且能够促进CD4~+CD25~+Treg的表达;PAPA对树突状细胞共刺激分子CD40的表达无统计学意义。结论:1.ConA使小鼠脾脏细胞以CD4T细胞浸润为主,B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞的表达有升高的趋势,且使树突状细胞的共刺激分子(CD80、CD86)表达上调。2.雷帕霉素可以减缓Con A诱导的急性肝损伤,主要通过影响T细胞和DC来发挥免疫抑制的作用,为自身免疫性肝炎的治疗提供了理论依据。二.雷帕霉素对自身免疫性肝炎肝纤维化的防治作用目的:通过定量多次尾静脉注射ConA建立小鼠自身免疫性肝炎肝纤维化模型,检测肝脏淋巴细胞表型及CD4~+T细胞的亚型Th1,Th2,Th3,Tr1细胞的变化情况,从而探讨雷帕霉素对其防治作用。方法:1.建立自身免疫性肝炎肝纤维化模型:8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为对照组、Con A造模组、Con A造模~+雷帕霉素(rapamycin,RAPA)治疗组。正常对照组每周一次尾静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS),模型组和治疗组每周一次尾静脉注射Con A,叁组均连续注射5周。2.评价雷帕霉素的治疗效果:检测各组小鼠血清生化水平;肝脏组织行HE和Masson染色,并行评价肝脏组织炎症及纤维化程度。3.梯度离心法分离肝脏单个核细胞,流式细胞术检测CD4~+T、CD8~+T细胞的比例,并检测免疫细胞内干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素10(IL-10)、转化生长因子β(TGF-β)的表达情况。结果:1.Con A连续注射第5周时开始出现肝纤维化。雷帕霉素治疗组与Con A造模组小鼠相比,血清ALT水平显着降低(p<0.05);肝脏组织炎症损伤明显减轻,并无明显纤维组织增生;2.雷帕霉素治疗组与Con A造模组小鼠相比肝脏单个核细胞内TGF-β的表达显著降低(p<0.05);肝脏CD4~+T和CD8~+T细胞的比例均下调(p<0.05);Th1细胞的比例降低(p<0.05),Th3、Tr1调节性T细胞的比例显着上调(p<0.05),但Th2细胞的差异无统计学意义(p>0.05)。结论:雷帕霉素可以减缓Con A诱导的慢性肝炎肝纤维化的炎症程度,与促进肝脏Th3/Tr1细胞的分化,减少肝脏单个核细胞TGF-β的表达有关。三.雷帕霉素通过诱导免疫耐受性树突状细胞的形成减缓自身免疫性肝炎目的:观察雷帕霉素对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的共刺激分子及趋化受体的表达、细胞因子、运动速度、特异性免疫反应及诱导Treg的能力的影响,探讨耐受性树突状细胞在自身免疫性肝炎中的作用机制,同时也为治疗及预防自身免疫性肝病提供新的思路。方法:1.免疫磁珠分选CD11C阳性的树突状细胞,雷帕霉素刺激后流式检测共刺激分子及趋化受体表达况,并利用活细胞工作站观察其动态运动情况。利用Elisa检测上清中细胞因子IL-12,IL-6的表达情况。2.体外诱导实验:将分选的DC与CFSE标记的OT-I,OT-Ⅱ,CD4~+CD25-的T细胞分别共培养,流式细胞仪检测其诱导分化及增殖能力。结果:1.雷帕霉素刺激后的树突状细胞低表达共刺激分子(CD80、CD86)、抑制促炎因子的表达(IL-6、IL-12),符合耐受性树突状细胞的特征。促进DC趋化受体CCR7的表达,并促进其运动速度。2.雷帕霉素抑制特异性反应中CD4~+T和CD8~+T细胞的增殖,并可以诱导CD4~+CD25-的T细胞分化为CD4~+CD25~+的Treg。结论:1.雷帕霉素刺激后的树突状细胞表现为耐受性树突状细胞的特征,同时促进DC趋化受体的表达,并促进其运动速度。2.雷帕霉素降低自身免疫性肝炎的病理损害与抑制CD4~+T、CD8~+T细胞的增殖和诱导CD4~+CD25-的T细胞分化为Treg有着紧密联系。
马小娟[3]2009年在《加减菌陈五苓散对实验性肝损伤的保护作用及其作用机理研究》文中研究指明1.研究目的本课题根据祖国医学理论,基于历代医家对病毒性肝炎的认识及国内外现有的研究基础,以D-氨基半乳糖(D-GaIN)所致的大鼠化学性肝损伤模型和卡介苗(BCG)+脂多糖(LPS)所致免疫性肝损伤小鼠模型为研究对象,观察加减茵陈五苓散对实验性肝损伤的保护作用,并初步探讨该方防治肝损伤的作用机理,从而为加减茵陈五苓散治疗病毒性肝炎提供实验依据,也为该方的进一步的研究打下基础。2.方法2.1加减茵陈五苓散对D-氨基半乳糖所致大鼠化学性肝损伤的保护作用。将60只SD大鼠随机分为正常对照组,模型组,五酯片阳性对照组,加减茵陈五苓散高、中、低剂量组,连续灌胃给药7天。除正常对照组外,其余大鼠均于给药第7天一次性腹腔注射D-GaIN400mg/kg。正常对照组给予同剂量的生理盐水腹腔注射。于造模24h后采血、取肝组织,测定血清谷丙转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)的活性、血清总胆红素含量及血清NO的含量,肝组织MDA的含量、GSH-Px酶的活性;制备肝组织切片,观察各组肝脏组织病理变化情况。2.2加减茵陈五苓散对卡介苗+脂多糖诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用。将90只NIH小鼠,随机分为正常对照组,BCG/LPS模型组,五酯片阳性对照组,加减茵陈五苓散高、中、低剂量组。模型组、阳性对照组与加减茵陈五苓散高、中、低剂量组。各组小鼠于实验1d每只尾静脉注射BCG悬液约2.96×10~7个活菌0.2ml,从造模之日起治疗组和阳性对照组开始用药,连续给药12d后,除空白组以生理盐水0.2ml/20g尾静脉注射外,其他各组以LPS7μg/20g尾静脉注射。于静脉注射10h后取血,测定血清谷丙转氨酶(ALT)和天门冬氨酸转氨酶(AST)的活性、血清NO的含量及TNF-a的含量;无菌摘取肝脏和脾脏称重,计算脏器系数;采用MTT比色法测定T、B淋巴细胞增殖能力;测定组织中的MDA含量和SOD的活性;制备肝组织切片,光镜下观察各组肝脏组织病理变化情况。2.3观察加减茵陈五苓散对免疫功能的影响NIH小鼠60只,随机分为空白对照组、模型对照组、加减茵陈五苓散高、中、低剂量组;连续给药8天,模型组与治疗各组小鼠于首次给药后20min均腹腔注射氢化可的松5mg/kg×3d,空白组腹腔注射生理盐水0.2ml/20g。于末次给药后15min由尾静脉注入25%中华墨汁0.1ml/10g,分别于注射2min,20min后用肝素处理过的20定量毛细管经眶后静脉丛取血20μl,溶于2ml0.1%Na2CO3溶液,摇匀。脱臼处死动物,并摘取脾和胸腺称重。比色法测定注射中华墨汁后2min和20 min的光密度值,计算廓清指数K和吞噬指数a,以测定小鼠网状内皮系统吞噬功能;计算胸腺指数和脾指数;3.结果3.1加减茵陈五苓散抗D-GaIN大鼠化学性肝损伤的研究结果:中、高剂量的加减茵陈五苓散能够显着降低D-GaIN肝损伤大鼠血清中增高的转氨酶活性以及总胆红素水平,明显减轻D-GaIN导致的肝组织病理损伤程度,其中以高剂量药物疗效最为明显;并发现加减茵陈五苓散可显着降低肝匀浆中升高的MDA水平,提高肝匀浆GSH-Px酶的活性,显着降低血清中升高的NO含量。3.2加减茵陈五苓散抗BCG/LPS诱导小鼠免疫性肝损伤的研究结果:加减茵陈五苓散中、高剂量能显着降低BCB/LPS免疫性肝损伤小鼠血清中升高的ALT、AST水平;且加减茵陈五苓散中剂量降酶作用优于阳性对照药物;对肝脾重量的增大有显着的抑制作用;组织病理检查结果显示加减茵陈五苓散可减轻BCB/LPS导致的肝组织坏死范围及程度,减少炎细胞浸润,有明显的保肝作用,其中以中剂量组药物疗效最佳。同时发现中剂量药物可显着降低肝匀浆中升高的MDA水平,提高肝匀浆SOD水平,显着降低血清中升高的NO含量和TNF-a含量,对BCG/LPS所致肝损伤小鼠脾T、B淋巴细胞增殖能力有明显的抑制作用。3.3加减茵陈五苓散对非特异性免疫功能影响的观察结果:加减茵陈五苓散中剂量可提高免疫功能低下小鼠巨噬细胞的吞噬功能,并能明显加快受抑制动物免疫器官的恢复和生长。4.结论加减茵陈五苓散对D-GaIN所致的大鼠化学性肝损伤和BCB/LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤均具有显着的保护作用,主要表现在降低肝损伤动物血清转氨酶、胆红素的增高,保护肝脏组织及细胞等方面的作用。从对肝损伤动物肝组织MDA水平、GSH-Px酶活性、SOD活性,血清TNF-a含量、NO含量以及脾T、B淋巴细胞增殖能力的检测结果分析,抗自由基损伤、增强自由基清除酶活性、减少致炎介质的产生、促进肝细胞再生、调节机体免疫功能为本方抗实验性肝损伤的综合机理。另外,从加减茵陈五苓散对免疫功能影响的实验结果显示本方可明显提高巨噬细胞吞噬功能,增强机体的非特异性免疫功能。从而又证实本复方具有双向免疫调节作用,其保护肝细胞、抗肝损伤作用与调节机体免疫功能密切相关。
冯璇[4]2010年在《复方归芪颗粒治疗肝纤维化的实验研究》文中研究表明目的：研究中药复方归芪颗粒治疗大鼠肝纤维化的药效学作用及作用机理。内容与方法：1.不同制备工艺的药效学筛选：采用四氯化碳(CCl4)致大鼠肝纤维化模型进行复方归芪颗粒不同制备工艺优化的药效学筛选。灌胃给予雄性大鼠15%CCl4食用油溶液每1kg体重10mL,2次/周,连续10周,建立大鼠肝纤维化模型。模型大鼠随机分为模型对照组、阳性药对照组及归芪颗粒样品1、2和3组,另设正常大鼠对照组,第9周起按相同的剂量(22.4g/kg)灌胃给予不同工艺制备的归芪颗粒样品进行治疗,连续8周,阳性对照组灌胃给予扶正化瘀胶囊0.825g/kg,正常及模型对照组灌胃等容积的消毒饮用水。末次给药次日取血,观察各组大鼠血清学指标(ALT、AST、HA、PⅢNP)及肝组织中羟脯氨酸(Hyp)的变化,并解剖大鼠取肝脏做病理组织学检查,观察肝脏纤维化程度。2.复方归芪颗粒对CCl4致肝纤维化模型大鼠的治疗作用：灌胃给予雄性大鼠15%CCl4食用油溶液10mL/kg,2次/周,连续16周,建立大鼠肝纤维化模型。模型大鼠随机分为模型对照组、阳性药对照组及归芪颗粒高、中、低剂量组,另设正常大鼠对照组,第9周起按22.4、11.2和5.6g/kg的剂量灌胃给予归芪颗粒进行治疗,连续8周,阳性对照组灌胃给予扶正化瘀胶囊0.825g/kg,正常及模型对照组灌胃给予等容积的消毒饮用水。末次给药的次日取血,检测各组大鼠血清学指标(ALT、AST、T-BIL、ALP、TP、ALB、GLB、HA、CⅣ和PⅢNP)及肝组织中Hyp的含量,并解剖大鼠取肝脏做病理组织学检查,观察肝脏纤维化等病理学改变,并采用免疫组织化学的方法观察用药后肝组织中TGF-β1表达的变化情况。3.复方归芪颗粒对猪血清致大鼠肝纤维化模型的治疗作用：腹腔注射给予大鼠猪血清0.5mL/只,2次/周,连续16周,建立大鼠肝纤维化模型。模型大鼠随机分为模型对照组、阳性药对照组及归芪颗粒高、中、低剂量组,另设正常大鼠对照组,第9周起按22.4、11.2和5.6g/kg的剂量灌胃给予归芪颗粒进行治疗,连续8周,阳性对照组灌胃给予扶正化瘀胶囊0.825g/kg,正常及模型对照组灌胃等容积的消毒饮用水。末次给药的次日取血,观察各组大鼠血清学指标(ALT、AST、T-BIL、ALP、TP、ALB、GLB、HA、CIV和PIIINP)的改变及肝组织中Hyp的变化,并解剖大鼠取肝脏做病理组织学检查,观察肝脏纤维化程度。4.利胆试验：麻醉大鼠行胆汁引流术,观察归芪颗粒对正常大鼠的胆汁分泌量及胆汁中总胆红素(T-BIL)含量的影响情况。结果：1.归芪颗粒样品1能显着降低血清中AST、ALT、HA、PⅢNP及肝组织中Hyp的水平,明显减轻肝脏细胞的病理损伤,其药效作用优于样品2和样品3。2.复方归芪颗粒能明显降低化学性肝损伤大鼠血清中AST、ALP、HA、CⅣ、T-BIL、PⅢNP及肝组织中Hyp的水平,明显减轻肝脏细胞的病理损伤。归芪颗粒也能在一定程度上减少模型大鼠肝组织中TGF-β1的含量。3.复方归芪颗粒能明显降低免疫性肝损伤大鼠血清中AST、ALP、HA及肝组织中Hyp的水平,明显减轻肝脏细胞的病理损伤。4.复方归芪颗粒有促进胆汁分泌和排泄的作用,能有效增加正常大鼠胆汁中总胆红素的含量,有较强的疏肝利胆解毒作用。结论：复方归芪颗粒具有治疗肝纤维化,保肝利胆的药效学作用,其作用机理可能与减少肝组织中TGF-β1的含量相关。
马洪第[5]2013年在《Toll样受体和趋化因子受体在原发性胆汁性肝硬化中致病机制的研究》文中指出原发性胆汁性肝硬化是一种由于免疫系统对自身肝脏进行攻击而引起的慢性胆汁淤积性肝脏自身免疫性疾病,高发于中年女性。患者发病后会导致胆管阻塞和胆汁淤积,造成特异性的胆管上皮细胞损伤,从而引发肝脏的纤维化,最后演变为肝硬化和肝功能衰竭,严重威胁患者的生命。由于获取早期发病的临床肝脏样本十分困难,因此对原发性胆汁性肝硬化发病机制的探索及治疗靶点的开发均主要以该疾病的动物模型-dnTGF-β RⅡ小鼠作为研究工具。该模型很好地模拟了人类原发性胆汁性肝硬化的主要表型特征：自发产生抗线粒体的自身抗体；血清中炎性细胞因子水平升高；病理组织学检查可发现伴随肝内胆管的破坏,肝脏汇管区有大量的CD4T细胞、CD8T细胞等淋巴细胞的浸润；此外dnTGF-β小鼠还有自发的结肠炎,也可以作为研究肝脏炎症和肠道微环境相互作用的模型。虽然以往的工作利用dnTGF-β RⅡ小鼠这一疾病模型对于该自身免疫性肝病发病早期的一些免疫学致病机制进行了初步探究,包括CD8T细胞的致病性,细胞因子和调节性B细胞对疾病进程的影响等；但是对该疾病的致病机制仍未有全面的了解,还有很多未知的领域,包括天然免疫在该疾病中所发挥的作用以及趋化因子及其配体在介导该疾病炎性浸润中的机制等均未有明确的报道。因此,本研究以dnTGF-β RⅡ小鼠以及Toll样受体缺失或者趋化因子受体缺失的dnTGF-β RⅡ小鼠为研究原发性胆汁性肝硬化的动物模型,利用细胞免疫学、分子生物学以及医学病理学的实验方法方法对该疾病致病过程中天然免疫受体Toll样受体以及趋化因子受体CXCR3发挥作用的机制进行深入探讨,为阐明原发性胆汁性肝硬化的致病机制以及开发该疾病有效的治疗靶点提供证据支持。本研究得到的实验结果如下：1.环境因素的改变(肠道菌群清除)影响了原发性胆汁性肝硬化小鼠模型的发病程度我们用含有甲硝锉,氨苄青霉素,新霉素以及万古霉素这四种抗生素的水从4周龄起饲养SPF级的dnTGF-β RⅡ (TG)小鼠以清除肠道中绝大多数的共生菌。在抗生素喂养12周,即小鼠15周龄时杀鼠,对其肝脏的病理学分析发现与非抗生素水喂养的对照组相比,抗生素喂养加重了TG小鼠的胆管炎,表现为肝脏炎性浸润的增多以及胆管破坏的加重。2. Toll样受体2缺失加重了dnTGF-β RⅡ小鼠自发的胆管炎及结肠炎与野生型(WT)小鼠相比,tlr2在dnTGF-β RⅡ (TG)小鼠中有较高的表达,因此我们将TG小鼠与Toll样受体2(TLR2)敲除小鼠进行杂交,得到TLR2-/-dnTGF-β RⅡ (TGT2)小鼠。首先,对其肝脏的病理学分析发现,与TG小鼠相比,TGT2小鼠肝脏汇管区的炎性浸润及肝内胆管的破坏有明显的加重。细胞学分析的结果显示与TG小鼠相比,TGT2小鼠肝脏中T细胞尤其是CD4T细胞的浸润增加了,并且这些浸润的CD4T和CD8T中呈现效应性记忆性表型(CD44highCD62Llow)的细胞明显增多。其次,肠道病理学的分析发现TLR2敲除加重了TG小鼠的自发结肠炎。与TG小鼠相比TGT2小鼠不仅体重明显下降,结肠重量显着上升,而且结肠中的炎性浸润已经扩展到整个粘膜的厚度,腺体和杯状细胞受到严重破坏,并伴随有隐窝囊肿的存在。再次,对细胞因子的检测结果表明,与TG小鼠相比,TGT2小鼠血清中TNF-α和IFN-γ的浓度明显升高,并且在TGT2小鼠的肝脏中il6的基因表达显着增加。对于肝脏中IL-6相关的信号通路的检测发现与TG小鼠相比,TGT2小鼠肝脏中STAT3磷酸化的水平明显升高。最后,为了从相反的方向证明TLR2在TG小鼠发病过程中的作用,我们计划用TLR2的特异性配体Pam3CSK4来对TG小鼠进行高剂量单次注射和低剂量连续注射的处理,从而更加全面地阐明TLR2在TG小鼠发病中的作用机制。3. Toll样受体4缺失有加重dnTGF-β RⅡ小鼠肝脏炎症及肠道炎症的趋势与WT小鼠相比,tlr4在TG小鼠中的表达升高,因此我们对杂交所得到的TLR4-/-dnTGF-β RⅡ (TGT4)小鼠进行了一系列的细胞免疫学和医学病理学的分析。结果发现：与TG小鼠相比TGT4小鼠肝脏中浸润的T淋巴细胞的比例有所增加；并且CD8T细胞在总的T细胞中所占的比例有明显的上升；其肝脏中浸润的效应性记忆CD8T细胞(CD8Tem)无论在CD8T细胞中所占的比例还是其绝对数都有明显的增加。虽然TLR4敲除对于dnTGF-β RⅡ小鼠结肠炎症的影响没有统计学上的显着性差异,但是无论是通过病理切片的观察还是统计数据的分析,我们都可以发现TGT4小鼠与TG小鼠相比结肠炎有加重的趋势。4. CXCR3在dnTGF-β RⅡ小鼠致病过程中作用的初步探讨首先,我们发现与WT小鼠相比TG小鼠肝脏中趋化因子CXCL9和CXCL10的浓度有明显上升。然后,流式分析的结果显示在TG小鼠肝脏中表达这两种趋化因子的受体CXCR3的T细胞比WT明显增多。接下来,来自TG小鼠或者敲除了CXCR3的TG小鼠中的T细胞的过继转输实验将为证明CXCR3介导T细胞向TG小鼠肝脏迁移提供更加有力的证据。综上所述,本研究证明了TLR2缺失可以加重原发性胆汁性肝硬化小鼠模型中的胆管炎以及自发性结肠炎。并且发现CXCR3可能介导了该小鼠模型中T细胞向肝脏炎性部位的迁移。我们的研究首次证明了在该疾病模型中天然免疫受体TLR2的敲除促进了肝脏和肠道的炎症。并且首次在该疾病模型中探讨肠道微环境与肝脏炎症之间的关系,这为阐明原发性胆汁性肝硬化的致病机制以及寻找该疾病有效的治疗靶点提供了理论依据。
谈婉月[6]2016年在《金线莲苷治疗自身免疫性肝炎的作用和分子机制研究》文中指出目的:探讨Con A诱导小鼠自身免疫性肝炎模型中金线莲苷对AIH的治疗作用及作用机制。方法:(1)建立ConA诱导的小鼠自身免疫性肝炎模型,42只雄性C57BL/6J小鼠随机分为7组:正常组,Con A模型组,水飞蓟素阳性药组(Silymarin50mg/kg),金线莲苷高剂量组(KD 30mg/kg),金线莲苷中剂量组(KD 20mg/kg),金线莲苷低剂量组(10 mg/kg),阴性对照组(KD 30mg/kg),每组6只。每组小鼠连续口服给药3 d,模型小鼠第3 d尾静脉注射Con A,剂量为20 mg/kg。造模后12 h处死小鼠,检测小鼠血清肝功能指标(AST和ALT)和血生化指标(SOD、MDA、NO、IL-12、IFN-γ)的水平;苏木精伊红染色(HE)切片观察肝脏组织病理变化;细胞流式测定脾脏和肝脏中CD8+T细胞、Treg细胞以及骨髓DC细胞的表型,综合评价金线莲苷的保肝效果和免疫调控功能。(2)半体外和体外细胞实验。分离培养小鼠原代脾淋巴细胞,分别给予KD 10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml,检测KD对T细胞增殖的影响。分离培养小鼠原代骨髓来源的DC细胞,分别给予KD 10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml,并加GM-CSF刺激,检测KD对DCs功能的影响。培养RAW264.7细胞、HSC-T6细胞,检测KD对巨噬细胞RAW264.7、肝星状细胞HSC-T6增殖的影响,初步研究KD的抗炎及抗纤维化作用。(3)应用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应和蛋白印迹试验检测JAK2/STAT3/SOCS3信号通路在Con A诱导小鼠自身免疫性肝炎中的作用以及对KD治疗作用的介导。结果:(1)ConA诱导小鼠自身免疫性肝炎模型实验发现,KD高、中、低剂量均可显着的降低血清转氨酶(P<0.01),ELISA测定血清中SOD、MDA、NO、IL-12、IFN-γ含量时发现,KD高、中、低剂量均可显着的升高SOD的浓度和降低MDA、NO、IL-12、IFN-γ的浓度。肝脏HE切片显示,KD能减少炎症细胞的浸润,改善肝脏损伤。KD抑制DCs的吞噬能力和抗原提呈能力,抑制T淋巴细胞增殖,降低CD8+T细胞分化和杀伤功能,上调Tregs的表达来发挥免疫耐受作用。(2)半体外和体外细胞实验结果显示,KD各剂量组均能降低T淋巴细的增殖,并能抑制DC细胞的成熟,对RAW264.7细胞、HSC-T6细胞的增殖也有明显的抑制作用。(3)q PCR、Western blot结果表明,KD抑制JAK2/STAT3的表达和磷酸化,上调负调控因子SOCS3的表达。结论:(1)KD对Con A诱导小鼠免疫性肝炎具的治疗作用效果显着,可明显改善肝功能,上调SOD、下调MDA,降低氧化应激反应;降低NO、IL-12、IFN-γ的表达水平,减轻肝脏炎症反应。(2)KD可抑制T细胞增殖和DCs成熟而降低肝脏部位的免疫反应,此外,KD对RAW264.7细胞、HSC-T6细胞的增殖的均有一定的抑制作用,提示KD具有抗炎和抗纤维化作用。(3)KD是通过下调肝脏和脾脏中JAK2/STAT3/SOCS3信号通路发挥免疫抑制作用。
张舰琼[7]2017年在《慢性HBV感染合并NAFLD炎症病理特征及无创临床模型研究》文中认为目的:通过观察慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染合并非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)患者病理特征判别肝脏炎症原因,比较它们之间的临床特点,分析与其炎症相关的指标,进而探讨是否存在一种无创的方法比如公式识别这些炎症原因,从而建立慢性HBV感染合并NAFLD炎症无创临床诊断模型。方法:收集2014年01月至2016年12月就诊于天津市第二人民医院的慢性HBV感染合并NAFLD的患者,观察这些患者肝脏病理特征,分析炎症引起原因,根据病理特征的不同,分为HBV炎症组(HBV感染合并NAFLD患者有HBV感染相关炎症活动)和非HBV炎症组(HBV感染合并NAFLD患者无HBV感染相关炎症活动),单因素分析比较这两组患者一般特征和临床资料[包括肝肾功能、血脂、血糖、尿酸、胰岛素、乙肝五项、HBV-DNA、甲状腺功能、铁四项、免疫功能、血常规、B超、受控衰减参数(Controlled Attenuation Parameter,CAP)、FibroScan]等差异,纳入具有临床差异性的指标进行二元logistic回归分析肝脏炎症活动相关性指标,得出回归公式,评价及验证其准确性。结果:1.HBV炎症组的病理表现为:汇管区扩大,单个核为主的炎细胞浸润,或淋巴细胞集结浸润,有界面性炎症。非HBV炎症组病理表现为:无明显汇管区扩大及汇管区内炎细胞浸润,无界面性炎症。2.HBV炎症组平均年龄(41.8±9.9岁)高于非HBV炎症组平均年龄(36.42±10.49岁),差异有统计学意义(P<0.05)。两组患者性别、体重指数(Body Mass Index,BMI)均无差别(P均>0.05)。HBV炎症组炎症较非HBV炎症组的炎症及纤维化程度重,但肝脂肪变程度较非HBV炎症组轻,差异有统计学意义(P均<0.05)。3.HBV炎症组ALT、AST、GGT、ALP均高于非HBV炎症组,差异有统计学意义(P均<0.05)。HBV炎症组TP、ALB、UA均低于非HBV炎症组,差异有统计学意义(P均<0.05)。两组的TBIL、BUN、CRE、TG、CHO、HDL、LDL差异无统计学意义(P均>0.05)。4.两组HBsAg、HBeAg、HBe Ag阳性率、TT3、TT4、FT3、FT4、TSH、TGAB及胰岛素差异均无统计学意义(P均>0.05)。HBV炎症组的HBV-DNA载量高于非HBV炎症组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.HBV炎症组补体C3水平低于非HBV炎症组,差异具有统计学意义(P<0.05);两组补体C4、IgG、IgA、IgM、TFR、Fe、FER、TIBC、UIBC均无差别(P均>0.05)。6.HBV炎症组WBC、NEUT、PLT均低于非HBV炎症组,差异有统计学意义(P均<0.05),MPV、MCV均高于非活动性HBV组,差异有统计学意义(P均<0.05)。两组LYMPH、RBC、HGB、HCT差异均无统计学意义(P均>0.05)。7.HBV炎症组CAP值低于非HBV炎症组,肝硬度值高于非HBV炎症组,差异有统计学意义(P均<0.05)。8.逐步logistic回归分析后,年龄、CAP、E、ALT等四个因子差异有统计学意义(P均<0.05),所得的回归方程为Y=0.106×年龄-0.033×CAP+0.48×E+0.048×ALT-0.86,预测的整体正确率为83.1%。此公式相应的AUC=0.922,P<0.001,cut-off值为0.534,灵敏度为80%,特异度为90.91%,阳性预测值为93.6%,阴性预测值为73.2%。9.公式Y=0.106×年龄-0.033×CAP+0.48×E+0.048×ALT-0.86在验证组正确率为63.64%,但所有的用公式诊断为活动性HBV组的(Y>0.534)与病理结果诊断一致,符合率100%。结论:1.HBV感染合并NAFLD患者有HBV感染相关炎症活动(HBV炎症组)的特征为:血清学HBV标记物阳性,同时肝组织免疫组化HBs Ag、HBcAg、PreS1Ag至少一项阳性;肝组织脂肪变性符合NAFLD形态学特征;肝组织汇管区扩大,单个核为主的炎细胞浸润,或淋巴细胞集结浸润,至少有轻度的界面性炎症。2.HBV感染合并NAFLD患者无HBV感染相关炎症活动(非HBV炎症组)的特征为:血清学HBV标记物阳性,同时肝组织免疫组化HBsAg、HBcAg、PreS1Ag至少一项阳性;肝组织脂肪变性符合NAFLD形态学特征;肝脏组织汇管区扩大及汇管区内炎细胞浸润均不明显,无界面炎症;除外:a.明确的中央静脉周围炎,伴或不伴中央静脉周围网状支架塌陷b.肝窦内kuffer细胞腊样质沉积。慢性HBV感染合并NAFLD患者的肝脏炎症大部分是由HBV感染引起的。3.HBV炎症组较非HBV炎症组患者的肝脏炎症及纤维化比较明显。且这些患者年龄大,临床上常常ALT、AST、GGT、ALP、HBV-DNA水平升高,且FibroScan值大,CAP值小,血常规可出现WBC、NEUT、PLT等下降、MPV升高,这些简单的临床指标为HBV感染合并NAFLD患者炎症原因判别有一定预示意义。4.可以参考公式Y=0.106×年龄-0.033×CAP+0.48×E+0.048×ALT-0.86初筛,若Y值>0.534,考虑肝脏炎症与HBV感染炎症有关,需高度重视HBV的问题,必要时行抗病毒治疗。当然,此公式的实用性有待进一步验证。
黄秀曼[8]2013年在《肝正修复茶肝损伤保护作用的研究及机制探讨》文中进行了进一步梳理肝脏疾病是影响人类身体健康的最主要的疾病之一，然而目前对肝脏损伤暂无治疗效果较明显的药物，肝正修复茶是在河南用于保肝治疗的一种民间组方。本研究的目的是探讨肝正修复茶水煮液、酒浸液的肝损伤保护作用及其可能的作用机制。本课题采用MTT法检测了肝正修复茶水煮液、酒浸液体外对正常小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及对H_2O_2损伤的LO_2人肝细胞增殖抑制率的影响；采用扑热息痛（AP）致小鼠急性肝损伤模型、酒精（ETOH）致小鼠急性肝炎模型、地塞米松联合酒精（DXM+ETOH）致小鼠急性脂肪性肝炎模型、刀豆蛋白（ConA）致小鼠急性免疫性肝损伤模型、CCl_4致小鼠急性肝损伤及CCl_4致小鼠慢性肝损伤（肝纤维化）模型，评价了肝正修复茶水煮液、酒浸液给药后对各种不同因素引起的肝损伤的保护作用；采用DXM+ETOH致小鼠急性脂肪性肝炎模型、CCl_4致小鼠急性肝损伤及CCl_4致小鼠慢性肝损伤（肝纤维化）模型，检测血清和肝组织中抗氧化酶活性(如过氧化氢酶和超氧化物歧化酶)、TGF-β1和MDA含量，探讨了肝正修复茶肝损伤保护作用的机制。另外，本文测定了肝正修复茶水煮液，酒浸液中总黄酮类化合物的含量及其对DPPH氧自由基的体外清除能力，并与Vc做了比较。体外试验显示：不同浓度的肝正修复茶水煮液与酒浸液对体外培养的小鼠脾脏淋巴细胞的增殖无明显影响，但对H_2O_2致LO_2人肝细胞的损伤有一定的保护作用，可明显降低H_2O_2对LO_2细胞增殖的抑制率，其中0.125%的肝正修复茶水煮液和酒浸液可分别使H_2O_2对LO_2细胞增殖的抑制率从70%下降到37%、28%。体内实验显示：肝正修复茶水煮液和酒浸液可明显降低扑热息痛致急性肝损伤小鼠的肝脏指数（%）及血清中ALT、AST、TG、TC的水平，升高小鼠血清和肝组织中白蛋白和总蛋白的含量，明显改善扑热息痛引起的小鼠肝索排列紊乱、大片坏死等病理损伤。肝正修复茶水煮液可明显降低ETOH致急性肝损伤小鼠的肝脏指数及血清中ALT、AST的水平，明显改善酒精引起的肝组织细胞排列紊乱和炎性浸润的现象。肝正修复茶水煮液、酒浸液可明显降低DXM+ETOH致急性脂肪肝小鼠的肝脏指数及血清中ALT、AST、TG、TC的水平，升高血清和肝组织中白蛋白和总蛋白的含量，明显改善急性脂肪性肝炎小鼠肝细胞的脂肪性病变。肝正修复茶可明显降低ConA致急性免疫性肝损伤小鼠的肝脏指数及血清中ALT、AST的水平，明显改善ConA引起的肝脏细胞炎性浸润现象。肝正修复茶可明显降低CCl_4致急性肝损伤小鼠的肝脏指数及血清中ALT、AST、TG、TC的水平，升高小鼠血清和肝组织中白蛋白和总蛋白的含量，明显改善CCl_4引起的急性肝损伤小鼠肝小叶结构紊乱，肝细胞肿胀，片状变性坏死及炎症浸润等病理变化。肝正修复茶可明显降低CCl_4致慢性肝纤维化小鼠的肝脏指数及血清中ALT、AST、胶原Ⅰ、胶原Ⅱ、胶原Ⅲ、bFGF、TIMP-1及LN的水平，升高小鼠血清和肝组织中白蛋白和总蛋白的含量，明显改善其肝细胞粗糙肿大及炎性细胞浸润等病理变化（HE染色），并减少肝纤维化小鼠肝组织中纤维素的沉积（Masson染色）。以芦丁为标准品测定肝正修复茶水煮液、酒浸液中的总黄酮，含量分别为1.89mg/ml、3.35mg/ml。体外DPPH自由基清除实验显示，肝正修复茶酒浸液对DPPH自由基的最大清除效能（Emax，86.7%）大于肝正修复茶水煮液（Emax，80.2%）但低于维生素C（Emax，95.1%）。肝正修复茶水煮液和酒浸液均能明显升高CCl_4致急性和慢性肝损伤小鼠、DXM+ETOH致急性脂肪性肝炎小鼠血清和肝组织中T-SOD、CAT、GST、GSH-PX、GSH的水平，抑制小鼠肝脏脂质过氧化产物MDA的生成，且能明显降低CCl_4致慢性肝纤维化小鼠血清中TGF-β1的水平。综上所述，肝正修复茶水煮液与肝正修复茶酒浸液对正常小鼠免疫功能的影响不明显，对扑热息痛、酒精、ConA、CCl_4致小鼠急性肝损伤及CCl_4致小鼠慢性肝纤维化、DXM+ETOH致小鼠急性脂肪性肝炎均有一定的保护作用。肝正修复茶水煮液与肝正修复茶酒浸液均含有较高水平的黄酮类成分，有清除自由基、抗氧化作用，其肝功能保护作用可能与增强机体抗氧化防御系统的功能及阻止TGF-β1的信号转导有关，也说明肝正修复茶有明确的多层次的肝损伤保护作用。
史旭华[9]2006年在《原发性胆汁性肝硬化的临床与基础研究及对治疗的反应》文中研究表明第一部分药物治疗原发性胆汁性肝硬化的临床疗效观察目的前瞻性研究熊去氧胆酸(UDCA)、UDC联合泼尼松龙、UDCA联合硫唑嘌呤(Azp)叁种治疗方案对原发性胆汁性肝硬化(PBC)的疗效并评价影响疗效的危险因素。材料与方法82例初诊PBC患者随机分为UDCA(U组，28人)、UDCA联合泼尼松龙(UP组，27人)、UDCA联合Azp(UA组，27人)叁个治疗组，在治疗第0、3、6、12月采集详细的临床及实验室资料。记录肝硬化失代偿、死亡、肝移植等事件以及药物副作用。入选标准符合2000年美国肝脏病协会制定的PBC诊疗指南；排除标准为合并其他肝病，年龄＞70岁，肝功失代偿(Child分级B／C)，预计存活期不超过1年，合并其他自身免疫病。药物剂量为UDCA 13-15mg·d-1·kg-1；泼尼松龙起始剂量0.5mg·d-1·kg-1，4周开始减量，减至7.5mg·d-1时维持；Azp 1mg·d-1·kg-1。疾病进展规定为：观察期内肝硬化失代偿、肝移植或肝脏相关的死亡、胆红素升高到原水平两倍以上。生化缓解定义为：治疗后总胆红素(TBIL)正常同时碱性磷酸酶(ALP)和谷氨酰转肽酶(GGT)水平降至正常值高限1.5倍以下。结果UP组患者乏力和瘙痒程度改善(分别为P=0.015和P=0.037)，U组、UA组症状无改善。叁组患者谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、ALP、GGT、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、IgM均下降，组内效应分别为P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.009、0.001、0.000，在3个月内下降最明显；叁种治疗方案相比无差异。疾病进展分别为U组中2人，UP组3人(其中1人因食道静脉曲张破裂大出血死亡)，UA组1人。发生疾病进展的患者Mayo危险性评分(MRS)(4.4±0.15 vs 5.7±0.55，P=0.018)高、凝血酶原时间(PT)(11.6±0.12 vs 12.4±0.32，P=0.042)延长。U组未出现药物副作用；UP组血糖升高2例、满月脸5例、多毛1例；UA组白细胞下降2例，胆绞痛1例(UDCA相关)。基线ALP、GGT、总胆固醇(CHO)水平是生化缓解的危险因素(β=-2.095，P=0.015，Exp(β)=0.123，95％CI 0.023-0.663)，DBIL、TBIL、总胆汁酸(TBA)、PT也不利于生化缓解(β=-1.162，P=0.075，Exp(B)=0.313，95％CI 0.083-1.124)；联合泼尼松龙(β=-0.747，P=0.350，Exp(B)=0.474，95％CI 0.099-2.266)或Azp(β=-1.479，P=0.223，Exp(B)=0.228，95％CI 0.021-2.453)不能使生化缓解率提高。结论叁种方案对PBC患者的肝脏生化指标、IgM的改善作用相同，UP方案可减轻乏力瘙痒症状：生化缓解多发生在治疗3月内，高水平的基线ALP、GGT、CHO是生化缓解的危险因素，高水平的TBIL、DBIL、TBA、PT不利于生化缓解，两种联合治疗方案不增加生化缓解率。MRS高、PT延长的患者易疾病进展。U方案副作用发生率低。第二部分原发性胆汁性肝硬化外周血淋巴亚群、细胞因子特点及药物治疗后的变化目的原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血淋巴细胞亚群及细胞因子的特点及其对治疗的反应。材料与方法全部病例来自论文第一部分熊去氧胆酸(UDCA)(U组)、UDCA联合泼尼松龙(UP组)、UDCA联合硫哗嘌呤(Azp)(UA组)治疗PBC的前瞻性、随机、对照研究中的82例PBC患者。参加者在治疗前和治疗3、6月时检测外周血淋巴细胞亚群(溶血法)和细胞因子(酶联免疫吸附分析，ELISA)水平。设未治疗的慢性乙型肝炎患者(CHB)29例和干燥综合征(PSS)21例，健康对照组(HS)20例与药物治疗前PBC患者相应的指标对比。结果与PSS患者相比，PBC患者B细胞比例低(P=0.010)、CD4+T细胞比例升高(P=0.003)、记忆细胞(CD4+CD45RO+)增多(P=0.051)、IFN-γ、TNF-α、IL-2均升高(分别为P=0.004、P=0.003、P=0.000)。与健康对照者比，PBC患者B细胞比例升高(P=0.366)但未达到统计学意义上的差异，CD4+T细胞比例升高(P=0.044)而CD8+T细胞比例降低(P=0.277)、CD4／CD8+比例升高(P=0.042)，记忆T细胞比例升高(P=0.049)，IFN-γ(P=0.001)、TNF-α(P=0.000)、IL-2(P=0.000)、IL-4(P=0.010)、IL-6(P=0.029)升高，IL-10低但未达到统计学意义上的差异(P=0.453)。外周血CD8+T细胞数与MRS(P=0.001)、胆红素水平(TBIL为P=0.010，DBIL为P=0.013)呈负相关而与白蛋白水平(P=0.008)正相关。外周血TNF-α水平与血ALT(p=0.005)、AST(p=0.002)、TBIL(p=0.001)、DBIL(p=0.002)、MRS(p=0.020)正相关。治疗后PBC患者B细胞比例下降(U组治疗6个月时P＜0.05)。叁组CD8+T细胞升高(UP组6月时P=0.002)，U组和UP组CD4+T细胞比例(U组3、6月时为P=0.047，P=0.025)和CD4／CD8下降(UP组6个月时P=0.020)。治疗后叁组患者记忆细胞比例减少、纯真细胞增多但尚未达统计学意义上的差异。叁组治疗后CD4+CD28+T细胞比例的变化无统计学上差异；治疗后U组CD8+CD28+T细胞比例继续降低(6个月时P=0.032)，UP、UA组变化无统计学差异。治疗3月时U组IFN-Y、IL-2、IL-4、IL-6水平均降低，其中IFN-Y、IL-4、IL-6在6个月时再次升高，而UP组和UA组患者在治疗后均低于基线水平。叁组TNF-α水平均较治疗前低(UP、UA组6月时分别为P=0.042和P=0.043)。结论CD4+T细胞比例的增加伴随CD8+T细胞比例的下降及CD8+T细胞与病情的相关性提示其在PBC发病机制中的重要作用。外周血同时存在Thl型和Th2型细胞因子的异常且以Th1细胞占主导地位，提示PBC以细胞免疫为主。TNF-α是参与PBC免疫损伤的重要因子并与病情相关。叁种治疗方案对免疫系统的影响不完全相同。第叁部分原发性胆汁性肝硬化自身抗体特征及其对药物治疗的反应目的研究PBC患者抗线粒体抗体(AMA)、抗线粒体抗体M2亚型(AMA-M2)、抗GP210抗体和抗SP100抗体的临床相关性及对药物治疗的反应。材料与方法82例初诊未治疗的PBC患者随机分为熊去氧胆酸(U组，28人)、熊去氧胆酸联合泼尼松龙(UP组，27人)、熊去氧胆酸联合硫唑嘌呤组(UA组，27人)叁组，治疗前检测AMA(间接免疫荧光法，IIF)、AMA-M2(酶联免疫吸附分析法，ELISA)、抗GP210抗体和抗SP100抗体(免疫印迹法，IBT)，治疗第3、6月复查AMA、AMA-M2。结果PBC患者的AMA滴度、AMA-M2浓度与临床表现(乏力、瘙痒、黄疸)、肝生化指标(ALT、AST、ALP、GGT、TBIL、DBIL、ALB、TBA、CHO)、肝组织学病变程度(纤维化、汇管区炎症、汇周碎屑坏死、肝细胞坏死性损害、胆管增生或减少)间无相关性，AMA与IgM正相关(P=0.046)；AMA与外周血IL-6、IL-1β正相关(P=0.002，P=0.024)，AMA-M2与IL-6正相关(0.024)。叁种治疗方案对AMA、AMA-M2水平无影响(分别为组内效应P=0.270，组间效应P=0.648和组内效应P=0.613，组间效应P=0.764)。疾病进展和疾病未进展的患者间、生化缓解和生化未缓解的患者间基线AMA、AMA-M2水平无差异。抗GP210抗体阳性患者比阴性患者黄疸发生率高(P=0.003)且程度重(P=0.005)、食道静脉曲张发生率高(P=0.005)、Mayo危险性评分高(P=0.005)、DBIL(P=0.035)和TBA水平(P=0.002)高而ALB水平(P=0.002)低、肝组织学分期晚(P=0.013)、纤维化重(P=0.002)；抗GP210抗体阳性者治疗6月时的生化缓解率低(16.7％vs 52.0％，P=0.012)，按胆红素水平将抗GP210抗体阴性与阳性患者1∶1匹配后两组生化缓解率无统计学意义上的差异(16.7 vs 33.3％，P=0.266)。抗SP100抗体阳性与阴性患者的症状、肝脏生化指标、IgM、肝组织学病变程度无差异。结论AMA、AMA-M2对PBC患者有诊断意义，但其水平与病情无关，既不受药物治疗影响，也不影响药物疗效。抗GP210抗体阳性的PBC患者病情重，生化缓解率低，但尚无证据表明抗GP210抗体本身对药物治疗有抵抗作用。抗SP100抗体可作为一项辅助诊断的手段，但与PBC患者的病情无关。第四部分原发性胆汁性肝硬化的肝脏病理与淋巴细胞浸润特征及其临床相关性目的研究PBC患者肝脏病理、淋巴细胞浸润特征及其临床相关性。材料与方法24例初诊未经治疗的PBC患者的肝脏穿刺标本常规进行HE染色，记录病理分期(LudwigⅠ-Ⅳ期，Ⅰ-Ⅱ为早期、Ⅲ-Ⅳ为晚期)、纤维化(0-3级，0.1级为轻度、2-3级为重度)、汇管区炎症(0-3级，0.1级为轻度、2-3级为重度)、汇管区周围碎屑坏死(0-2级，0级为轻度，1-2级为重度)、肝细胞坏死性损害(0-2级，0级为轻度，1-2级为重度)、胆管增生及胆管减少(0-2级，0级为轻度，1-2级为重度)；其中10例标本连续切片，进行免疫组化染色(CD20、CD45RO、CD8)，计数每个汇管区每种淋巴细胞亚型的平均数，分析前述指标的临床相关性。结果病理分期、纤维化程度与黄疸程度、总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、总胆汁酸(TBA)、总胆固醇(CHO)、IgG均呈正相关，与白蛋白(ALB)、血嗜酸细胞(EOS)比例负相关，纤维化程度还与Mayo危险性评分(MRS)正相关。汇周碎屑坏死与黄疸和瘙痒程度、MRS、碱性磷酸酶(ALP)、TBIL、DBIL、TBA正相关，还与血TNF-α水平正相关(相关系数0.617，P=0.006)。胆管减少程度与黄疸、MRS、天门冬酸氨基转移酶(AST)、TBIL、DBIL、TBA、IgG正相关而与ALB呈负相关。不同病理分期及不同严重程度的各种肝组织病变形态的PBC患者临床指标间的差异与前述相关分析中的结果一致。汇管区及汇管区周围CD20+淋巴细胞数与肝脏生化指标间无相关性，CD45RO+、CD8+淋巴细胞浸润程度与ALT、AST、GGT、TBA正相关，CD8+淋巴细胞还与ALP正相关(相关系数=0.775，P=0.041)，也与血IFN-γ水平正相关(相关系数0.901，P=0.006)。结论肝脏病理分期、纤维化程度、汇管区周围碎屑坏死、胆管减少程度是与PBC患者病情轻重及病程有关的指标。TNF-α是反映汇管区周围碎屑坏死程度的有用指标，二者反映了疾病处在进展期。PBC的组织学损害以细胞免疫为主，CD8+T细胞起重要作用，升高的IFN-γ水平增强CD8+T细胞对胆管的破坏。
李虹霞[10]2016年在《自身免疫性肝病Kupffer细胞抗原呈递分子的表达变化》文中研究说明目的:肝脏kupffer细胞抗原呈递功能的变化在自身免疫性肝病(autoimmune liver disease,ALD)的发病机制中占有重要位置,本文拟探讨肝脏kupffer细胞抗原呈递分子的表达在自身免疫性肝病中的变化情况。首先观察肝穿组织CD40/CD68、CD80/CD68、HLA-DR/CD68免疫荧光共定位染色的情况,明确抗原呈递分子CD40、CD80、HLA-DR均在肝脏kupffer细胞上表达,进而比较肝穿组织中CD40、HLA-DR免疫组化染色结果,探索其在自身免疫性肝病中的表达情况,并探讨CD40、HLA-DR是否具有相关性。最后分析CD40、HLA-DR与肝功能、凝血功能等化验结果的关系,揭示肝脏kupffer细胞抗原呈递分子的表达在自身免疫性肝病发病机制中的作用。方法:(1)选择2010年1月至2015年6月在天津市总医院消化内科就诊并行肝穿检查的患者,按照自身免疫性肝炎(autoimmunehepatitis,AIH)、原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)、PBC-AIH重迭综合征(PBC-AIH Overlap syndrome,PBC-AIH OS)的诊断标准进行分组,并将酒精性肝病、脂肪肝、慢性病毒性肝炎作为非自身免疫性肝病患者组用于对照(以下简称为非自免肝组),并记录入选患者的血生化、凝血功能等检查结果。(2)对入选患者肝穿的冰冻切片分别进行CD40/CD68、CD80/CD68、HLA-DR/CD68免疫荧光共定位染色,观察CD40、CD80、HLA-DR在肝脏组织中的表达情况。(3)对入选患者肝穿的石蜡切片分别进行CD40、HLA-DR免疫组化染色,随机选取10个高倍镜视野(400倍),统计CD40+kupffer细胞及HLA-DR+kupffer细胞的数量,取均值,利用方差分析进行组间比较。(4)将CD40、HLA-DR的免疫组化结果进行相关性比较。(5)将CD40、HLA-DR的免疫组化结果与肝功能、凝血功能等生化指标进行相关性分析。结果:(1)免疫荧光双染结果显示CD40、CD80、HLA-DR均在肝脏CD68+kup ffer细胞上表达。(2)免疫组化试验中,CD40在自身免疫性肝病组的阳性细胞数低于对照组。CD40免疫组化阳性产物呈棕褐色或棕黄色颗粒状着色,主要位于细胞膜,少部分位于细胞质。分别计算自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎和非自身免疫性肝病3组肝穿标本中的CD40阳性的kupffer细胞数绝对值,结果显示:3组间CD40阳性的kupffer细胞的计数绝对值比较具有统计学意义(P=0.04,P<0.05)。AIH与PBC组比较无统计学差异(P=0.428,P>0.05);AIH与非自免肝组比较具有统计学意义(P=0.02,P<0.05)(3)免疫组化中,HLA-DR在自身免疫性肝病组的阳性细胞数低于对照组,HLA-DR免疫组化染色阳性产物呈棕褐色颗粒,主要位于细胞膜。分别统计AIH、PBC和非自身免疫性肝病3组的HLA-DR阳性的kupffer细胞计数的绝对值,结果显示3组比较其结果具有统计学意义(P=0.015,P<0.05),AIH与非自身免疫性肝病组比较具有统计学意义(P=0.017,P<0.05),(4)CD40与HLA-DR进行相关性分析,结果显示呈正相关。(5)CD40、HLA-DR结果与肝功能、凝血功能化验检查结果进行相关性分析,结果显示CD40、HLA-DR与AIH患者的谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)具有相关性。结论:(1)CD40、HLA-DR、CD80主要在肝脏kupffer细胞上表达,抗原呈递分子的变化可能引起抗原呈递功能的改变。(2)自身免疫性肝病患者组的肝穿石蜡切片免疫组化染色显示CD40及HLA-DR表达较非自身免疫性肝病组数量减少,且CD40、HLA-DR与自身免疫性肝炎的ALT、AST变化相关,提示自身免疫性肝病可能存在kupffer细胞抗原呈递功能减弱,是导致自身免疫性肝病肝损害的原因之一。
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