刘南 章程 武舒佳 武军驻(通讯作者)
（武汉大学基础医学院生物化学及分子生物学系 湖北 武汉 430071）
【摘要】目的：探究巨噬细胞Raw264.7氧化低密度脂蛋白（LDL）过程中肾素-血管紧张素系统（RAS）的变化。方法：培养RAW264.7细胞，LDL刺激后，用ACE活性测定试剂盒检测细胞内ACE活性的变化，用AngⅡ试剂盒测定AngⅡ的表达；Real-Time PCR检测血管紧张素转移酶（ACE）mRNA的表达；利用Real-Time PCR及Western Blot检测血管紧张素Ⅱ2型受体（AGTR2、AT2R）的表达。结果：LDL刺激Raw264.7细胞后，细胞内ACE的活性、AngⅡ的表达、ACE mRNA水平、AT2R mRNA和蛋白质的表达都升高（P<0.05)。结论：LDL激活了肾素-血管紧张素系统。
【关键词】低密度脂蛋白；肾素-血管紧张素系统；血管紧张素转移酶
【中图分类号】R541.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）08-0026-03
LDL activates renin-Angiotensin system in Raw264.7 cells
Liu Nan, Zhang Cheng, Wu Shujia, Wu Junzhu.
Dept.of Biochemistry and Molecular Biology, Wuhan University School of Basic Medical Sciences, Wuhan 430071,China
【Abstract】Objective To explore the changes of renin-angiotensin system (RAS) in the process of low-density lipoprotein (LDL) oxidation in Raw264.7 macrophage cells.Methods Raw264.7 cells were cultured and stimulated with LDL and then ACE activity was determined with Mouse ACE ELISA Kit, AngII’s expression was determined with Mouse AngII ELISA Kit; Angiotensin I-converting enzyme (ACE) was detected by Real-Time PCR, angiotensin II type 2 receptor (AGTR2, AT2R) was detected by Real-Time PCR and Western Blot. Results After LDL stimulated Raw264.7 cells, the activity of ACE, AngII’s expression, ACE mRNA level, AT2R’s expression were increased (P<0.05).Conclusion LDL activates renin-angiotensin system in Raw264.7 cells.
【Key words】Low density lipoprotein; Renin-Angiotensin System; Angiotensin I-converting enzyme
动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是心血管系统中最常见的，威胁我国人民健康的慢性疾病[1]，在发达国家其发病率和死亡率也很高[2]。AS是受损动脉的病变是从内膜开始的。LDL参与了AS的病变过程，LDL的氧化在慢性炎症反应中起着极其重要的作用[3-5]。血管紧张素（Angiotensin，Ang)是肾素-血管紧张素系统（RAS）中的多肽，可使血管收缩，进而导致血压升高。至今为止，4种血管紧张素肽（AngI、 AngII、AngIII和AngIV)和四种血管紧张素受体(AT1、AT2、AT3和AT4)已经被鉴定[6]。无活性的AngI通过血管紧张素转换酶（ACE）转化为AngII。AngII代谢为AngIII，而后通过两种氨肽酶转化为AngIV。AngII和AngIII是AT1和AT2受体的完全激动剂。AngII是最有效的效应因子，通过调节血容量，血压，外周血管张力，在维持心血管系统的稳态中起重要作用[7-8]。但AngⅡ与LDL氧化之间的相互作用关系尚不清楚，本研究旨在探究LDL氧化过程中对肾素-血管紧张素系统的影响，为研究AngⅡ与LDL氧化之间的相互作用关系提供一定的依据。
1.材料与方法
1.1 主要试剂
实验室保存有Raw264.7巨噬细胞，LDL购自ProSpec-Tany公司。AT2R抗体来源于Abcam公司，GAPDH抗体来源于美国EarthOx公司。小鼠血管紧张素转化酶（ACE）试剂盒、小鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）试剂盒购自上海仁捷生物科技有限公司。
1.2 细胞培养
小鼠RAW264.7细胞培养在含1%青霉素-链霉素，10%胎牛血清，90%DMEM的完全培养基中，置于5% CO2，90% 湿度，37℃的恒温培养箱中培养。
1.3 LDL处理
Raw264.7细胞达到80%-90%细胞密度时，换成无血清和双抗的DMEM培养基中同步化过夜，加入LDL（终浓度100μg/ml,含终浓度１μM的Cu2+），在培养箱中孵育不同的时间。用RIPA裂解液裂解细胞，离心取上清。
1.4小鼠血管紧张素转化酶（ACE）试剂盒测定
ACE的活性 收集LDL刺激的细胞裂解后的上清，设置标准品孔和样本孔，分别加入对应的标准品和样品，空白孔不加；每孔加入检测抗体-HRP，空白孔除外；37℃孵育60min。洗涤液清洗5遍，每孔加入底物A和B，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液，15min 内，在450nm 波长处测OD值。以测得标准品的OD值和浓度值绘制标准曲线，得到直线回归方程，将ACE的OD值代入方程，计算出ACE的活性。
1.5小鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）试剂盒测定AngⅡ的表达
收集LDL刺激的细胞裂解后的上清，设置标准品孔和样本孔，分别加入对应的标准品和样品，空白孔不加；每孔加入检测抗体-HRP，空白孔除外；37℃孵育60min。洗涤液清洗5遍，每孔加入底物A和B，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液，15min 内，在450nm 波长处测OD值。以测得标准品的OD值和浓度值绘制标准曲线，得到直线回归方程，将AngⅡ的OD值代入方程，计算出AngⅡ的含量。
1.6 Real-Time PCR检测ACE mRNA的表达
提取细胞总RNA，设计β-actin上游引物为5'-CTCCATCCTGGCCTCACTGT-3'；下游引物为5'-GCTGTCGCCTTCACCGTTCC-3'，设计ACE上游引物为5'-TACAACTCCAGCGCCGAAC-3',下游引物为5'-GCCAGATCGGTTCATACAGC-3'；逆转录42℃ 2min，37℃ 15min，85℃ 5sec。随后上机进行Real-Time PCR检测。结果处理：相对定量 2–ΔΔCt法。ΔCt（对照组）= Ct（对照组目的基因）- Ct（对照组内参基因），ΔCt（实验组）= Ct（实验组目的基因）-Ct（实验组内参基因），ΔΔCt=ΔCt（实验组）-ΔCt（对照组）。
1.7 Real-Time PCR检测
AT2R mRNA的表达 提取细胞总RNA，β-actin引物同上；设计AT2R上游引物为5'-ACAGGATAACCCGTGACCAAG-3'，下游引物为5'-ACACTGCGGAGCTTCTGTTG-3'；逆转录42℃ 2min，37℃ 15min，85℃ 5sec。随后上机进行Real-Time PCR检测。结果处理：相对定量 2–ΔΔCt法。
1.8 Western Blot检测AT2R的表达
将LDL刺激细胞后的裂解上清进行SDS-PAGE，180mA横流转膜2h，脱脂牛奶封闭2h，一抗4℃摇床孵育过夜。TBST洗涤3次，每次15min。二抗室温孵育2h后，TBST洗涤3次，每次10min。加ECL显影，随后用软件扫描灰度值分析条带。
1.9 统计学分析
用SPSS软件分析数据，计量资料用均数±标准差表示，运用Graphpad Prism5作图，用t检验P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 LDL刺激使ACE活性升高
LDL处理Raw264.7 0、5、10、15min，用ACE试剂盒测定ACE的活性变化：与对照组相比，酶的活性在刺激后5min（1.3667±0.1457，P<0.05）、15min（1.3767±0.1401，P<0.05）增高（图1）。
图1.LDL刺激Raw264.7细胞0、5、10、15min后ACE的活性变化n>3,*P<0.05
2.2 LDL刺激使AngⅡ表达升高
LDL处理Raw264.7 0、1、3、5、7、9、12h，试剂盒测定AngⅡ的表达：与对照组（797.6±12.46），相比，刺激后AngⅡ1h（952.5±21.28，P<0.05）、7h（969.63±20.82，P<0.05）表达升高（图2）。
图2 LDL刺激细胞0、1、3、5、7、9、12h后AngⅡ的表达变化n>3,*P<0.05
2.3 LDL刺激Raw264.7细胞后检测ACE mRNA的表达
LDL处理Raw264.7细胞0、1、3、5h：与对照组相比，刺激后3h ACE mRNA的表达升高（1.2533±0.1405，P<0.05）,5h下降（0.7000±0.1100，P<0.05）（图3）。
图3. LDL刺激细胞0、1、3、5h后ACE mRNA的表达变化n>3,*P<0.05
2.4 LDL刺激Raw264.7细胞后检测AT2R mRNA的表达
LDL刺激Raw264.7细胞0、1、3、5h：与对照组相比，刺激1h（2.805±1.006，P<0.05）、5h（3.6700±1.0934，P<0.05）后AT2 mRNA表达升高（图4）。
图4. LDL刺激细胞0、1、3、5h后AT2RmRNA的表达变化n>3,*P<0.05
2.5 Western Blot检测AT2R的表达
LDL刺激Raw264.7细胞0、1、3、5h后，检测AT2R的表达：AT2R蛋白表达升高，3h（2.5967±0.7253，P<0.05）、5h（2.5933±0.6886，P<0.05）升高约2.6倍（图5）。
图5. LDL刺激细胞0、1、3、5h后AT2R的表达变化n>3,*P<0.05
3.讨论
研究表明，AngⅡ参与了AS的病理生理过程，血管紧张素II诱导的高血压会加重ApoE-小鼠中AS的发展[9]。LDL的氧化过程是一个多因子参与的过程，早期的研究已经表明人体注射血管紧张素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）后血压的升高与血清 LDL 水平密切相关。近期研究发现AngⅡ会促进LDL聚集[10]。因此AngⅡ和LDL之间应该存在相互作用。
在本实验中，在LDL刺激5-15min内ACE的活性提高，从而使AngⅡ的含量在1h后也升高，因此LDL可以促进AngⅡ的表达；并且ACE mRNA、AT2 mRNA与蛋白表达都升高，说明LDL能激活RAS。因此天然LDL粘附于细胞被氧化成ox-LDL的过程中，血管紧张素转移酶（ACE）被激活，使AngⅡ表达升高，进一步LDL促进了ACE mRNA和AT2受体的表达，说明LDL激活了肾素-血管紧张素系统。
我们推测天然LDL氧化过程中，AngⅡ可能作为识别标签，通过识别受体AT1、AT2，介导细胞对LDL的氧化。本实验可作为AngⅡ与LDL相互作用的部分依据，后面会继续研究AngⅡ作用于LDL的方式，检测AngⅡ与LDL的相互作用方式，探究LDL氧化的分子机制。
【参考文献】
[1]Lewis S J.Prevention and Treatment of Atherosclerosis: A Practitioner's Guide for 2008[J]. American Journal of Medicine,2009,122(1):38-50.
[2]Mozaffarian D,Benjamin E J,Go A S,et al.Executive Summary:Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update:A Report From the American Heart Association.[J].Circulation, 2016,133(4):e38.
[3]Sternberg D,Parthasarathy S,Carew TE,Khoo JC,Witztum JL(1989)Beyond cholesterol:modification of low-density lipoprotein that increases its atherogenicity.N Engl J Med 320:915-924.
[4]RosenfeldME.Oxidized LDL affects multiple atherogenic cellularresponses.Circulation 1991;83:2137-40.
[5]Witztum J.Role of oxidized low density lipoprotein in atherogenesis[J].British Heart Journal,1993,69(1 Suppl):S12.
[6]Guimond M O,Gallo-Payet N.The Angiotensin II Type 2 Receptor in Brain Functions:An Update[J].International Journal of Hypertension,2012,2012:1-18.
[7]Wagenaar L J,Voors A A,Buikema H,et al.Angiotensin receptors in the cardiovascular system.[J].Canadian Journal of Cardiology,2002, 18(12):1331.
[8]Touyz R M,Berry C.Recent advances in angiotensin II signaling[J].Brazilian Journal of Medical & Biological Research,2002,35(9):1001-15.
[9]Weiss D,Kools J J,Taylor W R.Angiotensin II-Induced Hypertension Accelerates the Development of Atherosclerosis in ApoE-Deficient Mice[J].Circulation,2001,103(3):448.
[10]Akira Sato,Chiemi Ueda, Ryu Kimura,Chisato Kobayashi, Yoji Yamazaki,Keiichi Ebina.Angiotensin II induces the aggregation of native and oxidized low-density lipoprotein. Eur Biophys J. 2018, 47(1):1-9.
项目支持：国家自然科学基金资助项目(81170273)
论文作者:刘南 章程 武舒佳 武军驻(通讯作者)
论文发表刊物:《医药前沿》2019年8期
论文发表时间:2019/5/10
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