天津市中医药研究院附属医院 天津 300121
摘要：目的：观察上皮性的浆液性卵巢癌细胞是否可以通过上皮间充质转换，形成梭形的肿瘤细胞，以及梭形的卵巢癌细胞在肿瘤细胞中的分布。方法：选择浆液性卵巢癌组织50例，HE染色，观察肿瘤组织中是否存在染色较深、细胞形态呈梭形改变的肿瘤细胞及其分布，连续切片进行细胞角蛋白CK和vimentin免疫组化染色。结果：61.54%的低分化（8/13）和18.75%（6/32）的中分化的浆液性卵巢癌组织中存在细胞染色较深，细胞核具有明显的异型性，其细胞核形态明显不同于纤维细胞和内皮细胞，且多分布于细胞密集区域近血管处。而5例高分化的肿瘤组织中未观察到这些梭形的肿瘤细胞。连续切片免疫组化染色结果显示这些梭形的、细胞核染色较深的肿瘤细胞CK染色为阳性，部分肿瘤细胞CK和vimentin染色可以表现为同时阳性，表明上皮样的肿瘤细胞可表达间叶组织标志物，肿瘤细胞呈间叶细胞分化。结论：细胞密集排列区域中央肿瘤细胞处于相对缺氧状态。肿瘤细胞通过上皮间充质转换适应局部缺氧状态，并获得侵袭转移能力。
关键词：浆液性卵巢癌；上皮间充质转换；细胞角蛋白
上皮-间充质转换（epithelial mesenchymal transition，EMT）是指具有极性的上皮细胞转换成为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，它存在于人体多个生理和病理过程中，EMT与肿瘤细胞的侵袭和转移有着密切的关系【1】。在体外，发生EMT的细胞能够在基质胶上生长并穿透基质胶，细胞划痕实验表明，发生EMT的细胞能更快的迁移【2】。在体内，EMT可促进多种肿瘤细胞的转移，比如膀胱癌、原发性肝癌、结肠癌和恶性黑色素瘤等【3】。本研究通过观察50例浆液性卵巢癌标本，在中、低分化肿瘤组织中观察到一些核染色较深的肿瘤细胞，连续切片证实这些肿瘤细胞可同时表达上皮和间叶组织的标志物，表明上皮-间充质转换可能存在于这些肿瘤组织中。国内张诗武等报道在黑色素瘤组织中也存在这些核深染、胞浆浓缩的瘤细胞，这些核染色较深的肿瘤细胞可以呈条带样（线形）分布，他们将之命名为“线形程序性坏死”（Linearly Patterned Programmed Cell Necrosis，LPPCN）【4】。这些上皮样的肿瘤细胞通过EMT转变为表达间叶组织标志物的梭形肿瘤细胞。一方面这些梭形的肿瘤细胞可通过形成LPPCN，获得肿瘤局部氧气和营养需要，以适应肿瘤局部缺氧微环境；另一方面，发生EMT的这些梭形肿瘤细胞具有较高的侵袭和迁移能力，这可能是中、低分化的肿瘤细胞容易发生局部浸润和远处转移的原因之一。
1 材料与方法
1.1 临床资料：收集本院2010年1月-2012年3月间浆液性卵巢癌共50例。年龄48-65岁，平均年龄53.05±18.8岁。其中低分化浆液性卵巢癌13例，中分化浆液性卵巢癌32例，高分化浆液性卵巢癌5例。
1.2 主要试剂：Cytokaretin（RAB-0050，兔单克隆抗体，工作液）Vimentin（RAB-0547，兔单克隆抗体，工作液）均购自福建迈新公司。
1.3 H&E染色和连续切片：H&E观察后选择染色较深、细胞核具有明显的异型性肿瘤组织，肿瘤组织进行连续切片，切片厚度4μm，连续切片根据切片顺序编号后进行免疫组化染色。
1.4 免疫组化试剂与方法：免疫组化染色采用SP法，严格按SP法作流程染色。切片经过专用微波炉进行抗原微波热修复，PBS洗涤后血清封闭。滴加一抗后4℃过夜。PBS洗涤后滴加生物素标记的第二抗体，室温10分钟，PBS洗涤后滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶试剂，室温10分钟后DAB显色后。二甲苯透明中性树胶封片。
1.5 统计分析：
应用SPSS 13.0进行统计分析，使用卡方检验比较这几组分化程度不同的肿瘤组织出现核深染肿瘤例数差别。有意义的临界P值为0.05.
2 结果：
2.1 HE染色结果
50例浆液性卵巢癌包括13例低分化浆液性卵巢癌，32例中分化浆液性卵巢癌和5例高分化浆液性卵巢癌。HE 染色结果显示61.54%低分化浆液性卵巢癌和18.75%的中分化浆液性卵巢癌组织中存在细胞核深染的肿瘤细胞，图1 a-d 显示不同分化程度的肿瘤组织中存在着这种核深染的肿瘤细胞（图1 a-b 为中分化浆液性卵巢癌，图1 c-d为低分化浆液性卵巢癌，如箭头所示）。5例高分化的浆液性卵巢癌组织中则没有观察到这种细胞核深染的肿瘤细胞（见表1）。该肿瘤细胞具有明显的异型性，细胞浆较为稀少，细胞核深染，核浆比例较大，细胞核形状不规则，具有明显的异型性。
2.2细胞核深染的肿瘤细胞在肿瘤组织中的分布：
这些核深染的肿瘤细胞形态明显不同于肿瘤细胞外的纤维细胞和内皮细胞。多分布于上皮细胞密集区域的中央，这些细胞密集区域血管分布较少，肿瘤细胞相对处于缺氧状态。在邻近血管处也可见到这些核深染的肿瘤细胞（图1-e，如箭头所示）。此外，还可见到在上皮样肿瘤细胞巢与肿瘤细胞外间质之间可以见到少量的梭形的肿瘤细胞（图1-f，如箭头所示）。
图2. a和b显示中分化浆液性卵巢癌细胞同时表达CK和vimentin。c和d显示低分化浆液性卵巢癌组织中核深染的肿瘤细胞同时表达CK和vimentin。
讨论：上皮-间充质转换（Epithelial mesenchymal transition，EMT）是指具有极性的上皮细胞转换成为具有移行能力的间质细胞的过程【1】。2007年举行的有关国际EMT会议和2008年冷泉港实验室会议上，根据EMT的特定生物学环境将其分为3种亚型的EMT。与胚胎植入、发育和器官形成有关的EMT称为Ⅰ型EMT，Wnt9b和Wnt4在该过程中发挥重要作用；与损伤修复、组织再生和器官纤维化相关的为Ⅱ型EMT，Ⅱ型EMT的发生与ERK-MAPK，PI3K-AKT信号通路有关。而Ⅲ型EMT是与上皮细胞恶性肿瘤相关的表型转化，该过程与Wnts信号通路、NF-ΚB，TGF-β1通路，酪氨酸激酶受体通路和整合素通路有关【3】。Ⅲ型EMT与肿瘤细胞的侵袭和转移有着密切的关系。在体外，发生EMT的细胞能够在基质胶上生长并穿透基质胶，细胞划痕实验表明，发生EMT的细胞能更快的迁移。在体内，EMT可促进多种肿瘤细胞的转移，比如膀胱癌、原发性肝癌、结肠癌和恶性黑色素瘤等【5】。上述三种类型的EMT，其中Ⅰ型和Ⅲ型的EMT发生与Wnt/β-catenin信号通路发生具有密切关系。其发生相关蛋白包括E-cadherin，N-cadherin，Twist，Snail，Slug和β-catenin等【6，7】。在Wnt/Wg信号通路中，导致胞浆中游离的β-catenin增多进入细胞核，与T细胞因子（TCF）形成β-catenin/TCF复合体，激活下游靶基因（如c-Myc，cyclin D1等）调控细胞的凋亡与增殖以及激活基质金属蛋白酶（MMP）等【8，9，10】。
细胞凋亡（apoptosis）是程序化的主动死亡过程，而细胞坏死则是突发性的、被动的死亡形式。目前研究表明在某些情况下，坏死也可能是机体的一个主动性过程，即在基因调控下，群体细胞发生有规律的主动死亡【11，12】。张【4】等认为黑色素瘤组织中LPPCN分布呈网络状，并出现与内皮依赖性血管相通的现象。他们认为核深染的肿瘤是在基因调控下，细胞发生的有规律的、具有一定分布特征的坏死模式。本研究认为这些细胞核深染的肿瘤细胞一方面可以呈线性分布，如与内皮依赖性血管相通则获得血液供应；另一方面这些核深染的肿瘤细胞发生了EMT，一方面适应肿瘤局部缺氧微环境，另一方面肿瘤细胞在EMT过程中细胞侵袭能力可以增强，以达到局部浸润的目的。
多种肿瘤相关蛋白参与肿瘤EMT发生，但肿瘤组织中出现核深染肿瘤细胞其具体的基因调控和蛋白表达需要大量的实验证明，此外E-cadherin基因突变导致E-cadherin表达下调或功能丧失；或者缺氧诱导因子（HIF-1α）高表达，促进snail入核结合E-cadherin启动子区域，抑制E-cadherin正常表达，使E-cadherin胞内段与β-catenin解离，导致β-catenin入核。因此HIF-1α在Wnt信号通路中的详细机制尚需要进一步研究。
参考文献：
[1]张秀红，杨增明. 上皮细胞-间充质细胞转换（EMT）在癌症转移、胚胎发育及哺乳动物雌性生殖过程中的作用机制. 生物化学与生物物理进展，2012，39（4）：307-313.
[2]Bao XL，Song H，Chen Z，Tang X. Wnt3a promotes epithelial-mesenchymal transition，migration，and proliferation of lens epithelial cells. Mol Vis，2012，18：1983-1990.
[3]伍敏，刘必成. 上皮细胞间充质转化的研究进展.中华肾脏病杂志.2010，26（4）：312-315.
[4]Zhang S，Li M，Zhang D，Xu S，Wang X，Liu Z，Zhao X，Sun B. Hypoxia influences linearly patterned programmed cell necrosis and tumor blood supply patterns formation in Melanoma. Lab Invest. Lab Invest. 2009；89（5）：575-86.
[5]Liu，F and Millar，SE. Wnt/β-catenin Signaling in Oral Tissue Development and Disease.Millar J Dent Res，2010，89（4）：318-330.
[6]Tauriello DV，Maurice MM. The various roles of ubiquitin in Wnt pathway regulation. Cell Cycle，2010，9（18）：3700-3709.
作者简介：吕宏程，男，36岁，主要研究方向为肿瘤学。
论文作者:吕宏程
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2017年第25期
论文发表时间:2018/2/5
标签：细胞论文; 肿瘤论文; 浆液论文; 细胞核论文; 组织论文; 卵巢癌论文; 切片论文; 《中国误诊学杂志》2017年第25期论文;