米志强[1]2001年在《新城疫病毒昌黎株F基因的序列分析、表达及重组病毒免疫原性的研究》文中进行了进一步梳理本研究对我国新城疫病毒（Newcastle Disease virus NDV）昌黎株进行了分离、鉴定和部分生物学特性研究。MDT和ICPI的测定结果表明，分离到的NDV昌黎株是中强毒株。 利用合成的引物和Random 9mers随机引物，通过RT—PCR扩增了NDV昌黎株部分F基因（813bp），将其定向克隆进入pKSF质粒（由本室构建），并进行了序列测定和序列分析。结果表明，克隆的F基因序列长度为813bp，编码261个氨基酸，含4个半胱氨酸残基和2个糖基化位点。NDV昌黎株部分F基因和推导的氨基酸序列与国内外13株NDV F基因同一区域进行了同源性分析。核苷酸序列同源性在84.1％～97.5％，推导的氨基酸序列同源性在85.8％～93.9％。系统发育分析表明，NDV昌黎株与国内四平株在同一亚群。NDV昌黎株F蛋白裂解位点区（112～117aa）氨基酸序列为R-R-Q-K-R-F，与强毒株在这一区域的序列（112R-R-Q-R/K-R-F117）相符，证明NDV昌黎株是强毒株。 将克隆的NDV昌黎株部分F基因序列与四平株完整的F基因相应区域进行置换，获得重组F基因，其长度为1754bp，含完整的开放读码框（ORF），编码553个氨基酸。 用新型杆状病毒表达系统—Bac to Bac系统表达了重组F基因。首先将重组F基因亚克隆入pFastBacⅠ质粒，构建了重组质粒pFrF。pFrF转化大肠杆菌DH10Bac后，重组F基因在助手质粒（helper plasmid）帮助下，通过转座进入Bacmid，构建了重组Bacmid（re-Bacmid）。在含有X-gal/IPTG和叁抗（庆大霉素、卡那霉素、四环素）的琼脂平板上挑选白色菌落，提取re-Bacmid，转染sf-9昆虫细胞。在昆虫细胞内，re-Bacmid经复制、表达、装配，形成了重组杆状病毒，经SDS-PAGE和Western blot分析，重组蛋白获得表达，分子量约为63KD，表达的重组蛋白约占细胞总蛋白的8.5％。 用表达的重组F蛋白免疫15日龄雏鸡，每只鸡约240μg，分别于免疫后7、14、21天采血，分离血清，用间接ELISA测定抗体效价，并于免疫后21天进行攻毒。结果表明，免疫的雏鸡体内可产生抗NDV抗体，能够抵抗NDV强毒的攻击，保护率达80％。
王兴龙[2]2001年在《新城疫病毒流行株F基因的遗传变异分析、表达及重组病毒免疫原性研究》文中指出首先对我国部分地区新城疫病毒(ND)流行株进行了分离、鉴定和生物学特性研究。MDT和ICPI的测定表明,分离鉴定的长春株是弱毒株,四平株、昌黎株是中强毒株,广州株、青岛株、北京株是强毒株。这6个NDV毒株与我国80年代分离的毒株相比,毒力普遍降低。
丁壮[3]2001年在《新城疫病毒HN蛋白基因的克隆、序列分析、表达及其免疫原性研究》文中研究表明从我国部分地区分离、鉴定了23株新城疫病毒（NDV），并对其部分生物学特性进行了研究。这23株NDV均能凝集鸡和人（O型血）的红细胞，对猪、山羊、绵羊、牛和马的红细胞凝集作用有差异。分离、鉴定的23株NDV，电镜下呈现圆形或椭圆形，直径100-500nm，囊膜上有长约8-10nm的纤突。NDV分离株及F_(48)E_8经鸡胚成纤维细胞培养，形成稳定的病毒蚀斑。血凝解脱及血凝素热稳定试验表明，四平株、昌黎株、青岛株和F_(48)E_8为快速解脱型，血凝素热稳定性差，而长春株为慢速解脱型，血凝素热稳定性好。鸡胚平均致死时间（Mean Death Time of chicken embryos，MDT）、脑内致病指数（Intracerebral Pathogenicity Index，ICPI）和静脉致病指数（IntravenousPathogenicity Index，IVPI）的检测结果表明，长春株是弱毒株（MDT大于168h、ICPI为0.25、IVPI为0），四平株（MDT为61.2h、ICPI为1.45、IVPI为1.96）、昌黎株（MDT为64.5h、ICPI为1.45、IVPI为2.48）是中强毒株，青岛株（MDT为57.9h、ICPI为1.65、IVPI为2.75）为强毒株。 参考有关文献，设计并合成了一对特异引物。应用RT-PCR，一次性扩增了NDV四平株、昌黎株、青岛株、长春株和F_(48)E_8（国家标准NDV强毒）的全长HN基因。扩出的四平株、昌黎株、青岛株和F_(48)E_8HN基因均为1713bp，编码571个氨基酸，其中四平株和F_(48)E_8HN基因有5个糖基化位点，青岛株和昌黎株HN基因有6个糖基化位点，四平株有12个半胱氨酸残基，而昌黎株、青岛株和F_(48)E_8HN基因含有13个半胱氨酸残基。从同源性分析和系统发育进化树结果来看，野生毒四平株、青岛株、昌黎株与F_(48)E_8相比较，氨基酸序列同源性分别为98.8％、89.7％、89.8％，而国外强毒株Tex.GB、Miyadera、Italien与标准强毒F_(48)E_8氨基酸序列同源性分别为87.6％、90.9％、91.1％，说明国外强毒株与国内标准强毒株在HN基因上同源性并不是很高，而国内分离毒四平株与F_(48)E_8在HN基因上有非常高的同源性，而青岛株、昌黎株与四平株比较，与F_(48)E_8相差近10个百分点，说明国内不同地区的NDV分离株HN基因的同源性相差是很大的，用一种或两种标准强毒制成的疫苗用于防制新城疫难免会出现免疫学上的偏差，而用国内不同地区分离的、同源性不一致的、以基因Ⅶ型为主、辅以Ⅷ型及老基因型（Ⅰ～Ⅵ）、加上我的特有的基因Ⅸ型 新城疫病毒HNffi白基因的克降、序列分析、表达及其免疫原件叭究 怕 NDV F。止卜 F。术。等）流行毒株制成的 NDV多价灭活苗代替国外进 L］的 灭活油苗来防制我国鸡新城疫的发生可能会更有针对性，防制效果会更好。 长春株HN基因为173fop，编码577个氨基酸，有5个糖基化位点，门 个半脱氨酸残基，NDV长春株与 Lasota、Queensland V4、D26厂6和 UlSter ％ 弱毒株的 HN基因的氨基酸同源性在 98．8％～93．4％，系统发育进化树也协J川＼ 非常近的亲缘关系。王兴龙等研究表明，＊＊V长春株F基因裂解位点区门门－ 117）的氨基酸组成为 Gly－Arg－Gin－GlyArg＊eu，与所有弱毒株在这一区域的序 列Gly，Arg／Lys－Gin－Gly／Ser－Afg－Leu十符。由此更进一步证实长春株为弱毒株。 我国目前还没有研究低毒力＊＊V弱毒株的报道，此弱毒株的发现将为我的研 制自己的弱毒疫苗提供疫苗候选株。 将 NDV四平株和长春株 IIN基因亚克隆进入 pFastBac，构建了重组转 座载体phst HN，通过转座得到了重组表达载体pBacmid HN，后者转染昆虫 细胞后产生重组杆状病毒。重组杆状病毒在昆虫细胞中成功地表达了u蛋 白。经SDS－PAGE和Western七＊检测，表达的HN蛋白分子量为74kDa川。昆 虫细胞内糖基化X 还有一个67kDa的小蛋白（未糖基化X 与国外报道结来 致。 NDV四平株，青岛株，昌黎株，长春株和NDV F化止；株重组 HN蛋白二 倍连续稀释后，按6一微量法测定血凝效价，结果HA值分别为2‘、2‘、2‘’、 2’、2‘，应用抗NDV HN单克隆抗体做血凝抑制试验，HI效价分别为2‘、2’、 2’、2’、2’。结果表明，表达的重组HN蛋白均具有良好的血凝活性，1｛这 种血凝活性能够被抗NDV单抗所中和。 用 NDV四平株和长春株表达的 HN重组蛋白分别免疫 15 H龄雏鸡，免 疫两次，间隔两周。免疫剂量为600U令只，第一次加弗氏亢全佐剂，第 欣 加弗氏不完全佐剂。同时设新城疫V4油苗对照组和 F。术s攻毒组。统计临床 发病与兔疫保护情况，用间接ELISA检测抗HN蛋白抗体效价，用HA爿 检 测血凝抑制抗体效价。结果表明，F。术s攻毒组20只鸡经过4天的潜伏期后， 全部发病，8天内全部死亡，油苗对照组20只鸡全部存活，四平株HN r
参考文献：
[1]. 新城疫病毒昌黎株F基因的序列分析、表达及重组病毒免疫原性的研究[D]. 米志强. 中国人民解放军军需大学. 2001
[2]. 新城疫病毒流行株F基因的遗传变异分析、表达及重组病毒免疫原性研究[C]. 王兴龙. 新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展（上册）. 2001
[3]. 新城疫病毒HN蛋白基因的克隆、序列分析、表达及其免疫原性研究[D]. 丁壮. 中国人民解放军军需大学. 2001
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