韩招久[1]2002年在《二化螟对杀虫单和甲胺磷的抗性机理及神经靶标乙酰胆碱受体的基因克隆》文中提出二化螟(Chilo suppressalis)是水稻生产中的重要害虫，严重影响水稻产量和品质。杀虫单、甲胺磷是防治水稻螟虫的主导药刑。由于长期、大量的施用，近年来我国的浙江、江苏很多地区二化螟对杀虫单、甲胺磷产生了抗药性，甚至导致个别地区防治失败。研究二化螟对杀虫剂抗性的机制，是确定科学的抗性治理策略的理论基础，是实现水稻生产可持续发展的重要内容之一。 本研究对二化螟抗药性现状、动态进行了监测；测定了抗感品系酯酶、谷胱甘肽转移酶、多功能氧化酶等解毒酶活性，分析了抗性的生化机制；研究了杀虫单等杀虫剂对二化螟谷胱甘肽转移酶的抑制作用，分析了沙蚕毒素类杀虫剂与有机磷杀虫剂混用增效的机制。从二化螟体内克隆了杀虫单作用靶标-烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)功能亚基(α亚基)的cDNA全序列，分析了基因的结构特征与功能特异性；比较了抗感品系序列上的差异，分析了序列多态性，讨论了昆虫乙酰胆碱受体结构与功能多样性的关系。另外，对小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体功能亚基(α亚基)cDNA片段序列进行了分子克隆。 对浙江瑞安、慈溪、温岭、桐庐和苍南五地，江苏常熟、徐州、高淳等地以及贵州贵阳地区二化螟对杀虫单、甲胺磷的抗性现状进行的监测。结果显示，在浙江除温岭种群对杀虫单较为敏感仅有6.0倍的抗性，其它地区均达到很高的水平，苍南、慈溪和瑞安叁地二化螟的抗性分别达到了65.5、37.7和95.8倍。江苏省各地二化螟对杀虫单普遍产生了抗药性，特别是常熟、高淳和江都种群的抗性倍数分别126、68.5、33.2，达到了高抗水平，其它地区也产生了中等水平抗性。贵州贵阳二化螟对杀虫单抗性水平还不高，仅为9.6倍。浙江各地二化螟对甲胺磷的抗性水平均已达到了很高的水平，苍南和温岭地区二化螟对甲胺磷的抗性达到了很高的水平，分别为99.3和84.8倍，抗性最低的桐庐地区也达到了33倍。除高淳地区二化螟对甲胺磷产生了较高抗性，达到了34倍，江苏其它地区二化螟对甲胺磷抗性水平还维持在中等水平。贵州贵阳地区二化螟对甲胺磷抗性极高，达144倍。对浙江慈溪二化螟田间各世代对杀虫单、甲胺磷和叁唑磷的抗性动态监测结果表明，该地区二化螟对杀虫单和甲胺磷产生了高抗性，对叁唑磷的抗性水平还不高；抗性动态各有其特点，二化螟对杀虫单的抗性第1代低，第2、第3代上升较快，第4代有所下降。二化螟对 二化蚁对杀虫申和甲胺瞰的抗刊肌理及神拧靶标乙酚叫碱受体的缺饲克险甲胺磷和叁哇磷的抗性比较平稳，没有明显的上升。室内饲养条件下，二化螟对杀虫单抗性在1－6代变化不大，呈缓慢下降的趋势。 浙江慈溪二化螟抗性种群对杀虫单和甲胺磷的抗性倍数分别是37厂和52．7倍。代谢酶活性的测定结果表明，抗性种群多功能氧化酶O－脱甲基活性和N－脱甲基活性分别是敏感种群的3．3和1．34倍2 而梭酸酯酶活性Vin与米氏常数Km在抗感种群间没有差异I 谷耽甘肽转移酶（GSTS）的活性在不同底物（CDNB和 DCNB）时表现出一定的底物特异性，抗性种群GSTS对CDNB的酶活性比敏感品系高。这说明在二化螟对杀虫单和甲胺磷抗性形成中，多功能氧化酶活性提高是一个重要的机制，并且由于O－脱甲基作用的底物（对硝基苯甲醚）与甲胺磷，N－脱甲基作用的底物 （对氯氮甲基苯氨）与杀虫单存在结构相似性，因此可以认为多功能氧化酶0－脱甲基活性揭扁主要与二化螟对甲胺磷抗性有关，而N－脱甲基活性提高则是二化螟对杀虫单抗性的主要机制之一。0TS的某些同工酶可能参与了二化螟抗性的形成。 以h化螟为材料研究了杀虫单、甲胺磷和 DEM对谷肤甘肽转移酶（GST）活性的抑制作用。离体抑制试验的结果表明，杀虫单和DEM都对H化螟GSTS活性有强烈的抑制作用，在实验设置的反应体系中，1．25mM、2．smM杀虫单和人卫smM、smMDEM对GSTS押制的时间曲线均呈抛物线型。杀虫单和DEM对G盯S的抑制中率 （50）分别是 1．33和 1．71mM，甲胶磷没有抑制作用。0．05…．IM杀虫单、甲胶磷和 DEM分别处理二化螟的活体实验结果显示，48小时后，杀虫单和 DEM对 GSTS活性的抑制率分别是 10．3和 14．5％，甲胺磷则表现出 8，6％的诱导。酶动力学实验显示，杀虫单和 DEM都是 GSTS的可逆性抑制剂，这种抑制作用不是竞争性的。研究结果表明，杀虫单是GSTS的强抑制剂，这在杀虫单的毒杀机制中有重要的意义。 采用＊lKR枝术，对二化螟n＊hM亚基全长co＊A进行了分子克隆。序列分析表明，这是一个新的。亚基基因，定名为CS。1。基因全长为1997个核苦酸，包含了 1个开放阅读框，编码 1个509个氨基酸的成熟蛋白和 1个24 A基酸的信号肽。氮基酸序列具有神经系统配体门控离子通道亚基的一些共同特征：一个通过两个半耽氨酸之间二硫键形成包括 15个氨基酸（成熟蛋白的 128－142氨基酸）的包外环000p），这种包外环也是其它配体门控离子通道如 GABA、谷氨酸、甘氨酸等神经递质受体通道亚基的结构特征；四个跨膜结构域TM斗；以及一个可能的糖基化位点，位于 24氨基酸恤 勺，它存在于所有昆虫受体亚基和大多数?
曲明静[2]2005年在《二化螟对叁唑磷的抗性及其机理研究》文中研究指明二化螟Chilo suppressalis Walker是水稻的重要害虫之一，常年在长江流域发生较重。上世纪90年代以来，二化螟的发生危害再次呈加重趋势，部分地区暴发危害，对水稻的高产稳产造成很大的威胁，而二化螟抗药性增强是其危害加重的重要原因之一。 叁唑磷是近年来防治二化螟的主要替代药剂。本文对高抗地区-浙江省苍南县的二化螟进行了连续叁年的监测(2002～2004)，并通过筛选抗性品系，对其抗药性机理、抗药性现实遗传力、抗叁唑磷二化螟品系的适合度、抗性稳定性和交互抗性进行了研究，试图为抗性治理提供科学依据。现将研究结果总结如下： 1 二化螟田间抗药性监测 对浙江省苍南县稻田一代二化螟的抗药性进行了连续叁年(2002～2004年)的监测，结果表明：2002年苍南田间种群已经对多种杀虫剂产生抗性，对叁唑磷、氟虫腈、水胺硫磷、甲胺磷的抗性倍数分别为：203.3、19.0、3.7、26.6倍。叁年后田间二化螟对叁唑磷和阿维菌素的抗药性上升迅速，抗性倍数达2367.3和30.0倍；对水胺硫磷和甲胺磷的抗性略有上升，而对氟虫腈的抗性有所下降。至2004年，这3种药剂的抗性倍数分别为8.8、34.8和7.4倍。该研究结果揭示了二化螟抗药性变化与田间用药量和用药种类变化的密切关系。 2 二化螟对叁唑磷的室内抗性选育 在室内用叁唑磷对采自浙江省苍南县的二化螟进行连续14代筛选，抗性由203.3倍上升到3272.6倍；其中在筛选的前12代抗性上升较慢，在后几代抗性上升很快。利用14代的选育结果，计算得到室内叁唑磷筛选抗性的现实遗传力h~2为0.3105，说明二化螟对叁唑磷的抗性风险较大。敏感性回复实验表明，高抗二化螟(RR 1523.7)在停止筛选后，经过5代抗性水平下降到327.1倍，随后保持相对稳定，当再次恢复筛选时，抗性水平又迅速上升。结论认为，二化螟对叁唑磷极易产生高水平抗性，且一旦产生高抗后，停止用药虽然可以使其敏感性明显下降，但不可能回复原来的敏感性水平。因此，二化螟对叁唑磷的抗性应采取早期治理，避免产生高水平抗性，一旦产生高水平抗性后，便不宜再用于二化螟的田间防治。 3 二化螟抗叁唑磷品系的交互抗性
曹明章[3]2004年在《二化螟抗药性监测、对叁唑磷和杀虫单抗性遗传分析及对氟虫腈抗性风险评估》文中提出二化螟[Chilo suppressalis(Walker)]是水稻的重要害虫之一，常年在长江流域发生较重。上世纪90年代以来，二化螟发生危害再次呈加重趋势，部分地区暴发危害难于防治，对水稻的高产稳产构成严重威胁。 二化螟抗药性增强是其危害加重的重要原因之一。杀虫单、叁唑磷、氟虫腈及阿维菌素等是我国近年来防治二化螟使用较多的四种代表性杀虫剂，它们作用机理各异，使用历史也不同。浙江、江苏、安徽、江西等是水稻二化螟发生危害较重的省份。本项研究针对这些地区二化螟代表种群对上述四种药剂的抗性，进行抗性检(监)测，弄清抗性现状；通过药剂筛选估计抗性现实遗传力，预测抗性发展速度；采用毒力回归线法分析叁唑磷和杀虫单抗性的遗传方式；测定抗性种群对不同类型杀虫剂的交互抗性或敏感性；并对抗性与生化代谢机制的关系进行初步研究。 以黑龙江二化螟种群(HLJ)为相对敏感品系，采用4龄幼虫点滴法测定了14种药剂的毒力基线，这些药剂对HLJ相对敏感种群的触杀毒力顺序为：阿维菌素＞高效氯氟氰菊酯，氟虫腈＞辛硫磷，叁唑磷，毒死蜱，杀螟硫磷＞虫酰肼＞二嗪磷，灭多成，敌百虫＞硫丹，杀虫单，乙酰甲胺磷。 2001-2003年对浙、苏、皖、赣四省的二化螟不同种群进行了抗药性检(监)测，结果表明：(1)氟虫腈防治二化螟在很多地方至今还不超过5年，且因其价格高，每年的用量不大，但在二化螟发生危害严重的浙江省温州、台州地区使用较早，每年使用次数也较多；监测的大多数种群对氟虫腈保持敏感，与敏感基线相比的抗性倍数小于3倍；2002年首次发现浙江瑞安种群(ZJRA)对氟虫腈有8.7倍低水平抗性，2003年跟踪监测证实了该种群对氟虫腈有抗性，而且地理分布更南的两个邻近县(平阳和苍南)的二化螟(ZJPY、ZJCN)对氟虫腈也有抗性，叁种群的抗性倍数分别为11.4、13.0和15.0倍，达中等水平抗性。(2)阿维菌素是一种具有杀虫杀螨作用的抗生素，主要以混剂形式用于防治二化螟，使用时间也不长：所有种群对其抗性倍数均小于3，未产生抗性。(3)叁唑磷是对二化螟活性高的一种杂环有机磷杀虫剂，上世纪90年代初首先在浙江温台地区推广防治二化螟等水稻害虫，近1、2年逐渐取代杀虫单(双)而成为人面积防治二化螟的主导药刑；监测发现浙江瑞安(ZJRA)、平阳(ZJPY)和苍南(ZJCN)叁种群为高抗～极高抗，浙江温州瓯海种群(ZJWZ)为中抗，江苏苏南的常熟(JSCS)、锡山(XS)、金坛(JSJT)、武进(WJ)等种群为低水平抗性，江苏苏北(JSLYG、JSXY、SY、CZ等)、江西宜半(JXYF)和安徽太湖(AHTH)种群为敏感。(4)杀虫单属沙蚕毒素类杀虫刑，是上世纪80年代后防治二化螟使用最多的药剂，监测的几乎所有种群对其均有不同程度抗性，其中瑞安(ZJRA)、平阳(ZJPY)、苍南(ZJCN)和宜丰(JXYF)四种群达高水平抗性(57.6～113.7倍)，温州(ZJWZ)、金坛(JSJT)、常熟(JSCS)和太湖(AHTH)等4个种群为中等水平抗性(110-29.7倍)，连云港(JSLYG)和新洋农场(JSXY)等苏北种群对杀虫单为低水平抗性(5.0～7.8倍)，只有个别种群如江苏灌云处于敏感度下降阶段。‘化螟抗药性监测、对叁哇磷和杀虫单抗性遗传分析及对氟虫睛抗性风险评估 2002和2003年重复监测浙江瑞安(ZJRA)和安徽太湖(AHTH〕两种群抗药性，结果显示，同一地点同一代次相邻年份测得的杭性水平变化不大，杭性倍数95%置信区间多数有重迭. 在室内不接触药剂条件下，对浙江苍南种群(ZJCN)的杭药性稳定性进行了观察.结菜表明，对杀虫单、叁哇磷和氛虫睛的抗性稳定性不同。对杀虫单抗性在前3代下降明显，之后直至F7代稳定在一定水平;而氟虫睛和叁哇磷LDS。在F:一Fs下降缓慢、幅度小。 以浙江平阳种群(ZJPY)为起始种群，用2.56一6.72，g/头叁吐磷点滴4龄幼虫进行室内筛选。连续筛选6代后的品系(PY一t)，对叁吐磷杭性水平达1636.1倍，比筛选前增加了2.59倍;根据筛选结果佑算的杭性现实遗传力(矛)为0.4835. 用氟虫睛对浙江苍南种群(ZJCN)进行了连续7代筛选，筛选剂量为0.0128-0.02陀/头。与敏感品系相比，筛选品系(CN一FR)对氛虫睛抗性水平从巧倍提高到23.3倍，抗性上升0.55倍，hZ为0.3388. 以浙江温州种群(ZJWZ)为起始种群，室内累计饲养繁殖24代，期间用杀虫-单筛选19代，得杭性品系WZ一m，对杀虫单杭性达774.5倍，比筛选前上升25.0倍;根据前期(F3一F:)连续6代筛选估计的hZ(0.2303)显着低于后期(F，9-F23)连续筛选5代的hZ(1 .2055)，而中间(F。一F::)20代中有4代未筛选，hZ也最小(0.0243). 以叁哇磷筛选后的RA一t和PY一t为抗性品系，分别与室内敏感品系进行正反杂交、回交及自交，分析二化螟对叁吐磷杭性的遗传方式.实验显示，PY一t品系与敏感品系正反交F.代的叁哇磷LDS。差异不显着、显性度(D)为0.62和0.68，合并计算的F:显性度为0.65，抗性属不完全显性、常染色体遗传;正反交F，分别与敏感亲本回交，回交后代的叁吐磷LD一p曲线在机率值5附近有明显平坡，除两端外，与单个主基因假设的期望曲线基本吻合，且卡方(才)测验显示，在测定的11个剂量中，有6(BC)或7(BC)个与单个主基因控制的假设相符，但在两端、尤其是低剂量端，实际反应与单基因假设不?
姜晓静[4]2009年在《二化螟对叁唑磷的靶标抗性研究》文中研究说明二化螟Chilo suppressalis是水稻的重要害虫之一,由于它钻蛀危害水稻茎秆,因而给化学防治带来一定的难度。采用的杀虫剂通常是渗透性强、具有一定的内吸作用、可传导,而且环境相容性好,价格合理农民可以承受的药剂品种。叁唑磷最初以其优异的防治效果以及合理的价格成为继六六六、杀虫脒、杀虫单之后防治二化螟的主要替代药剂。但最近频频出现叁唑磷对二化螟防治效果下降的报道,而且本实验室的前期工作也证实田间二化螟对叁唑磷产生了显着的抗药性,并分析了抗药性的生化机理,发现叁唑磷抗性二化螟除解毒酶活力加强外,其乙酰胆碱酯酶的敏感性也显着降低。在此基础上,本研究阐明了二化螟对叁唑磷靶标抗性的分子机理,确定了靶标的抗性突变位点,进而建立了抗药性分子监测技术,为抗性二化螟治理和新药剂开发提供了新技术和新思路。1.二化螟乙酰胆碱酯酶基因的克隆和序列分析利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获取了二化螟AChE1基因全长,共2521 bp,其中5’-UTR为235 bp,3’-UTR为204 bp。由cDNA序列推导出来的氨基酸序列包括17个氨基酸的信号肽和677个氨基酸的成熟蛋白,与二化螟AChE2的相似性仅为47%,但与GenBank中其它鳞翅目昆虫的AChE1氨基酸序列的相似性较高,在75%～90%之间；而二化螟AChE2氨基酸序列与小菜蛾、苹果蠹蛾、棉铃虫、烟夜蛾以及家蚕的AChE2序列也具有很高的相似性,均大于90%以上。所推导的二化螟AChE1氨基酸序列具有AChE基因的特征性氨基酸残基,其中包括：(1)形成催化叁联体的叁个氨基酸残基Ser313、Glu439. His553;(2)活性部位的Ser313存在于所有胆碱酯酶中均存在的FGESAG序列中；(3)形成亚基内二硫键的6个保守氨基酸Cys181-Cys208,Cys 367-Cys 380,Cys515-Cys637,以及亚基间的保守氨基酸Cys660；(4)胆碱结合亚部位W198；(5)酰基口袋W346、F402、F443；(6)氧负离子孔G232、G233、A314。因此推断所获得的cDNA序列为二化螟AChEl的cDNA序列。2.二化螟抗叁唑磷品系乙酰胆碱酯酶的点突变分析在室内用叁唑磷对2003年采自浙江省苍南县的二化螟进行连续6代筛选,与2006年6月采自江苏连云港的赣榆地区的二化螟敏感品系比较,抗性水平达到1172倍。对敏感和抗性个体的AChE1、AChE2全长序列分别进行克隆和对比分析,结果发现所有叁唑磷抗性二化螟个体的AChE1,在对应于电鳐Torpedocalifornica的AChE氧负离子孔A201这一功能位点上,发生了固定的点突变(A314S)。Ala与Ser的侧链分别是-CH3和-CH2OH,因此我们推测可能是该侧链的变化改变了相邻的催化叁亚基中Ser的构象,最终影响了AChE1与抑制剂间的相互作用。另外,在抗性棉蚜和小菜蛾体内也发现了同样的点突变。由此分析认为AChE1的A314S突变很可能是导致二化螟靶标敏感性下降的功能突变位点。3.不同二化螟地理种群对叁唑磷靶标抗性的分子检测通过抗性和敏感品系的二化螟AChE1的核酸序列比较发现,抗性相关突变A314S中从鸟嘌呤到胸腺嘧啶的碱基颠换(G／T),导致突变型基因组上的MspA1Ⅰ酶切位点发生变化。根据这个特点,本研究设计了基于RFLP-PCR的分子检测技术进行突变型等位基因的快速检测。结果显示,敏感纯合子SS基因组DNA的PCR产物被MspA1Ⅰ酶切为534bp和224bp两个片段；杂合子RS基因组DNA的PCR产物被MspA1Ⅰ酶切处理后,电泳检测到758bp、534bp和224bp叁个片段；而抗性纯合子RR基因组DNA的PCR产物不能被MspA1Ⅰ酶切,电泳检测只有758bp一个片段。2007年、2008年利用该技术分别检测了7个不同田间地理种群的抗性水平,结果发现检测的抗性等位基因频率与已报道的有机磷杀虫剂抗性相符。该结果不仅创建了灵敏准确的二化螟靶标抗性分子检测技术,同时反证了该突变位点就是抗性功能突变位点。4.二化螟两个乙酰胆碱酯酶基因的相对表达量及体外真核表达利用实时定量PCR技术比较了野生型AChE1和AChE2两个基因在二化螟中的mRNA表达水平,发现在四龄幼虫中AChE1基因的表达量是AChE2的4.8倍。进一步构建了野生型AChE1和AChE2基因的供体质粒pFastBacl-AChE1和pFastBacl-AChE2;利用定点突变技术将突变A314S引入pFastBacl-AChE1构建成pFastBacl-AChE1Mu;将构建好的质粒pFastBacl-AChE1、pFastBacl-AChE2以及pFastBacl-AChE1Mu转到DH10BAC中,利用昆虫杆状病毒表达体系用重组病毒感染Tn细胞进行体外酶蛋白表达,收集细胞进行SDS-PAGE检测和蛋白杂交实验以及酶活测定。结果发现,虽然SDS-PAGE结果和蛋白杂交实验均证实目标蛋白在Tn细胞中正确表达,但酶活测定结果显示,体外表达的二化螟AChE1、AChElMu没有活性,AChE2的活性仅为1.954OD／min／mg。其原因可能是目前采用的系统不适宜表达二化螟AChE,二化螟2个AChE的生理毒理学特性尚有待利用其他表达体系进行进一步研究。综上所述,本研究的创新点包括以下叁点：1.确定了二化螟有两个乙酰胆碱酯酶基因,为以后的AChEs的功能研究以及毒理学研究奠定了基础。2.发现了二化螟对叁唑磷的靶标抗性突变位点,从分子水平上解释二化螟抗性表型产生的分子机理。3.建立了二化螟对叁唑磷靶标抗性分子检测技术,为抗性二化螟治理和新药剂开发提供了新技术和新思路。
李飞[5]2003年在《棉蚜的杀虫剂神经靶标分子生物学研究》文中研究表明由于神经系统在维持生命中的特殊功能，人类以神经系统为作用靶标，开发了大量的速效性杀虫剂。当前广泛应用的有机磷类、氨基甲酸酯类、沙蚕毒素、新型烟碱类和拟除虫菊酯类杀虫剂，均以昆虫神经系统内的乙酰胆碱酯酶(AChE)、乙酰胆碱受体(AChR)和钠离子通道为作用靶标。因此，开展杀虫剂神经靶标的分子生物学研究，深入了解杀虫剂毒理，明确抗药性形成的分子机制，对开展抗性的分子检测、抗性治理以及开发新型高选择性杀虫剂都具有十分重要的意义。 棉蚜(Aphis gossypii Glover)是世界性分布的重大农业害虫，由于其生殖周期短、繁殖量大，一旦条件适宜，在短期内便能爆发危害。因此，对于棉蚜的防治，其它农业防治技术和生物防治技术较难奏效，生产上主要依赖于化学防治。这种对农药的依赖性，不仅使棉蚜成为抗药性发生最严重的农业害虫之一，同时，其抗药性的发展也直接威胁到能否进行可持续控制的问题。为了更深入地了解棉蚜抗药性形成的分子机制，更好地开展棉蚜抗性的检测和治理，弄清棉蚜神经靶标的分子结构以及与非靶标生物的进化差异，为开发新型高选择性杀虫剂和负交互抗性杀虫剂，保证棉蚜的可持续控制，本文对其神经系统靶标进行了较为系统的研究。 1 棉蚜标准试虫饲养方法及不同寄主对棉蚜影响的研究 本研究首先根据棉蚜的生活习性摸索出一种新的棉蚜饲养新方法——笼罩法，并就不同寄主对棉蚜的影响进行了研究。结果发现，棉花、木槿和南瓜等寄主作物对棉蚜AChE和羧酸酯酶均有不同程度的影响，其中取食棉花的棉蚜AChE对乙酰胆碱亲和能力最大，取食木槿的羧酸酯酶活力最高。对有机磷类农药的敏感性也随之发生了变化，其中以取食木槿上的棉蚜敏感性下降最为显着。在此基础上，本研究建立了棉蚜的笼罩棉苗饲养法。该方法省时省力，不仅能减少试虫饲养的工作量，还能保证试虫的质量和可比性，能够满足室内不间断地隔离饲养多个棉蚜品系的要求，为进行长期研究并获得可靠资料奠定了基础。 2 棉蚜品系的建立及有机磷抗性与AChE不敏感性关系的确定 引进英国洛桑试验站171B棉蚜品系为敏感品系，采集中国北京、安阳、莱阳、南京和泰安等不同地区的棉蚜，分离5个抗性水平不同的抗性品系。利用浸叶法生物测定结果表明，不同地区品系对杀虫剂的抗性依次为：安阳＞北京＞南京、莱阳＞泰安。进一步的生化研究表明，安阳和北京品系棉蚜AchE对杀虫剂的敏感性显着下降(I_(50)棉蚜的杀虫剂神经靶标分子生物学研究增加50多倍)，莱阳品系次之，南京和泰安品系接近于敏感品系.安阳和北京品系AChE的蛛值显着下降，表明酶发生了质的变化。不同地区杭性品系的醋酶(全醋酶和菠酸醋酶)活性均显着升高.其中安阳品系拨酸醋酶几值达2460.4 p mol·L一，，而北京品系仅为84.4 p Iuol·L一，，显示该2品系欺酸醋酶发生了质的变化。分析认为，低杭水平的泰安品系以代谢杭性为主，靶标杭性为辅;中杭水平的南京和莱阳品系，，.是由于解毒代谢酶的活性增强，抑或由于靶标的敏感性下降所致;而高杭水平的安押和北京品系，是由代谢杭性和靶标杭性共同作用导致的.3 AchE的分子生物学研究3.1蛋白纯化 利用普普卡因胺亲和层析法建立了棉蚜AChE分离纯化技术，分离纯化了棉蚜敏感品系和杭性品系的AChE，其纯化倍数分别为35，100和33，680倍，回收率分别为30.3%和”.8呱.纯化后AChE在非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳(P AGB)中呈现3条带型，在变性聚丙烯疏胺凝胶电泳(SDS一P人GE)中为1条带，表明纯化后AChE已达电泳级纯度.以甲胺磷和杭蚜威分别对粗酶和纯化酶作抑制性试验，敏感品系粗酶的几。甲胺磷为0.6491 Iuluol·L一，、杭蚜威为1.203 Inlnol·L一，;纯化酶Is。甲胺磷为0.5471Inmol·L一，、杭蚜威为0.8613 nuuol·L一‘;粗酶/纯酶的差异分别为1.19和1.40倍。抗性品系粗酶的几。甲胺磷为2似.叫mmol .L--l、抗蚜威为28.26mm。1·L一，;纯忆酶Is0甲胺磷为34.22 mlnol·L一，、抗蚜威为2.41 nunol·L一‘;粗酶/纯酶的差异分别达到6.43和n.73倍.结果表明，纯化后棉蚜AChE的敏感性显着升高，其中杭性品系棉蚜AChE的敏感性上升幅度明显高于敏感品系。作者分析认为，粗酶体系中非AChE成分的存在对人。有显着影响，而杭性品系的这种影响更为显着.3.2 AChE基因克隆 采用RT一PCR技术和RACE策略，从棉蚜中克隆出2个ace基因。a oel基因全长为2，371 bp，开放阅读框为2，031 bp，编码676个氨基酸(GeneBank登录号:AF502082);aeeZ基因全长序歹，l为2，1 30 bp，开放阅读框为1，995 bp，编码664个氨基翻CeneBank登录号:AF502081)。acel和aceZ基因所编码的氨基酸序列之间的相似性仅达48%，但acel基因与已克隆的麦二叉蚜ace基因(AF321574)之间的相似性达95先 .aceZ基因与已报道的桃蚜ace(AF287”1)之间的相似性达92%.序列分析表明，滋el和aceZ基因具有AChE家族所有的保守性特征。此外，还发现了棉蚜ace基因5’端的选择性剪接现象. 尽管在AChE毒理学研究中，研究者一直怀疑昆虫中有不同的AChE存在，但始终没
刘泽文[6]2004年在《褐飞虱对吡虫啉的抗性及其机理研究》文中认为褐飞虱Nilaparvata lugens Stl(Brown planthopper)是水稻的重要害虫，吡虫啉是防治这一害虫效果最好、使用最广的当家农药品种，为了延缓褐飞虱对吡虫啉的抗性发展，延长吡虫啉的田间使用寿命，本文通过田间抗性调查、室内抗性筛选及适合度的研究，系统分析了褐飞虱对吡虫啉产生抗性的风险；同时以室内筛选的抗性品系和敏感品系试虫为材料，利用现代分子生物技术，研究分析了抗性产生的生化和分子机制，取得了多项具有重要理论和实践意义的成果。 一、褐飞虱饲养技术与田间抗药性调查 本研究根据褐飞虱的生物学特性，通过不同方法的比较，建立了简便易行的褐飞虱室内连续饲养技术。同时为了了解褐飞虱田间抗性状况，连续2年测定了桂林、安庆和东台3地区褐飞虱对10种杀虫剂的敏感性。结果发现，褐飞虱对吡虫啉和醚菊酯最敏感，对马拉硫磷、杀螟松、二嗪磷和氰戊菊酯的敏感性最低，且已产生了不同程度的抗性。在年度和地区间，褐飞虱的敏感性变化不大，但对吡虫啉的敏感性有明显的下降趋势。由于吡虫啉是褐飞虱化学防治的当家品种，目前尚没有更好的替代药剂，为了延缓抗性发展、保证褐飞虱的持续有效治理，研究其抗性发生规律，建立灵敏的抗性监测技术和有效的抗性治理策略，是十分必要的。 二、褐飞虱对吡虫啉抗性的室内连代筛选 根据吡虫啉内吸特性和水稻根系对其强吸收能力，建立了适合于褐飞虱对吡虫啉抗性筛选的稻苗浸根法，并利用吡虫啉进行了室内连代抗性筛选。结果发现，褐飞虱对吡虫啉的抗性发展呈“双S”型，在最初筛选的9代中，抗性发展缓慢，比原始种群仅增加3倍左右。第10代到第22代抗性发展较快，与敏感品系相比，抗性由18.2倍上升到了75.2倍。随后，维持在77.0倍左右。但第26代后，抗性再次出现迅速上升，从第29代到第33代，抗性倍数由109.1上升到250.7倍。第33代后，抗性出现发展平台，最终抗性维持在255.0倍左右。这不仅说明褐飞虱具有对吡虫啉产生高水平抗性的可能，而且“双S”型抗性增长也预示褐飞虱对吡虫啉的抗性可能涉及2个不同的抗性机理。此外，本研究筛选获得的抗性品系也为适合度和抗性机理研究提供了宝贵材料。 叁、吡虫啉抗性对褐飞虱种群适合度的影响 本研究通过构建种群生命表，观察比较了筛选过程中的部分代表性世代(T11、T25和T35)和敏感性品系的一系列生长发育和繁殖特征，就抗性对种群适合度的影响进行了研究。结果表明，3个选定的筛选世代都表现出显着的适合度下降，而且T25和T35褐飞虱对毗虫琳的抗性及其机理研究适合度的下降幅度远大于Tll，表现为一系列生长发育和繁殖上的不利性.相对于敏感品系，高抗品系T25和T35的适合度(0.172;0.1 06)仅有敏感品系的1/5~1/10.这一发现表明，在不使用吮虫琳的情况下，揭飞虱对毗虫琳的杭性会迅速下降.进一步分析认为，抗性褐飞虱适合度的下降，以及大范围迁飞对抗性的稀释作用，是造成田间褐飞虱对咄虫琳杭性发展缓·漫的主要原因.这也说明，只要采取必要的预防性杭药性治理策略，减少毗虫琳的使用，就可以有效地延缓甚至阻止褐飞虱对毗虫琳高水平抗性的发展。四、褐飞虱对毗虫琳抗性的生化机理分析 以毗虫琳抗性筛选过程中代表性世代的褐飞虱为试虫，通过增效试验、交互抗性谱、代谢酶的活力分析和膜蛋白靶标结合试验等，发现毗虫琳与所有作用于乙既胆碱受体的杀虫剂均有明显的交互抗性，而与其他杀虫剂无交互杭性;无论在抗性品系还是敏感品系中，TPP和D EM对吮虫琳都没有增效作用，酉旨酶和谷脱甘肤转移酶的活力变化与咄虫琳抗性也没有相关性;但PBO时毗虫琳表现出显着的增效作用，而且在揭飞虱抗性品系中的增效作用明显强于敏感品系;细胞色素P450单加氧酶活力的变化，在抗性筛选的前25代与抗性发展密切相关，但在极高水平杭性的发展过程中(筛选抗性的第二个上升阶段)基本保持不变;膜蛋白结合试验发现，第35代极高水平抗性揭飞虱的膜蛋白靶标基本失去T对[’H]毗虫琳的结合能力.由此证实，揭飞虱对咄虫琳的抗性机理，主要包括细胞色素P450单加氧酶活力的升高和灰幼示不敏感性两个方面，其中，细胞色素P450单加氧酶活力升高是褐飞虱对咄虫琳产生高水平抗性(抗性上升第一阶段)的主导机制，而靶标不敏感性的出现，是极高水平抗性产生(第二阶段抗性变化)的重要机制.五、褐飞虱烟碱型乙酞胆碱受体亚基的克隆 采用简并引物和半粱式PCR从揭飞虱中克隆烟碱型乙跳胆碱受体基因，获得了5个目标cDNA片段，根据这5个片段设计特异引物进行R人CE扩增，成功地从褐飞虱中克隆到了5个全长基因，其中4个墓因具有乙眺胆碱受体a亚基的典型特征，另一个具有口亚基的典型结构.同源性分析证实，这5个基因与昆虫乙酞胆碱受体的相应亚基具有很高的同源性，高达60%一9。%.因此认为它们是揭飞虱乙酸胆碱受体的4个a亚基和1个p亚基，分别被命名为NI al、NI aZ、NI a3、Nl a4和NI pl，其Genebank登录号分别为:AY378698、AY378699、AY378700、AY378702和AY378703. 另外还发现，在N 1 a3亚基和Nl口1亚基中存在选择性剪接.Nl a3亚基中的剪接发生在5’一非翻译区，没?
常菊花, 何月平[7]2016年在《二化螟对常用杀虫剂的抗性研究进展》文中研究指明二化螟(Chilo suppressalis)是我国水稻上的重要害虫之一。目前二化螟的防控仍离不开化学防治,而二化螟抗药性问题严重影响了生产上的化防效果。对二化螟的抗性监测、抗性机理、抗性遗传等方面的研究进展进行了综述,并提出了二化螟抗性治理的一些措施。
张丽萍[8]2005年在《外来入侵烟粉虱的种群动态、遗传分化及对噻虫嗪的抗性分子机理研究》文中进行了进一步梳理据报道,我国现有入侵生物400余种,仅松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、斑潜蝇(Liriomyza sativae)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、稻水象(Lissorhoptrusoryzophilus Kuschel)等11种外来有害生物,在我国造成的年经济损失就达574.3亿元人民币。其中,B型烟粉虱是世界性重要害虫,也是近年来入侵我国的外来有害生物,自90年代中后期入侵我国以来,在许多地区暴发危害,造成了严重经济损失,现已成为我国蔬菜、花卉和棉花等经济作物上的主要害虫。本论文主要对B型烟粉虱的种群动态、遗传分化及其对噻虫螓抗药性的分子机理等进行了研究。 2002-2004年对山西省烟粉虱的寄主植物范围和危害情况调查结果:山西省现有烟粉虱寄主植物27科103种(变种),其中葫芦科、十字花科、茄科和豆科等危害较为严重,且以晋南地区受害最为严重,寄主种类较多。 通过对12种主要寄主植物上烟粉虱田间种群动态调查研究,得知不同寄主植物上烟粉虱种群数量达到高峰的时间有所差别,波动的幅度也不一致。烟粉虱在12种寄主植物上的种群数量大小比较依次为:油葵>西葫芦>棉花>大豆>南瓜>茄子>丝瓜>番茄>辣椒>黄瓜>菜豆>玉米,说明烟粉虱对其寄主植物具有一定的自然选择性。另外,采用扩散系数(C=S~2/(?)),对烟粉虱在棉花、油葵和大豆叁种作物田的空间分布型进行了初步分析,结果表明均为聚集分布型。 经反复实验,探索了一套简便、可行、纯度高、带型完整的多头和单头烟粉虱DNA基因组的提取方法。该方法提取的DNA,适用于如AFLP等对模板纯度和质量要求较高的分子标记技术研究,同时也适用于其它小型昆虫DNA的提取。 通过DNA模板浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP用量以及其它反应参数等的摸索、调整,建立了一套完善的烟粉虱AFLP分子标记技术体系。 采用AFLP分子标记体系,对同一地区不同寄主上烟粉虱种群的遗传分化研究结果表明:不同寄主烟粉虱种群之间已经存在一定的遗传分化,但分化的程度比较小;同一寄主烟粉虱种群内的遗传分化则很低。 采用AFLP分子标记体系,对来自美国、以色列、巴基斯坦、澳大利亚、肯尼亚、西班牙和中国等7个国家24个地区的27个烟粉虱种群进行了不同地理种群间遗传分化及系统发育地位研究。结果表明:烟粉虱不同地理种群间存在着丰富的遗传多样性。聚类分析结果显示,中国的烟粉虱种群可能存在多个来源,同时表明中国目前至少存在B型、Q型和非B/Q等4种生物型。采用AFLP分子标记体系,对来自我国浙江(ZJ1-China)、山东(SD2-China)、北京(BJ3一China)、上海(SH1-China)、山西(SX1-China)和河南(HN-China)等地区的烟粉虱种群内遗传分化研究结果表明,同一地区烟粉虱种群内的遗传分化和杂合度均较低,说明B型烟粉虱在中国的发展历史较短,还没有积累更多的遗传变异。另外,从测试结果看,几个种群的平均杂合度大小依次为:北京(BJ3-China)>山东(SD2-China)>浙江(ZJ1-China)>上海(SH1-China)>山西(SX1-China)>河南(HN-China)。该结果将在揭示烟粉虱的入侵路径方面起着一定作用。 用噻虫嗪对烟粉虱进行室内继代抗性汰选,并采用改进的琼脂保湿浸叶法进行生物测定,获得了抗性倍数为39.96倍的抗性品系和相对敏感品系。 采用AFLP分子标记技术,对噻虫嗪烟粉虱抗性品系的遗传分化进行了研究,在聚类树中首
参考文献：
[1]. 二化螟对杀虫单和甲胺磷的抗性机理及神经靶标乙酰胆碱受体的基因克隆[D]. 韩招久. 南京农业大学. 2002
[2]. 二化螟对叁唑磷的抗性及其机理研究[D]. 曲明静. 南京农业大学. 2005
[3]. 二化螟抗药性监测、对叁唑磷和杀虫单抗性遗传分析及对氟虫腈抗性风险评估[D]. 曹明章. 南京农业大学. 2004
[4]. 二化螟对叁唑磷的靶标抗性研究[D]. 姜晓静. 南京农业大学. 2009
[5]. 棉蚜的杀虫剂神经靶标分子生物学研究[D]. 李飞. 南京农业大学. 2003
[6]. 褐飞虱对吡虫啉的抗性及其机理研究[D]. 刘泽文. 南京农业大学. 2004
[7]. 二化螟对常用杀虫剂的抗性研究进展[J]. 常菊花, 何月平. 长江大学学报(自科版). 2016
[8]. 外来入侵烟粉虱的种群动态、遗传分化及对噻虫嗪的抗性分子机理研究[D]. 张丽萍. 中国农业大学. 2005
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