1．青海大学医学院；2．青海大学附属医院 青海省西宁市 810000
【摘 要】目的：探讨胃癌与对照组中p53基因第72位密码子多态性的表达及其与miR375之间的关系，以了解两者是否可以联合作为预测胃癌发生的高危指标。方法：采用PCR法检测60例胃癌（高分化10例、中分化19例、低分化31例）、60例正常对照中p53基因第72位密码子多态性及miR375表达。结果：胃癌组中 miR375的相对表达量为2.41±0.56、正常组为2.76±0.39，两者相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论：p53 基因 Arg72Pro 多态性与胃癌分化程度及miR375表达间无明显相关。
【关键词】p53基因第72密码子多态性；miR375；胃癌
【中图分类号】R735.2【文献标志码】A【文章编号】2096-0867（2016）-06-340-02
胃癌在全球范围内居恶性肿瘤的第4位，病死率居恶性肿瘤的第2位，其是我国最常见的恶性肿瘤之一。p53基因是迄今发现的与人类肿瘤关系较为紧密的基因，几乎在所有的人类肿瘤中均存在p53信号通路。已有研究证明［1］，p53基因codon72Arg/Arg 基因型可降低胃癌的发病风险，且基因型的表达与胃癌的分化程度有关系。
miRNA是生物体内重要的非编码小RNA，通过与靶mRNA的互补配对而在转录后水平上对基因的表达进行负调控，导致mRNA的降解或翻译抑制。miR375是定位于致癌基因RAS和p53初始细胞癌变和肿瘤化的关键因子，在生殖细胞瘤中起着促进细胞的生长和肿瘤形成的作用。新近研究发现［2］miRNA成为p53基因活化后下调某些蛋白表达的重要中间机制。故本研究欲进一步探讨p53基因第72位密码子多态性与胃癌及miR375之间的关系。
1材料与方法
1.1研究资料
收集2014.12-2015.6在青海大学附属医院行胃镜检查并经病理确诊的胃癌患者60例（高分化10例、中分化19例、低分化31例）均未行手术、放化疗，其中男 38 例，女22 例，年龄（41～82）岁，平均 63．51 岁。并收取同期正常体检者60例其中男 42 例，女18例，年龄（38～78）岁，平均 57．48岁。两组间性别和年龄分布经χ2检验差异无统计学意义（P分别为 0．74、0．87）。
1.2实验方法
1.2.1TaqMan方法检测SNP
A.外周血基因组 DNA 的提取
抗凝采集胃癌组及对照组个体静脉血5 mL，转移2 mL至EP管，置-80℃冰箱保存，使用柱式血液基因组提取试剂盒（生工生物工程上海股份有限公司）从外周血白细胞中提取基因组 DNA，提取的基因组DNA用紫外分光光度计（Eppendorf Bio photometer）测定含量并调整浓度后置－20℃冰箱保存。
vB.引物及探针的设计与合成
根据参考文献［3］及 Primer 5．0软件设计荧光标记探针及引物。Taqman探针：
FAM－CTCCCCGCGTGGCCCC－TAMRA HEX－CTCCCCCCGTGGC-CCCT－TAMRA上游引物：5＇-CCCAAGCAATGGATGATTTGA-3＇ 下游引物：5＇-GGGCCGCCGGTGTAG-3＇探针及引物均由生工公司合成。
完成上述步骤后，把加好样品的384孔板放在LightCycler480 Software Setup（Roche 罗氏）荧光定量PCR仪进行反应。反应条件：50 ℃ 预变性2 min，95℃变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火60 s，循环40次，再72℃延伸6 min。
1.2.2荧光定量PCR检测miR375
A.microRNA抽提
将剩下的抗凝管采集的胃癌组及对照组个体静脉血，转移2 mL至EP管，放置在-80 ℃冰箱保存，使用柱式microRNA抽提试剂盒（生工公司）提取总RNA，再提取miRNA并将其置于-20℃冰箱保存。
B.反转录
将提取的miRNA至于第一链cDNA合成试剂盒（生工公司）合成第一链cDNA，并将上述溶液-20°C保存。mircoRNA-375特异性引物序列见下：
miR-375RT：5＇-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCACGCGA-3＇
C.荧光定量PCR检测
P
完成上述步骤后，把加好样品的384孔板放在LightCycler480 Software Setup（Roche罗氏）荧光定量 PCR仪进行反应。反应条件：95℃变性3min，95℃变性7s，55℃退火10s，再72℃延伸15s，循环 40 次。
1.3统计学方法
采用SPSS17.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，运用配对样本 t 检验和方差分析；计数资料采用χ2检验；计量资料与计数资料间的相关性用spearman分析。以 P＜0.05 为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 miR375在胃癌组及正常组中的表达
胃癌组中miR375的相对表达量为2.41±0.56、正常组为2.76±0.39，两者相比，差异有统计学意义（P＜0.01）。在胃癌标本中，肿瘤直径大小、分化程度、浸润深度、TNM分期均有统计学意义（P＜0.05）。
2.2 P53 codon72的检测
经检验两组基因型分布均符合Hardy－Wein-berg平衡规律（P＞0.05）。Arg / Arg、Arg / Pro、Pro / Pro三种基因型在胃癌组中的频率分别为 26.66%、60.00%、30.00%，在对照组中分别为30.00%、55.00%、31.66%，三种基因型分布在两组中无显著性差异（P =0.16）。胃癌病例中以低分化胃癌最常见（占 51.66%），高分化胃癌所占比例最小（占6.00%）。Arg / Arg 基因型频率在高分化、中分化、低分化分别为 10.00%、60.00%、30.00%；Pro / Pro 基 因 型 频 率 依 次 为 32.25%、67.74%、32.25%；Arg / Pro 基因型频率依次为26.31%、47.36%、26.31%。
3讨论
由于我们对于胃癌的发病机理尚缺乏更全面和深入的了解，临床上也缺乏特异性的胃癌肿瘤标记物；所以深入研究胃癌的发生发展机制，寻找新的生物标记物和治疗靶标，从而提高胃癌的早期诊断率并提高临床预后都迫在眉睫。
p53 基因是迄今为止已发现的与人类肿瘤发生相关性最高的抑癌基因，也是胃癌中最常突变的抑癌基因。有研究显示，p53 基因具有多态性，其第 72位密码子的 Arg/Pro 是一个常见的多态位点，多态基因可编码或含精氨酸（Arg）或含脯氨酸（Pro）的两种 p53 蛋白，使得一般人群中携带 Arg/Arg、Pro / Pro和 Arg / Pro三种基因型之一，这种多态性在一般人群中普遍存在。目前关于 P53基因codon72多态性与miR375之间关系的研究很少，本研究显示P53基因codon72多态性与miR375之间无明显相关性，可能与样本量较少有关系，但上述研究均证明P53基因与miR375在消化系统肿瘤的发生和发展过程中发挥了重要的作用，监测P53基因与miR375的表达水平可能有助于消化系肿瘤的早期诊断和预后判断。
综上，本研究所得结果提示p53基因第72位密码子多态性与miR375各自与胃癌有关，但其之间的相关性本研究暂不支持，由于我国地域辽阔、各地区胃癌的发病率不尽相同，而目前关于此方面的报道较少，因此需在进一步加大样本量、胃癌发生相关因素等方面进行，不同人种胃癌miR375及p53基因第72位密码子多态性的研究，从而了解p53基因第72位密码子多态性是否在某些既定人种中可预测胃部疾病的发生发展趋势。
参考文献：
［1］KuiJie Liu，HaiZhi，HongLiang Yao，et al．An updated meta － analysis of p53 codon 72 polymorphism and gastric cancer risk［J］．Mol Biol Ｒep，2012，39：8265 － 8275．
［2］He L，He X，Lim LP，et al. A microRNA component of the p53 tumour suppressor network. Nature，2007；447：1130-1134
［3］Ke xing Z，Yu Min L．Study on the association of p53 codon 72 polymorphisms with risk of gastric cancer in high incidence Hexi area of Gansu Province in China［J］．Mol Biol Ｒ ep，2012，39（1）：723 － 728．
项目基金：青海省自然科学基金（2012 － Z －908）
论文作者:李苏华,王学红,马臻奇
论文发表刊物:《系统医学》2016年第2卷第6期
论文发表时间:2016/6/20
标签：胃癌论文; 基因论文; 多态性论文; 密码子论文; 引物论文; 肿瘤论文; 统计学论文; 《系统医学》2016年第2卷第6期论文;