张男, 李谌, 郭韬, 刘丹平[1]2011年在《骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达》文中认为背景:转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。目的:构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。方法:利用Lipofectamine2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组:转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组:转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组:未转染病毒。结果与结论:①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显着性意义(P>0.05)。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。
刘莎莎[2]2013年在《斑马鱼HIF-1α启动子活性分析及LPS和低氧对HIF-1α的诱导表达》文中指出低氧诱导因子1α (hypoxia inducible factor-la, HIF-la)是在低氧环境下广泛表达的真核细胞转录因子,在调节新陈代谢、发育、细胞存活、增殖和病理状况下都发挥着重要作用。目前对于HIF-1α的研究多集中于哺乳动物的心脑血管疾病、肿瘤、胚胎发育等生理病理方面,而鱼类与哺乳动物相比更容易受到低氧胁迫和污染的侵害,但是关于鱼类HIF-la的调节机制却知之甚少。在本研究中,以模式生物斑马鱼(Danio rerio)为研究对象,对斑马鱼HIF-1a启动子进行生物信息学分析,构建一系列启动子缺失体的真核表达载体分析启动子活性,并研究LPS (lipopoly saccharide)和低氧对HIF-1α基因表达的调节,探究鱼类低氧、炎症适应的分子机制。主要结果如下：1、斑马鱼HIF-1α基因启动子的生物信息学分析通过生物学信息学软件对斑马鱼HIF-1α启动子进行分析,genomatix的gene2promoter程序预测在-651bp至+102bp处是启动子区域,结合这个结果我们通过设计引物,选择-1578至+97的1675bp启动子序列进行下一步研究。CpG Island Searcher预测CpG岛位于-97bp至+403bp处,MethPrime预测CpG岛位于-173bp至+38bp处,显示斑马鱼HIF-1α含有CpG岛。对所选1675bp启动子区进行转录因子预测发现其包括保守的调节元件CEBP (essential regulation elements CCAAT/enhancer binding protein)、STAT (signal transducer and activator of transcription)和E-box (enhancer box),以及应激炎症应答元件CREB (cAMP-responsive element binding proteins)、HSF (heat shock factors)和NF-κB (nuclear factor kappa B)等。通过对鲤科鱼类近端240bp序列进行比对发现其相似性高于82%。将转录因子进行比对后发现它们共同享有CAAT (CCAAT binding factors)、STAT, HIFF (hypoxia inducible factor)等转录因子。2、斑马鱼HIF-1α基因启动子缺失突变体的构建与活性分析设计引物通过PCR扩增斑马鱼HIF-1α系列启动子片段,常规分子生物学方法构建启动子的真核表达载体并进行启动子活性分析测定。结果成功构建6个不同长度的启动子真核表达载体。双荧光素酶测定结果显示最高的启动子荧光活性存在于pGL1-1中；但当转染pGL1-2和pGL1-3后荧光活性却几乎消失,说明-127到+97之间的序列很关键；当转染pGL2-1,pGL2-2和pGL2-3这些包含-127到+97序列的质粒后显示出很好的启动活性；说明我们所构建的最小启动子缺失体pGL2-3(-134至+97)包含最小核心启动子区。对-134至+97序列进行分析后发现此区间中存在很多顺势作用元件,例如E-box, CEBP, STAT,HSF,CREB等；在-1578到-930之间可能存在负性调控元件IRF(Interferon regulatory factor)和PRDI(positive regulatory domain I binding factor)。3、LPS及低氧对斑马鱼HIF-1α基因转录水平的调节常氧下用1μg/mL的LPS处理转染后的细胞后发现,只有pGL2-2和pGL2-3两个缺失体的活性有显着上升,其他缺失体的活性则没有明显变化,说明LPS在常氧下对HIF-1a的启动子活性并没有显着影响。常氧下用不同浓度的LPS处理斑马鱼幼鱼(3dpf)6h后发现,HIF-1a的mRNA水平在任何一个浓度范围内都没有显着变化。结果表明常氧下,在体内研究中LPS对HIF-lα的转录水平也没有显著影响。低氧下用不同浓度的LPS处理3dpf斑马鱼幼鱼后发现,仅在低氧条件下HIF-la的mRNA水平仍然没有显着变化。而在加入了各浓度的LPS后发现HIF-1α mRNA表达重随着LPS的浓度开始不断上升,10μg/mL的LPS显着激活了HIF-1α的mRNA水平。在时间进程实验中,低氧下用10μg/mL LPS处理斑马鱼幼鱼不同时间后,HIF-1α mRNA表达量在处理后3h开始缓慢上升,在第8h时上升到一个高峰。推测LPS和低氧在调节斑马鱼HIF-1a转录活性上存在一种协同机制。这种协同机制与鱼类的生存环境密切相关,因此更有益于鱼类的生存。
张劲娥, 王淑红, 张忻, 郭华艳, 郭娜[3]2014年在《低氧诱导因子1α慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞的成骨基因表达》文中进行了进一步梳理背景:成骨作用和血管发生在骨的形成和修复过程中紧密结合,而低氧诱导因子1α被认为是促血管新生相关基因调控中最重要的核心转录因子,其可促进缺氧部位血管的形成,进而促进骨的形成。目的:构建野生型和点突变型两个低氧诱导因子1α慢病毒真核表达载体Lenti-HIF1α-IRES-EGFP,并比较其对兔骨髓间充质干细胞成骨基因表达的影响。方法:首先根据野生型人源低氧诱导因子1α基因序列信息和确定酶切位点的点突变型序列信息构建低氧诱导因子1α基因野生型和点突变型两个慢病毒真核表达载体;然后采用制备的病毒液转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论:免疫荧光显微镜观察显示,转染7 d后野生型组和点突变型组细胞均未见明显荧光,转染14 d后两组细胞均呈现明显的绿色荧光;qPCR定量分析结果表明,转染7 d后即有低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白2基因的显着表达,转染14 d后,两基因仍然显示较高的表达水平。说明实验成功构建野生型和点突变型低氧诱导因子1α基因慢病毒真核表达载体,转染后可以促进兔骨髓间充质干细胞成骨基因的表达。
张正, 李谌, 胡亮, 刘丹平[4]2010年在《携带低氧诱导因子1α~(mu)和人源化海肾绿色荧光蛋白双基因真核表达载体构建及其在HEK293A细胞中的表达》文中提出背景:低氧诱导因子1能够调控多种基因共同表达,在骨缺损部位可诱导成熟的血管生成,为各种细胞的成骨分化和成骨活动提供营养支持和代谢保证,促进骨愈合,但其真核表达载体的构建及表达却少见报道。目的:实验拟构建携带低氧诱导因子1αmu(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)目的蛋白和人源化海肾绿色荧光蛋白(human renilla reniformis green fluorescent protein,hrGFP)的双基因真核表达载体,并将其转染HEK293A细胞,观测其在细胞中的表达。方法:利用PCR技术定点突变目的基因供体质粒pCMV6-XL5-HIF1α携带的人HIF1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸以及去掉其终止密码子,之后在基因序列前后添加新的酶切位点NotⅠ和PvuⅠ,酶切、测序检测突变情况,将正确突变的HIF1αmu定向连入腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV-IRES-hrGFP-1中。经测序鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1电感受态细胞,通过hrGFP基因荧光表达检测转染情况。结果与结论:经基因测序证实,HIF-1α基因编码区的第402位、564位和803位氨基酸均定点突变成丙氨酸,终止密码子成功去除。经酶切鉴定及测序证实,重组腺病毒表达载体构建成功。荧光显微镜下观察表明,感染重组腺病毒的HEK293A细胞内有大量绿色荧光表达证实通过Lipofectamine 2000途径可使得重组腺病毒载体成功转染HEK293A细胞。
傅锐斌[5]2003年在《重组低氧诱导因子1α基因真核表达载体的构建和表达研究》文中指出冠脉再通方法如PCI、CABG和溶栓治疗等，为缺血性心血管病治疗发挥了重要作用，有其自身的适应征、禁忌征和不同程度的局限性，科学家很早以前就想到了促血管新生治疗。血管内皮生长因子(VEGF)的发现，曾经让他们寄予厚望。但是进一步的研究表明，在VEGF单独刺激下，尽管血管网密度增加，但新生的血管不十分成熟，会出现血管扭曲、通透性增加，还有可能触发肿瘤生长。而近几年才发现的转录激活因子——低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)，已经被证实可以激活低氧代谢和促血管新生基因的转录；在转基因小鼠体内实验证实，重组的HIF-1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。然而，正常氧的条件下，HIF-1α蛋白极易被降解和失活。本研究的目的就是重组构建人低氧诱导因子真核表达载体pcDNA3.1V5-HisA-HIF-1α的两种突变体pcDNA3.1 V5-HisA-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1 V5-HisA-HIF-1α-564Ala-803Ala。研究这叁种重组体在微血管内皮细胞的表达，阐明突变对HIF-1α表达和功能的影响，为组织水平和动物水平评价重组HIF-1α的生物学功能、尤其是它的促心肌血管新生功能打下基础，希望在分子水平为缺血性心血管病促血管新生治疗开辟新途径。 方法 用定点突变的方法将无突变型表达载体pcDNA3.1V5-HisA-HIF-1α的第564位脯氨酸(Pro)密码子ccc突变为丙氨酸(Ala)密码子gcc，构建成单突变型HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1V5-HisA-HIF-1α-564Ala。在第一次突变的基础上，仍然用定点突变的方法将pcDNA3.IV5一HisA一HIF一la一564Ala的803位天冬酞胺(ASn)密码子aat突变为丙氨酸(Ala)密码子gct，构建成双突变型HIF一IQ真核表达载体peDNA3·IV5一HisA一HIF一la一564Ala一803Ala。将无突变型表达载体及突变型表达载体，用脂质体法分别转入人肺微血管内皮细胞(HMVEC)，western blotting法、RT一PCR法和免疫荧光等方法检验转染细胞HIF一la和下游基因VEGF的表达。结果 测序证实，定点突变成功，构建出重组真核表达载体pcDNA3.1VS一HisA一HIF一la一564Ala和peDNA3.IV5一His一HIF一1A一564Ala一SO3Ala;转化后的结果表明，转化突变型HIF一IQ表达载体的细胞比转化无突变HIF一IQ载体的细胞HIF一IQ蛋白明显增加，血管紧张素11刺激无突变HIF一IQ载体的细胞HIF一IQ蛋白表达增加;转化突变型HIF一la表达载体细胞的VEGF表达增强，以转化双突变型HIF一1Q表达载体细胞更明显。结论 正常氧条件下无突变的HIF一IQ蛋白容易被降解，这种降解可以被血管紧张素n抑制;而突变型HIF一IQ正常氧条件下不易降解。证实了HIF一IQ的564位脯氨酸是有氧条件下HIF一la蛋白发生降解的靶点。正常氧条件下，双突变型HIF一la的转录激活功能最强，证实了HIF一1Q的803位天冬氨酞和HIF一IQ蛋白在细胞内的失活有关。突变型HIF一1Q具有成为良好的促血管新生因子的潜能，有进一步研究开发的价值。
童锴, 谢宜军, 王月刚, 吴平生[6]2006年在《人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体的构建及鉴定》文中认为目的构建能在哺乳动物细胞得到常氧下高表达的携带HIF-1α突变型HIF-1α-Ala402-Ala564基因真核表达载体pShuttle2-HIF1α-Ala402-Ala564。方法采用分子克隆技术,在业已完成的pShuttle2-HIF1α-Ala564的基础上,用连续聚合酶链式反应(PCR)定点突变的方法将其第402位脯氨酸密码子CCA突变为丙氨酸密码子GCA,构建成双突变HIF-1α真核表达载体pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564。结果经酶切鉴定及基因测序证实人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α-Ala402-Ala564构建成功。结论成功构建重组人双突变型低氧诱导因子1α真核表达载体pShuttle2-HIF1α-Ala402-Ala564,为缺血性心脏病的HIF-1α基因治疗研究奠定基础。
赖艳娴, 刘城, 王月刚, 谢宜军, 童锴[7]2008年在《人3突变型低氧诱导因子1α真核表达载体和腺病毒表达载体的构建及鉴定》文中研究指明目的为了深入研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用,构建人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。方法双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,凝胶回收前者酶切片段中大小为300bp的小片段及后者酶切片段中大小为6300bp的大片段,并将两者连接,重组成3突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803,并进行酶切和PCR鉴定。鉴定正确后,采用分子克隆技术,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组3突变型穿梭载体,获得含有3突变型HIF-1α(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架载体Adeno-XTM Viral DNA连接,重组成3突变型腺病毒载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803),再进行酶切及测序鉴定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组3突变型真核表达载体和腺病毒表达载体质粒构建成功。结论成功构建重组人3突变型低氧诱导因子1α真核表达载体(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)和人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。
傅锐斌, 吴平生, 宋云峰, 邱建, 戴铁英[8]2005年在《突变低氧诱导因子1_α基因真核表达载体的构建和表达》文中提出目的构建人低氧诱导因子-1α(HIF-1α)真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α的两种突变体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala,并检测它们在人肺微血管内皮细胞(HMVECs)中的表达。方法用定点突变的方法将pcDNA3.1+-HIF-1α的HIF-1α第564位脯氨酸(Pro)密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子GCC,构建成单个突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala。在第一次突变的基础上,仍然用定点突变的方法将pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala的HIF-1α-564Ala第803位天冬酰胺(Asn)密码子ATT突变为丙氨酸(Ala)密码子GCT,构建成双个点突变HIF-1α真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala。将3种HIF-1α表达载体用脂质体法分别转入HMVECs,以RT-PCR、免疫荧光法和Westernblotting法分别对转染细胞进行表达分析。结果测序证实,定点突变成功,构建成重组真核表达载体pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala和pcDNA3.1+-HIF-1α-564Ala-803Ala;3种载体均能表达相应的蛋白和mRNA,但转化突变HIF-1α表达载体的细胞蛋白量比空白细胞和转化无突变HIF-1α载体的细胞显著增加。结论成功构建能够在HMVECs中表达的单个和双个点突变的HIF-1α基因的真核表达载体。
孙磊[9]2012年在《BNIP3在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中的分子机制》文中研究说明肝癌是一种全球性的高发病率和高死亡率的恶性肿瘤。其中,肝癌转移是其导致死亡的最主要原因。因此有效预防和治疗肝癌受到了广泛关注,对肝癌转移的细胞和分子机制的研究将有助于缓解肝癌对人类的威胁。肿瘤转移包括一系列连续事件,主要包括上皮间充质细胞转换(EMT),肿瘤迁移,抵抗失巢凋亡,血管和淋巴管发生。其中,肿瘤细胞抵抗失巢凋亡的能力是指肿瘤细胞脱离基质后能够抵抗由整合素等诱导的凋亡。失去这种能力的肿瘤细胞脱离细胞基质后会在包含局部粘着斑激酶等因子的作用下发生凋亡。抵抗失巢凋亡的能力使得肿瘤细胞能够在脱离基质后进入血液循环,到达远处器官后再贴壁、生长增殖。因此肿瘤对失巢凋亡的抵抗能力在肿瘤转移中发挥重要作用。然而,肿瘤细胞抵抗失巢凋亡能力的分子调控机制研究尚未完全阐明。本课题组在前期的研究中利用多聚2-羟乙基甲基丙烯酸脂(poly HEMA)铺板使肝癌细胞脱离基质而悬浮生长的特性,成功构建了肝癌转移的细胞模型；并使用基因芯片比对贴壁生长和悬浮生长的肝癌细胞后发现,Bcl-2nineteen-kilodalton interacting protein3, BNIP3在悬浮生长的肝癌细胞中表达明显上调。BNIP3属于BCL2家族的一类非典型的、仅有BH3结构域的促凋亡蛋白家族成员,它的表达水平主要受低氧诱导因子HIF-1α (hypoxia inducible factors-1α, HIF-1α)的调控。BNIP3在恶性胶质瘤、宫颈癌等许多肿瘤组织中表达上调,而在胰腺导管癌中表达下调。BNIP3在肝癌转移中的功能及机制至今尚不明确。本课题成功构建了人BNIP3真核表达和靶向BNIP3的shRNA表达载体,验证了两种载体的有效性,并检测了其对自噬的影响。同时,我们利用肝癌转移的细胞模型,明确了BNIP3在悬浮肝癌细胞中的表达情况及其分子调控机制；通过对AKT/ERK和mTOR等信号通路的研究进一步确定了BNIP3能够通过自噬介导肝癌细胞抵抗失巢凋亡能力的效应和机制。通过对BNIP3对肝癌细胞抵抗失巢凋亡分子机制的研究,为临床上判断肝癌预后及靶向治疗提供了新的思路和方法。目的1构建人BNIP3的真核表达载体和ShRNA表达载体,验证其有效性及其对肝癌细胞自噬的影响。2在失巢前后的肝癌细胞中检测BNIP3的表达情况,并同时检测自噬的发生情况。3研究抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中调控BNIP3表达的分子机制及BNIP3与自噬之间相互作用的分子调控机制。4研究BNIP3在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中发挥作用的分子机制。方法1人BNIP3的真核表达载体和ShRNA表达载体的构建及其对肝癌细胞自噬的影响1.1人BNIP3的真核表达载体和shRNA表达载体的构建与验证从人肝癌细胞系BEL7402中,通过RT-PCR扩增人BNIP3基因编码区序列,酶切后插入pcDNA3.1-His-C载体,以此构建重组的pcDNA3.1-BNIP3真核表达载体。同时构建靶向人BNIP3基因的shRNA表达载体pSilencer-BNIP3。分别经测序、酶切、RT-PCR和Western blot等方法对重组载体是否构建成功进行验证。1.2研究人BNIP3的真核表达载体和shRNA表达载体对肝癌细胞自噬的影响肝癌细胞系BEL7402稳定传代后以1.5×105／孔的细胞数接种于12孔板,在75%汇合度时进行细胞转染。将BNIP3真核表达载体和ShRNA表达载体分别按Lipofectamine2000TM转染说明书(每孔中质粒的转染量为2.4u g,脂质体4.8μL)转染进入肝癌细胞24h后提取总蛋白,通过采用Western blot检测自噬标志物LC3蛋白的剪切,研究BNIP3过表达和抑制时对肝癌细胞自噬的影响。2动态模拟肝癌细胞转移的过程2.1肝癌转移的细胞模型的建立肝癌细胞系BEL7402使用加入10%胎牛血清的RPMI1640培养液,在37℃、5%CO2培养条件下培养条件下培养至对数生长期,使用含0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化成单细胞悬液,加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液终止消化并调整细胞悬液密度至3×105/L后,加入在紫外灯下照射过夜晾干的poly-HEMA(终浓度3.6mg/cm2)培养板中继续培养24h,得到失巢状态的肝癌细胞。2.2动态模拟肝癌细胞转移过程取对数生长期的BEL7402细胞,使用含0.02%EDTA的胰酶的消化成单细胞悬液后,用含10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞浓度至3×105/mL,然后按正常细胞培养板的体积要求将单细胞悬液分别加入普通培养板和poly HEMA板中,在5%CO2、37℃的培养箱中培养24h,普通培养板中培养的正常贴壁生长的肝癌细胞和poly HEMA板中悬浮培养的肝癌细胞分别为贴壁组和悬浮组,分别模拟肝癌在原发灶和脱离细胞外基质附着后进入血管转移时的细胞状态。同时,将poly HEMA板悬浮培养的肝癌细胞转入普通培养板中再培养24h,即为悬浮转贴壁组,模拟转移状态的肝癌细胞到达继发灶部位的细胞状态。3抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3表达的分子调控机制研究3.1检测BNIP3在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的表达情况应用肝癌转移的细胞模型悬浮培养肝癌细胞24h后分成两组,一组直接提取总mRNA和总蛋白,一组再转入普通培养板中贴壁生长24h后提取总mRNA和总蛋白,两组均以同样培养条件下的贴壁生长24h的肝癌细胞所提取的总mRNA和总蛋白为对照组,分别通过RT-PCR和Western blot检测了悬浮组的肝癌细胞和悬浮培养转贴壁组肝癌细胞相对贴壁组肝癌细胞中BNIP3在mRNA和蛋白水平上的变化情况。肝癌细胞分别悬浮培养和贴壁生长24h和48h时提取蛋白,用Western blot检测悬浮组的肝癌细胞中相对贴壁生长的肝癌细胞中BNIP3的表达变化。3.2失巢状态的肝癌细胞中BNIP3表达变化的调控机制应用RT-PCR和Western blot检测悬浮培养24h和悬浮24h后再转入普通培养板中贴壁生长24h的肝癌细胞系BEL7402中BNIP3上游调控因子HIF-1α的mRNA和蛋白表达变化；同时应用Western blot检测了ERK信号通路的变化。应用Western blot检测肝癌细胞系BEL7402悬浮培养1h、3h、8h和24h后HIF-1α的蛋白表达变化。为了进一步证实ERK信号通路在BNIP3表达调控中的作用,在失巢状态的肝癌细胞系BEL7402中分别加入ERK抑制剂U0126(终浓度10μM)和PD98059(终浓度10μM)悬浮培养18h,用Western blot检测封闭ERK通路后HIF-1α和BNIP3的表达变化。4自噬在抵抗失巢凋亡肝癌细胞中的效应及分子调控机制的研究4.1肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中自噬的发生和效应研究肝癌细胞系BEL7402分为叁组：悬浮培养24h组、悬浮培养24h后转贴壁生长24h组和贴壁生长24h组用Western blot检测悬浮培养的肝癌细胞中自噬发生的变化。肝癌细胞系BEL7402分为悬浮培养和贴壁生长两组,分别在悬浮或贴壁培养1h、3h、8h和24h提取蛋白用Western blot检测肝癌细胞自噬发生的水平。肝癌细胞系BEL7402悬浮培养18h后加入自噬抑制剂3-MA(终浓度5mM)培养6h,通过与DMSO对照组中自噬水平的比较,确定3-MA对悬浮培养的肝癌细胞自噬的抑制效用,然后用cck8检测3-MA对失巢后肝癌细胞活性的影响和台盼蓝检测3-MA对失巢后的肝癌细胞的凋亡效应。4.2抵抗失巢凋亡的肝癌细胞自噬的分子调控机制研究肝癌细胞系BEL7402分为叁组：悬浮培养24h组、悬浮培养24h后转贴壁生长24h组和贴壁生长24h组用Western blot检测悬浮培养的肝癌细胞中mTOR通路的变化。肝癌细胞系BEL7402分为悬浮培养和贴壁生长两组,分别在培养后1h、3h、8h和24h后提取蛋白用Western blot检测肝癌细胞中mTOR通路的变化。肝癌细胞在分别转染si-BNIP3和共转染si-BNIP3和pcDNA-LC3-GFP24h后,再转入肝癌转移的细胞模型悬浮培养24h,用Western blot检测BNIP3对悬浮培养的肝癌细胞中自噬标志蛋白LC3的影响。在肝癌转移的细胞模型中使用mTOR通路的激活剂insulin(100nM)和rapamycin (100nM)分别刺激或共刺激24h,用Western blot检测失巢后肝癌细胞的mTOR通路的磷酸化和自噬标志蛋白LC3的活性剪切体LC3Ⅱ。5BNIP3在肝癌细胞抵抗失巢凋亡中的分子机制研究5.1BNIP3小干扰RNA si-BNIP3的封闭效果验证肝癌细胞系系BEL7402稳定传代后以1.5×105/孔的细胞数接种于12孔板,在75%汇合度时进行细胞转染。将BNIP3的小干扰RNA si-BNIP3及其对照si-NC分别按Lipofectamine2000TM转染说明书(每孔中siRNA的转染量为40p mol,脂质体2μL)转染进入肝癌细胞24h后提取总蛋白,应用Western blot检测si-BNIP3对BNIP3的封闭效果。5.2si-BNIP3对肝癌细胞抵抗失巢凋亡过程中自噬的作用效应研究肝癌细胞系BEL7402分别在转染si-BNIP3和共转染si-BNIP3和pcDNA-LC3-GFP24h后,分别再转入肝癌转移的细胞模型悬浮培养24h后,用Western blot检测BNIP3对悬浮培养的肝癌细胞中自噬标志蛋白LC3的影响。5.3si-BNIP3在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的效应及机制研究肝癌细胞系BEL7402在转染si-BNIP324h后,再转入肝癌转移的细胞模型悬浮培养24h,分别应用cck8试剂盒和台盼蓝染色法检测失巢后肝癌细胞中的细胞活性；应用Caspase-3/cpp32比色法试剂盒和Western blot检测Caspase-3的活化蛋白。6统计学分析结果用mean±SD表示,各组之间差别的统计学意义用T检验或者one-way ANOVA进行统计,P<0.05被认为有统计学意义。结果1人BNIP3的真核表达载体和ShRNA表达载体的构建1.1成功构建pcDNA3.1-BNIP3表达载体和pSliencer-BNIP3表达干扰载体经测序、酶切、RT-PCR和Western blot等方法证实重组载体pcDNA3.1-BNIP3构建成功；经测序、real time PCR和Western blot等方法证实shRNA表达载体pSliencer-BNIP3构建成功。转染pcDNA3.1-BNIP3后能够在肝癌细胞中高表达BNIP3蛋白,而转染pSliencer-BNIP3后能够有效抑制肝癌细胞中BNIP3的表达。1.2BNIP3分子能够调控肝癌细胞中自噬的发生分别将pcDNA3.1-BNIP3表达载体和pSliencer-BNIP3表达干扰载体转染入肝癌细胞系BEL7402,培养48h后使用Western blot检测肝癌细胞中自噬标志蛋白LC3证实pcDNA3.1-BNIP3高表达BNIP3蛋白能够显着增强肝癌细胞自噬,而pSliencer-BNIP3抑制BNIP3蛋白的表达后,能够显着性减少肝癌细胞自噬的发生。2动态模拟肝癌细胞在体内的转移过程2.1成功建立肝癌转移的细胞模型在普通培养板中常规培养的BEL7402细胞在培养板表面伸展,贴壁生长成单层细胞；而肝癌细胞在悬浮培养18h后,光镜下已可见细胞变圆且相互聚集成团,在24h时细胞聚集程度更高。因此,一般采用悬浮培养18-24h的肝癌细胞进行相关实验。2.2动态模拟肝癌细胞转移过程悬浮转贴壁组在从肝癌转移的细胞模型中悬浮培养24h后转入普通培养板中生长24h,肝癌细胞贴壁且呈伸展状态生长,与正常贴壁生长的肝癌细胞形态一致。而悬浮组细胞保持在肝癌转移细胞模型中的细胞形态。通过该模型的建立,我们成功模拟了体内肝癌细胞转移的过程：贴壁组模拟肝癌原发灶,悬浮组模拟肝癌在血管或淋巴管转移时的细胞状态,而悬浮转贴壁组则模拟肝癌在到达继发灶部位时的细胞生长状态。3抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3的高表达受ERK/HIF-1a通路的调控3.1BNIP3和HIF-1α在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中高表达失巢后的肝癌细胞中BNIP3和HIF-1α在mRNA和蛋白水平上均高于正常贴壁组和失巢后再贴壁组肝癌细胞(P<0.0001)。在24h和48h检测贴壁组和悬浮组肝癌细胞中BNIP3的表达水平,结果显示BNIP3在贴壁组中低表达且无时间依赖性,而BNIP3在悬浮肝癌细胞组中高表达,且表现出时间依赖性。在悬浮培养48h的肝癌细胞相对悬浮培养24h的肝癌细胞中BNIP3的表达显着增加。3.2ERK通路在在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中活化且通过ERK/HIF-1a通路调控BNIP3的表达经Western blot验证,悬浮培养的肝癌细胞中ERK磷酸化水平显着高于贴壁组和失巢后再贴壁组肝癌细胞(P<0.0001)。在肝癌转移的细胞模型中分别加入ERK抑制剂UO126(终浓度10μM)和PD98059(终浓度10μM)悬浮培养18h后,Western blot检测结果显示ERK通路磷酸化水平明显降低,同时HIF-1a和BNIP3的表达显着降低。4失巢后的肝癌细胞通过mTOR通路调控的自噬维持存活4.1失巢后的肝癌细胞通过自噬维持存活Western blot证实自噬标志蛋白LC3的活性剪切体LC3Ⅱ在悬浮组肝癌细胞中表达增加,且其在不同时间点(1h,3h,8h和24h)的表达均高于贴壁组细胞,提示脱离胞外基质的附着能够激活肝癌细胞的自噬。应用自噬的抑制剂3MA抑制自噬后,能够逆转肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗。4.2肝癌细胞通过mTOR通路介导的自噬抵抗失巢凋亡经Western blot验证,mTOR通路的信号分子p-mTOR、p-S6K1、p-S6和p-4EBP1在悬浮组细胞中表达均有不同程度的降低。在不同时间点提取的蛋白检测中,悬浮细胞中mTOR通路关键信号分子mTOR、S6K1和S6的磷酸化水平均显着下调,提示悬浮后mTOR通路的活化受到显着性抑制。mTOR激活剂insulin能够降低失巢后肝癌细胞的自噬水平,而其抑制剂rapamycin的作用则相反。该结果提示失巢后的肝癌细胞通过抑制mTOR通路、上调细胞的自噬水平并进一步抵抗失巢凋亡。5BNIP3介导的自噬使肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡的能力5.1si-BNIP3封闭肝癌细胞中BNIP3的表达经Western blot验证,在转染si-BNIP324h后能够完全封闭BNIP3在肝癌细胞中的表达。5.2si-BNIP3抑制抵抗失巢凋亡的肝癌细胞的中自噬将si-BNIP3对肝癌细胞进行转染后24h后,将转染细胞进行失巢处理,并检测失巢后肝癌细胞中自噬的标记物LC3的剪切水平,以此反应细胞的自噬状况。经Western blot验证,si-BNIP3对BNIP3进行抑制后,能够有效抑制失巢后肝癌细胞中内源性和外源性LC3的剪切。5.3si-BNIP3通过caspase依赖性途径逆转了悬浮培养的肝癌细胞抵抗失巢凋亡的能力对转染si-BNIP3的肝癌细胞进行失巢处理24h后,检测肝癌细胞的生存状况、细胞活力和凋亡水平。经CCK-8和台盼蓝染色检测细胞细胞存活状况,结果显示转染si-BNIP3的悬浮培养的肝癌细胞死亡率明显增加。应用Western blot和Caspase-3/cpp32比色法试剂盒检测Caspase-3的活化,结果显示,转染siBNIP3的肝癌细胞在失巢后,其caspase3的活化水平显着增加。该结果提示,转染si-BNIP3的肝癌细胞通过caspase依赖性途径逆转对失巢凋亡的抵抗效应。结论综上所述,我们成功构建了人BNIP3的真核表达载体pcDNA3.1-BNIP3和shRNA干扰载体pSliencer-BNIP3,发现肝癌细胞中高表达BNIP3可以显着增强自噬,而BNIP3的表达受到抑制时,肝癌细胞自噬明显减少。我们通过构建肝癌转移的细胞模型,动态模拟了肝癌细胞的转移过程。失巢后的肝癌细胞中,BNIP3的表达明显上调,其表达受到ERK/HIF-1α通路的调控。进一步深入探讨其机制显示,BNIP3通过对mTOR通路的抑制增强了悬浮培养的肝癌细胞中的自噬,并进一步介导了肝癌细胞对失巢凋亡的抵抗效应。简言之,本研究提示,转移性肝癌中ERK/HIF-1a通路的活化使BNIP3的表达上调后,BNIP3通过抑制mTOR通路介导自噬的增强而使肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡的能力。对BNIP3在悬浮培养的肝癌细胞抵抗失巢凋亡的功能和分子机制的研究,将有助于建立靶向BNIP3的新疗法以预防和治疗肝癌转移。创新点1本研究率先报道人BNIP3真核表达载体和shRNA表达载体的成功构建。并且从正反两面证明了BNIP3能够介导肝癌细胞中的自噬。2本研究利用肝癌转移的细胞模型,成功模拟了肝癌在体内从原发灶转移到继发灶的侵袭、迁徙和转移过程。3本研究证明了抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3的高表达,并且首次发现抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中BNIP3的表达受到ERK/HIF-1α通路的调控。4本研究证明了在抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中自噬增强,并首次利用RNAi技术证明了BNIP3对mTOR通路的抑制调控抵抗失巢凋亡的肝癌细胞中的自噬。5本研究发现抵抗失巢凋亡的肝癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制,ERK/HIF-1α活化后高表达BNIP3,抑制mTOR通路增强自噬,从而使肝癌细胞获得抵抗失巢凋亡的能力,提示我们以BNIP3为靶标开发新的药物诊断和治疗肝癌转移。
谢宜军, 吴平生, 王月刚, 胡英芳, 童锴[10]2007年在《携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达》文中指出目的构建携EGFP的人低氧诱导因子(HIF-1α)真核表达载体,为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法采用分子克隆技术,KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α获得HIF-1αcDNA,克隆到质粒pcDNA3.1(+),得到质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,以KpnⅠ,ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α获得HIF-1αcDNA,克隆到质粒pEGFP-c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞,用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功,荧光显微镜和Western blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-HIF-1α-c1并在HEK293细胞表达,为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。
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