周青[1]2002年在《组织工程化颌下腺体外培养体系构建的实验研究》文中研究指明舍格伦综合征、放射性涎腺炎、Steaven-Jounson综合征、药物过敏或自身免疫性疾病等各种原因造成的涎腺分泌功能严重损害的疾病十分常见，给人类的生存质量带来很大影响，治疗问题仍然十分棘手。近年来，随着细胞生物学和材料学的发展，应用组织工程学的方法体外培养具有生物活性且在结构和功能上与自体颌下腺相类似的组织工程化颌下腺成为可能。 在组织工程化颌下腺体外培养体系的构建研究中，如何获取大量成活率高且保持其增殖、分化及分泌功能的颌下腺细胞是进一步实验研究的基础。目前有关颌下腺体外培养的实验研究没有一个相对成熟的涎腺细胞生长和分化的体外培养系统。虽然绝大多数细胞均可在体外培养，但由于对各种细胞在体内生存环境的了解程度不同而使培养细胞与体内细胞仍然存在着生长、增殖和功能差异。细胞体外培养的功能差异指在体外培养条件下，细胞降低甚至丧失了其在体内的合成、分泌等功能，即细胞的分化特性减弱或不明显。细胞在培养条件下的功能降低和丧失对组织工程研究影响十分巨大。如果在培养过程中使细胞的生存环境得到改善，细胞就能恢复这种分化特性。如果培养的细胞没有其特定功能，则注定不能发挥其应有作用，亦无法构建真正的组织和器官。因此，必须在改善体外细胞培养环境方面不懈努力，使目的细胞保持其特有的功能。 本实验研究目的是建立组织工程化颌下腺(submandibular gland,SMG)细胞的分离纯化及其体外培养体系；研究肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)对体外培养的SMG细胞生长状态和分泌功能的影响；并对优化条件下SMG细胞在胶原海绵支架复合生长特性进行分析，构建理想的体外组织工程化SMG培养系统，为组织工程化SMG的研究奠定基础。实验方法 1.应用胰酶消化法进行SMG细胞的分离纯化，然后进行SMG细胞原代培养和传代培养。 2.应用相差显微镜观察培养细胞的形态结构，绘制原代、第2代和第4代培养细胞的生长曲线，了解细胞的生长特性。 3.用台盼蓝排除试验检测细胞存活率。 4.培养细胞经MTr法检测490lun吸光度A值，判断细胞活力大小。 5.培养细胞的透射电镜(trans而ssion eleetron而eroseope，TEM)观察结合免疫组织化学检测鉴定细胞来源及性质。测定培养细胞的淀粉酶含量，评价培养细胞的分泌功能。 6.加人不同浓度的HGF进行细胞培养，得出生长因子对大鼠SMG细胞增殖的剂量一效应、时间一效应关系，评价HGF对体外培养大鼠SMG细胞增殖的影响。 7.大鼠培养细胞RT一PCR检测淀粉酶的基因表达;免疫印迹法(West-ern blotting)检测淀粉酶蛋白质。 8.将传代培养的第2代细胞接种于胶原海绵表面进行培养，HE染色光镜观察、扫描电子显微镜(seanning eleetron而eroseope，SEM)观察胶原海绵上接种SMG细胞形态结构特点。实验结果 一、大鼠SMG细胞培养及生物学特性 1.培养细胞的相差显微镜观察:整个SMG细胞生长期间为多样性的上皮细胞，无成纤维细胞混杂生长。细胞可传4一5代，成活30一40天。(l)原代培养:刚获取的细胞呈球形，呈悬浮状态，细胞接种后24h贴壁，胞质展开，折光性减低。培养72h后，可见完全伸展的细胞呈扁平多边形，细胞浆为颗粒状，胞核清晰，细胞数量增多。细胞培养至96h，可见新生的SMG细胞，呈大小均一的铺路石状。(2)传代培养:传代后细胞生长较原代加快，24h左右即可贴壁伸展，第2代细胞形态与原代相似呈多角形。细胞经反复传代后形态出现变化，从第3代起出现个别体积较大的”巨细胞”并形成少数空泡。传代次数增加，”巨细胞”数量增加。第5代，细胞以“巨细胞”为主，且形态逐渐由多边形变得不规则，有的细胞伸出长长的突起与邻近细胞相接。细胞界限模糊，胞核散大，胞内出现细小空泡及黑色小颗粒，细胞增殖减慢甚至停滞，脱壁细胞增多，部分细胞死亡形成空泡。 2.SMG培养细胞的生长特性:描绘细胞生长曲线，观察细胞的生长特性。原代:接种后第2天生长平缓，表现同生长曲线潜伏期。第3天开始呈快速生长，构成生长曲线的对数生长期。细胞倍增时间在接种后第5天，6一8天达到高峰，形成平台期，此后细胞数目增长缓慢。第2代细胞保持旺盛增殖，于接种次日就进人快速生长的对数生长期，在其生长曲线上无明显的潜伏期，细胞倍增时间在接种后第4天，同原代细胞生长曲线相比第2代细胞的生长曲线左移。第4代细胞数目增长缓慢，细胞生长能力明显减弱。 3.培养细胞活力的检测:(1)细胞活性观察:接种前用台盼蓝排除试验分别检测细胞的存活率(观察视野n二6)，原代平均为%%，第2代平均为98%。第4代平均为75%。(2)细胞增殖测定:随培养时间延长，各组细胞数量都有不同程度的增加，比较培养72h原代、第2代与第4代细胞吸光度值，原代、第2代与第4代相比较有显着性差异(P<0.05)。 4.体外培养SMG细胞的功能测定 SMG细胞培养上清淀粉酶含量测定:原代培养和传代培养第2代、96小时的培养上清淀粉酶含量较高并且可维持一定水平。传代培养第4代96小时的培养上
李欣宇[2]2010年在《预构组织工程化颌下腺血管化的实验研究》文中认为目的组织工程化颌下腺研究的最终目的是要将有生物活性的种子细胞与具有叁维空间结构的可降解生物材料植入体内,使细胞继续增殖分化维持其功能,并最终形成具有特定结构和分泌功能的人造器官。由于血运的重建是组织再生的基础,要获得良好的新生组织工程化组织,必须保证植入体内的种子细胞尤其是材料内部的种子细胞能够获得及时充分的营养,这又有赖于充足的血液供应和细胞与材料复合物内血供重建的程度和速度。因此进行细胞和材料复合物体内血供的重建就成为组织工程由基础向临床应用的关键性环节。本实验研究目的是采用组织工程技术将具有增殖和分化能力的颌下腺种子细胞与胶原海绵复合物植入动物体内培养,运用预构的方法培养组织工程复合物,观察血管化情况,探讨在同种异体动物体内构建具有生命活力的组织工程化颌下腺的可行性。方法取3天龄SD大鼠颌下腺,组织块法培养颌下腺细胞(RSGCs),并进行细胞来源鉴定。将细胞接种于明胶海绵支架中,体外培养72小时。实验组：预构带腹壁浅动静脉的筋膜瓣,包裹细胞明胶海绵支架复合物,对照组：复合物直接植入SD大鼠腹壁下。不同时间点(4d,7d,14d,21d)分别进行光镜、扫描电镜、血管墨汁灌注组织学及BrdU标记免疫组织化学染色等检测,并应用MetaMorph软件分析墨染区域面积占材料总面积的比例(Pr),SPSS 13.0对数据进行统计分析,观察颌下腺细胞与明胶海绵支架材料复合物在体内的生长及血管化情况。结果实验组植入物在第7-14天出现明显血管化,在海绵中存在大量墨汁染色颗粒及染色区,颌下腺细胞与海绵材料粘附生长,有功能性团块样结构出现,14-21天血管化稳定无明显变化。结论预构的方法可以为组织工程化颌下腺提供良好的血供,并为组织工程化颌下腺组织的血管化提供理论与实验依据。
黄桂林[3]2004年在《组织工程化人工涎腺体外构建的实验研究》文中研究说明涎腺分泌功能障碍是临床上常见的疾病,现在还没有有效的治疗方法。根据组织工程学原理,人们设想体外构建人工涎腺来治疗这种疾病。根据这一设想,我们进行了如下的实验,研究体外构建人工涎腺的可能性。 本实验采用的方法是:首先获取新生SD大鼠幼崽颌下腺组织,经酶消化后体外培养,倒置显微镜、电镜下形态学及CK、淀粉酶抗体的免疫细胞化学染色观察。绘制生长曲线,对涎腺细胞的生物特征进行评价。然后,在体外培养的细胞中加入异丙肾上腺素,并采用免疫细胞化学的方法,用Brdu标记后检测颌下腺腺细胞的增殖活性,绘制生长曲线,测定腺上皮细胞的增殖能力。 然后用去污剂—酶联合多步法脱除家兔、SD大鼠气管组织中的细胞,并将处理后的气管组织进行组织学及材料表面拓扑结构的观察。将PGA(Polyglycolide)、脱细胞处理的衍生生物气管支架材料表面分别接种SD大鼠的颌下腺腺细胞,并进行体外培养,对其细胞上清液中淀粉酶含量、单位面积材料上生长的细胞数、材料上细胞的增殖能力(MTT法)等细胞生长情况、形态进行观察,进行材料细胞相容性研究。最后,将体外构建的颌下腺腺细胞/PGA管、颌下腺腺细胞/脱细胞气管人工涎腺样复合结构植入体内,观察颌下腺腺细胞在体内存活并发挥功能、体外构建涎腺组织的可能性。 以上实验研究表明:体外培养的颌下腺腺细胞经CK(anti-cytokeratin)及淀粉酶抗体染色,表现为阳性,体外培养的颌下腺腺细胞保持了其生物学特征。
黄巍巍[4]2010年在《颌下腺细胞—丝素—壳聚糖复合体的体内实验研究》文中指出目的探讨丝素-壳聚糖(silk fibroin-chitosan, SFCS)为支架,接种颌下腺细胞后,于SD大鼠体内构建组织工程化颌下腺的可行性及生物学特征。方法取1-3dSD大鼠颌下腺,原代培养,传代,将第二代细胞标记5-BrdU,制备成密度为5×106/ml的颌下腺细胞悬液。将其接种于5mm×5mm×5mm的丝素.壳聚糖支架上,体外培养1w。选取8w龄的SD大鼠36只,随机分成实验组和对照组,每组18只。实验组将细胞-支架复合体植入鼠背部皮下；对照组将单纯的SFCS支架植入鼠背部皮下。植入术后3、7、14d每组随机处死6只SD大鼠,取材,大体观察各组局部组织及全身变化。植入物石蜡包埋,组织学切片观察丝素.壳聚糖中颌下腺细胞的生长状况。BrdU免疫组织化学检测细胞来源。CK8免疫组织化学检测颌下腺细胞增殖、生长情况。扫描电子显微镜观察颌下腺细胞与丝素-壳聚糖支架复合生长的情况。应用图像分析系统测定不同时期实验组CK8染色阳性细胞数,采用SPSS for windows 13.0统计分析软件对结果进行方差分析,检验水准α=0.05,P<0.05有统计学意义。结果1、大体观察实验组术后各时间点植入物表面光滑、平整,有被膜覆盖,周围组织炎症反应较轻,随着时间延长,表面有血管长入,形状始终与支架形状一致,对照组可见大量纤维结缔组织包裹材料,聚合物支架降解较实验组明显。2、组织学观察实验组细胞.支架复合物植入初期边缘出现炎症反应,中心区SFCS支架排列规整,颌下腺细胞数目较少,散在于SFCS支架中,分布均匀,无细胞外基质分泌。随着培养时间的延长,炎症反应逐渐减轻,颌下腺细胞数目逐渐增多,细胞或吸附于材料表面,或分散在支架内,聚集成集落,呈岛状排列,分泌的粉染的细胞外基质。3、免疫组织化学观察各时间点BrdU免疫组织化学染色均存在阳性细胞,CK8免疫组织化学染色,实验组植入术后3d时阳性细胞平均数为(29.53±9.37)/个,7d时阳性细胞平均数为(67.70±13.39)/个,14d时阳性细胞平均数为(139.07±47.27)/个,比较叁组数据具有统计学意义(P<0.05),即随着时间的延长,颌下腺细胞数目增多。对照组术后各时间点植入物中均未观察到到CK8阳性与BrdU阳性细胞。4、扫描电子显微镜观察SFCS支架呈网状结构,植入初期颌下腺细胞成圆形,表面光滑,突起较少,散在的粘附于SFCS支架表面或网孔内。随着时间的延长,颌下腺细胞表面凹凸不平,形成颗粒状物,颗粒数目不等,细胞数目增多,粘附于材料表面,并伸出突起,细胞间相互接触、联系,甚至多个细胞聚集形成腺管样的结构。结论本实验应用SFCS作为支架,接种颌下腺细胞后,在体内构初步建出了具有生命活性的组织工程化颌下腺,为进一步组织工程化颌下腺的研究奠定了理论基础。
谭学新, 邓春富, 周青, 王玉新, 王绪凯[5]2004年在《蚕丝及胶原海绵与颌下腺细胞相容性的实验研究》文中进行了进一步梳理目的 探讨SD鼠颌下腺细胞在蚕丝和胶原海绵支架上生物相容性 ,为颌下腺组织工程中支架选择提供依据。方法 体外培养SD鼠颌下腺细胞 ,传至第 2代 ,将浓度为 5 0× 10 6/ml细胞分别接种在蚕丝和胶原海绵支架上。于接种后 1、3、5、7d取材 ,进行细胞计数、倒置相差显微镜及扫描电镜观察等。评价颌下腺细胞在蚕丝和胶原海绵支架上生长情况。结果 颌下腺细胞在蚕丝与胶原海绵支架上均能黏附增殖及分化 ,在胶原海绵上生长较佳。结论 蚕丝和胶原海绵均可为组织工程化颌下腺体外构筑的支架材料 ,但胶原海绵更优于蚕丝。
张霓霓[6]2010年在《双室共培养中人羊膜上皮细胞诱导分化为腺泡细胞研究》文中提出[目的]通过人羊膜上皮细胞(hAECs)体外诱导分化为腺泡细胞及人羊膜上皮细胞移植到受损伤唾液腺组织后的存活情况研究,为唾液腺功能障碍性疾病的细胞替代治疗寻找理想的干细胞来源。[方法]①采用机械法和酶消化法从人羊膜组织中分离hAECs,经原代培养后用流式细胞仪(FCM)和免疫细胞化学方法进行表型鉴定。②hAECs与SD大鼠唾液腺细胞用双室装置进行共培养。③取诱导1周、2周后的hAECs,用免疫细胞化学、荧光实时定量RT-PCR等方法检测α-淀粉酶及其mRNA的表达。④将BrdU标记的hAECs悬液注入SD大鼠损伤下颌下腺组织内。[结果]①胰蛋白酶消化法能有效从人羊膜中分离hAECs,检测结果显示hAECs表达CD29和CK19阳性；CD44和α-淀粉酶弱阳性。②在诱导后2周内,hAECs中α-淀粉酶mRNA的表达量随时间延长而增加。③免疫组化结果显示,细胞移植后第4、7、14天组织切片均可见BrdU染色阳性细胞。[结论]hAECs具有向唾液腺样细胞分化的能力,通过进一步研究,可望成为唾液腺功能障碍性疾病细胞替代治疗的干细胞来源。
参考文献：
[1]. 组织工程化颌下腺体外培养体系构建的实验研究[D]. 周青. 中国医科大学. 2002
[2]. 预构组织工程化颌下腺血管化的实验研究[D]. 李欣宇. 中国医科大学. 2010
[3]. 组织工程化人工涎腺体外构建的实验研究[D]. 黄桂林. 四川大学. 2004
[4]. 颌下腺细胞—丝素—壳聚糖复合体的体内实验研究[D]. 黄巍巍. 中国医科大学. 2010
[5]. 蚕丝及胶原海绵与颌下腺细胞相容性的实验研究[J]. 谭学新, 邓春富, 周青, 王玉新, 王绪凯. 中华实验外科杂志. 2004
[6]. 双室共培养中人羊膜上皮细胞诱导分化为腺泡细胞研究[D]. 张霓霓. 遵义医学院. 2010