陈季琴[1]2004年在《多年生黑麦草组培再生体系的研究》文中进行了进一步梳理本研究以多年生黑麦草(Lolium perenne L．)的叁个品种：特拉华(Delaware)、尤文图斯(Juventus)和托亚(Taya)为研究对象，选用成熟胚和成熟种子为外植体，对植物激素和其它营养成分等因素设计多个浓度水平，探讨其对愈伤组织诱导和分化的影响，以及再生体系建立中的褐化、白化等问题。研究结果表明： 1．成熟胚在愈伤组织的诱导率、生物量及质量方面均较优于成熟种子，但成熟种子接种操作简单易行，而胚根、胚根诱导效果较差。 2．在愈伤组织的诱导率、生物量、褐变死亡率、愈伤质量以及愈伤分化率方面的表现高低依次为：特拉华＞托亚＞尤文图斯 3．2，4-D浓度在2～4mg／L之间有利于成熟胚诱导愈伤组织，7mg／L有利于成熟种子诱导愈伤组织。6-BAP浓度0.025mg／L时成熟胚诱导的愈伤组织在诱导率、增殖能力和胚性愈伤比例方面均较高，成熟种子为外植体时适宜浓度为0。成熟胚的出愈率最高为D(98％)，J(68％)，T(72％)，成熟种子的出愈率最高为D(75％)，J(40％)，T(7096)。 4．6-BAP对愈伤组织的分化有显着影响，0mg／L利于成熟胚诱导的愈伤组织分化，最高分化率分别为D(90.9％)，J(69.2％)；0.1～0.3mg／L利于成熟种子诱导的愈伤组织分化，最高分化率分别为D(87.0％)，J(43.3％)，T(95.0％)。NAA、ZT、Cu~(2+)对愈伤组织的分化都有一定的促进作用。 5．正交试验优化了成熟种子的愈伤组织诱导与分化培养基： Delaware：2，4-D(7mg／L)+6-BAP(0.1mg／L)+NAA(0.3mg／L)+CaH(0.1g／L)(诱导)，6-BAP(0、0.1或0.3mg／L)+NAA(0.4mg／L)+ZT(0.1mg／L)+Cu~(2+)(8.96mg／L)(分化)。 Juventus：2，4-D(7mg／L)+6-BAP(0)(诱导)，分化培养基有待增设因素及浓度继续摸索。 Taya：2，4-D(7mg／L)+6-BAP(0)(诱导)，6-BAP(0.2 mg／L)时愈伤组织分化率最高。 6．通过在愈伤组织分化阶段加入活性炭和水解乳蛋白，将愈伤组织分化率提高达2％左右，褐变死亡率降低达10～18％。
郑若男, 阮以勒, 郑双双, 杨志红[2]2013年在《原种黑麦草组培再生体系建立初探》文中研究指明[目的]探索原种黑麦草愈伤组织诱导和植株再生方法,为多年生黑麦草原种的转基因研究奠定基础。[方法]以多年生黑麦草原种成熟种子为外植体,在组织培养条件下,施以不同浓度的激素进行培养,研究不同激素组合对愈伤组织诱导以及植株再生的影响。[结果]MS基本培养基中添加5.0 mg/L 2,4-D时愈伤组织诱导率最高,达64.85%;愈伤组织在MS附加1 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IBA的分化培养基中分化率最高,为37%;不定芽在添加0.1 mg/L IBA的生根培养基中生根率为96%。[结论]黑麦草原种愈伤组织再生体系成功建立。
曾庆飞, 韦鑫, 陈锡, 陈光洁, 马培杰[3]2017年在《多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立》文中提出对在贵州地区广泛种植的多花黑麦草特高(Lolium multiflorum‘Tetragold’)和多年生黑麦草四季(L.perenne‘Four seasons’)的成熟种子进行了愈伤组织诱导及植株再生的研究,建立了两个品种的胚性愈伤组织高频诱导与再生体系。结果表明,剥去成熟种子的颖壳,切除1/3胚乳端,将特高接种于CC+7mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA、四季接种于CC+5mg·L~(-1) 2,4-D+0.5 mg·L~(-1) 6-BA的培养基中,在明显降低组培污染率的同时,能分别得到65.52%和63.55%的最高愈伤组织诱导率;将两个品种诱导出的愈伤组织转移在MS+0.5 mg·L~(-1) 2,4-D+0.5mg·L~(-1) 6-BA+1.25mg·L~(-1) CuSO4+1.0g·L~(-1) CH的继代培养基上,能促进质量较好的Ⅱ型胚性愈伤组织的形成;根据后续转化试验所选用的植物表达载体pCAMBIA 1300的抗性特点,30~40mg·L~(-1)的潮霉素是两个品种愈伤组织最佳的筛选剂和临界浓度;特高的胚性愈伤组织接种在MS+2.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.5 mg·L~(-1) NAA+0.1mg·L~(-1) TDZ的培养基上,可以产生86.37%的最高分化率,四季的胚性愈伤组织接种在MS+6.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.3mg·L~(-1) NAA+5.0mg·L~(-1) KT的培养基上,能得到85.40%的最高分化率;生根培养基1/2MS+0.5 mg·L~(-1)NAA+0.5mg·L~(-1) IAA能让两个品种分化出的不定芽形成100%的生根率;以腐殖土∶蛭石∶砂壤土=1∶1∶1的混合材料作为营养土,能保证组培再生苗达到99%以上的成活率。优化建立的高频组培再生体系为下一步的遗传转化奠定了基础。
陈季琴, 韩烈保[4]2004年在《多年生黑麦草转基因育种研究进展》文中进行了进一步梳理回顾了多年生黑麦草组培再生体系的建立和遗传转化的研究历程和结论,分析了利用转基因技术进行草坪草育种存在的问题,并对进一步的研究做出展望。
杨成民[5]2004年在《基因枪轰击法获得转P5CS基因黑麦草植株》文中研究说明多年生黑麦草是优质的草坪草，利用基因工程进行遗传改良的研究一直备受人们关注。我们在建立了高效的多年生黑麦草组培再生体系的基础上，通过基因枪法转化P5CS基因，获得了多年生黑麦草的新品系，为培育抗旱、耐盐草坪型黑麦草提供了新种质。主要结果如下：1．建立了多年生黑麦草两种外植体的再生体系 经过对比试验，筛选出适合于黑麦草成熟胚为外植体的再生培养基配方，愈伤诱导培养基MS + 2,4-D 5mg/L + mannitol 0.2mol/L为最佳，分化培养基为1/2MS培养基（大量减半）+ 2,4-D 1mg/L + KT 1mg/L，分化率为71%。并对影响其再生频率因素作了初步分析。种子浸泡时间越短，胚乳越少越有利于愈伤组织的诱导。幼穗愈伤诱导和分化培养基均为MS＋2,4-D 3mg/L +6-BA 0.5mg/L + sucrose 3%，成功地建立了再生体系，愈伤诱导和分化率分别为80%和81%。取材时间对愈伤诱导影响不大，拓展了转化外植体的取材范围。2．初步建立了多年生黑麦草的遗传转化体系(1) 对愈伤组织进行除草剂Glufosinate的敏感性试验，确定了两轮筛选阶段的选择压的浓度，分别为1.2mg/L和1.7mg/L。(2) 以成熟胚为外植体建立多年生黑麦草的遗传转化体系 以一个月左右的愈作组织为转化受体，经基因枪轰击后恢复培养7天，经过两轮各20天愈伤组织筛选（各20天），抗性愈伤转入分化筛选培养基，经过1个月左右陆续有再生苗长出，将再生苗转入生根培养基，长出壮根后移栽。经PCR和PCR-Southern杂交证明bar和P5CS两个基因均已整合于黑麦草基因组中。bar基因遗传转化率为0.72%,共转化频率为27.8%。(3) 以幼穗为外植体建立多年生黑麦草的遗传转化体系以50天左右的愈作组织为转化受体，经基因枪轰击后恢复培养7天，经愈伤组织筛选，愈伤转入分化筛选培养基，分化时间持续3个月，陆续有再生苗长出，经PCR检测，证明只有bar 基因整合于黑麦草基因组中，bar基因遗传转化率为2.7%。
魏树强, 钱永强, 刘俊祥, 孙振元[6]2015年在《多年生黑麦草再生体系的建立》文中提出以多年生黑麦草‘高帽2号’(Lolium perenne‘Top Hat 2’)颖果为外植体,分别研究了胚端半粒颖果、纵切的胚端半粒颖果、胚端颖果小块、颖果小块这四种外植体处理方式与氯化汞、次氯酸钠两种表面灭菌方法对其愈伤组诱导的影响;利用两因素(2,4-D和6-BA)随机区组试验设计研究了不同植物生长调节物质及其浓度配比对外植体愈伤组织诱导的影响;利用叁因素(NAA,6-BA和ZT)四水平正交试验设计研究了不同植物生长调节物质及其浓度配比对不定芽诱导的影响;研究了0.10 mg·L-1的NAA和IBA分别对不定根诱导的影响。结果表明:相同条件下,以饱满胚端半粒颖果为外植体,75%酒精表面灭菌1 min后,再用含1 m L·L-1Tween 20的次氯酸钠溶液(有效氯含量>10%)处理30 min,愈伤组织诱导率最高;适宜的愈伤组织诱导培养基为MS+5 mg·L-12,4-D+0.03 mg·L-16-BA(p H=5.8),诱导率达68.7%,获得的高质量愈伤组织;不定芽诱导培养基为MS+0.5 mg·L-1NAA、0.5 mg·L-16-BA+0.9 mg·L-1ZT,不定芽诱导率最高,为56%;不定根诱导培养基为1/2MS+IBA培养基时,根系粗壮,诱导生根率为90%。该研究建立了多年生黑麦草高效组培再生体系,为高效基因工程育种的开展奠定了良好基础。
张艺[7]2007年在《燕麦遗传转化体系的建立和披碱草再生体系的建立》文中提出本文拟研究燕麦(Oat)的组织培养及其植株再生，建立它们的遗传转化体系，通过根癌农杆菌EHA105介导，把来自类产碱假单胞菌的杀虫毒蛋白基因PPIP转入燕麦，培育出具有抗虫能力的牧草新材料；研究短芒披碱草(Elymus breviaristatus)的组织培养及其植株再生，为将PPIP基因转入短芒披碱草作好准备。建立了短芒披碱草的胚性愈伤组织诱导和再生体系。研究结果表明：外植体来源，和植物生长调节剂组合等是影响愈伤组织诱导和植株再生的主要因素。分析比较了短芒披碱草成熟胚，下胚轴和幼叶叁种来源的外植体，其中成熟胚的出愈率最高，平均达到了47.82％。短芒披碱草愈伤组织诱导的最适培养基均为MS培养基，最佳的激素组合为5mg／L 2，4-D+0.05mg／L KT+2mg／LABA。同时发现添加1mg／L左右的酪蛋白水解液能够明显提高愈伤组织的生长质量，可以改善愈伤组织的质量，提高愈伤组织的分化能力。继代培养时间对愈伤组织的分化有很大影响。从成熟胚诱导的愈伤组织分化能力最强，可以达到48％左右。短芒披碱草最佳分化培养基是1／2MS基本培养基无机盐+B5有机物+NAA0.5mg／L+KT0.01mg／L。优化了燕麦861再生体系：分析比较了该品种成熟胚，下胚轴和幼叶叁种来源的外植体，其中成熟胚的出愈率最高，平均达到了64％。燕麦草愈伤组织诱导的最适培养基均为MS培养基，最佳的激素组合为4mg／L 2，4-D。从成熟胚诱导的愈伤组织分化能力最强，可以达到54.3％左右。燕麦最佳分化培养基是1／2MS基本培养基无机盐+B5有机物+0.1mg／LKT和1.0mg／L6—BA。建立了燕麦抗性愈伤组织的筛选方案。较好的筛选剂是潮霉素，45mg／L潮霉素浓度可较好的燕麦愈伤组织的筛选。确定使用成熟胚诱导出来的愈伤组织作为基因转化的材料，并通过根癌农杆菌介导，把类产碱假单胞菌的杀虫毒蛋白基因ppIP转入继代40d后的愈伤组织，用潮霉素筛选抗性愈伤组织，最后再生分化出抗性植株，筛选培养基配方为：MS+2，4-D5.0+KT0.05+Hn45+Carb500。实验所用质粒为PCAMBIA1304双元载体，其上有kam，hpt，gus和mGFP等基因，用特定的酶切去gus和mGFP基因，然后把杀虫毒蛋白基因ppIP连接上去。构建好的质粒转入根癌农杆菌EH105，然后浸染已经处理好的愈伤组织。农杆菌浸染后的愈伤组织培养在共培养基上，共培养6d后，转入筛选培养基筛选抗性愈伤组织，共培养基配方为：1／4MS+2，4-D5.0+80μMAS pH5.6最后通过PCR，RT-PCR来检测杀虫毒蛋白基因是否转入再生植株。愈伤组织的继代时间，农杆菌液的浸染浓度，共培养的时间和温度等因素都要影响农杆菌的转化。本实验对这些影响因素进行了优化，建立了燕麦转基因操作体系。
王宇[8]2014年在《几种牧草再生体系和遗传转化体系的优化》文中研究表明紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种优质的豆科牧草,在我国已有两千多年的栽培历史,由于其具有适口性强、营养丰富、产草量高等优点,素有“牧草之王”的美誉。苜蓿在畜牧业中占有很重要的地位,利用基因工程技术来提高苜蓿的抗逆性及改良其品质,期望获得优良新品系,这对我国畜牧业的发展有着极其重要的现实意义。老芒麦(Elymus sibiricus)和垂穗披碱草(E. nutans)都是禾本科披碱草属多年生草本植物,具有对土壤要求低、抗寒、抗旱和耐盐碱等特性,是具有较高经济价值的栽培牧草。利用基因工程技术来培育能够满足不同生产需求的优质牧草,对推动我国畜牧业的发展具有重要意义。然而目前关于老芒麦和垂穗披碱草组织培养的有关报道较少,其组培再生体系的建立还处于探索阶段。本研究借鉴了多年生黑麦草(Lolium perenne)、高羊茅(Festuca arundinacea)和羊草(Leymus chinensis)等重要牧草组织培养的有关文献资料,以老芒麦和垂穗披碱草幼穗为外植体初步建立了两种牧草的组织培养再生体系。1.紫花苜蓿再生体系的建立及GUS基因转化的研究本研究以紫花苜蓿“中苜1号”作为转化受体,在以子叶为外植体转化苜蓿的过程中,建立了紫花苜蓿组织培养再生体系,为苜蓿转基因研究工作打下了良好的基础。在此基础上,将报告基因GUS通过农杆菌的介导,转化到“中苜1号”中,得到了疑似Kan抗性植株。主要研究内容如下：1)再生体系的研究。分别以子叶和下胚轴作为外植体,通过实验比较发现,两种外植体的愈伤诱导率都比较高,但是子叶的分化能力较好,更适合作为转化受体；选择UM+2.0mg/L2,4-D+0.25mg/L KT为最佳愈伤诱导培养基；UM+2.0mg/L KT作为最佳愈伤分化培养基；1/2MSo作为最佳生根培养基。2)根癌农杆菌介导的GUS基因转化“中苜1号”遗传转化体系的建立。将苜蓿6日龄幼苗子叶外植体预培养3d,将其浸入OD600值为0.5的农杆菌中振荡侵染10min,共培养3d,之后转入含有500mg/L Cef抗生素的培养基上进行除菌培养(每继代一次将Cef浓度降低100mg/L),待胚性愈伤形成后将其转入含有50mg/L Kan培养基上进行筛选培养,最后在1/2MSo培养基上生根成苗。3)转化再生苜蓿的获得及PCR鉴定。经筛选,得到26株疑似Kan抗性植株,经PCR检测,全部表现为假阳性。2.老芒麦、垂穗披碱草组织培养再生体系的研究在本研究中,以老芒麦和垂穗披碱草的2-3mm幼穗切段为外植体,初步筛选出最佳的老芒麦幼穗的愈伤诱导培养基为MS+2.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂,最适于垂穗披碱草幼穗的愈伤诱导培养基为MS+3.0mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂；最佳诱导二者愈伤分化的培养基为MS+1.0mg/L KT+1.0mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L琼脂；对于植株非常有效的生根培养基为1/2MS。最终得到老芒麦再生植株10株和垂穗披碱草再生植株2株。
曾庆飞, 韦鑫, 蔡一鸣, 舒健虹, 吴佳海[9]2017年在《过表达FaSAMDC基因提高黑麦草属植物的抗旱性和耐热性》文中进行了进一步梳理主要探讨了在黑麦草属植物中导入高羊茅S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因(FaSAMDC)对转基因植株抗旱耐热性的提高效果,为培育黑麦草抗旱耐热新品种提供种质新材料。选择黑麦草成熟种子为外植体,采用贵州省草业研究所分子生物学实验室构建的过表达载体以及黑麦草胚性愈伤组织高频植株再生和农杆菌介导的遗传转化体系,将克隆自高羊茅的FaSAMDC基因转入贵州地区主栽品种多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季的基因组内,经抗性筛选、PCR检测和Southern杂交分析验证,获得45株特高与44株四季的转基因植株,转化频率分别为2.93%和2.28%。抗旱耐热试验表明,在30℃高温和中度干旱胁迫条件下,特高转基因株系的根冠比比对照组培苗高出7.08%,叶片相对含水量(RWC)比对照高出13.12%,RWC降低幅度比对照少5.49个百分点;四季转基因株系的根冠比比对照组培苗高出6.54%,RWC比对照高出12.54%,RWC降低幅度比对照少6.50个百分点,差异均达到显着水平(P<0.05),证明转入FaSAMDC基因的黑麦草阳性株系的抗旱耐热能力得到了明显提高。形态与生长特征观测结果显示,与非转基因组培苗相比,转基因株系的叶长、株高、主茎节数减小,叶宽、单株分蘖数增加,叶色变深,植株形状趋向于叶片丛生的紧凑型,推测导入的FaSAMDC基因参与了基因表达、细胞分裂等生理功能的调节。
蔡能[10]2008年在《外源bar+nas双价基因转化多年生黑麦草的研究》文中研究说明多年生黑麦草(Lolium perenne L.)不仅是一种优质牧草,更是一种常用的观赏型和运动型草坪草种。针对草坪杂草难以防除和冷季型草坪草抗旱性差、绿色期短的不足,该研究以多年生黑麦草常用品种爱神特、卡特等为材料,建立并优化了多年生黑麦草高频离体培养再生体系、农杆菌转化技术体系和拟转化子的筛选方案,通过农杆菌介导法将外源双价抗除草剂基因——草丁膦抗性基因(bar)和抗旱基因——烟碱酰胺合成酶基因(nas)导入多年生黑麦草中,得到了具有抗除草剂和抗旱两种抗性的多年生黑麦草转基因植株。主要研究结果如下:1.建立并优化了多年生黑麦草胚性愈伤组织诱导与分化的培养条件研究结果表明,含胚的半粒种子是诱导愈伤组织较为理想的外植体,其平均愈伤组织诱导率可达86%,其愈伤组织分化率可达85%;MS培养基是绝大多数多年生黑麦草愈伤组织的最适诱导与继代培养基;随着2,4-D浓度的增加,愈伤组织诱导率上升,8.0 mg/L较为适合;为避免高浓度2,4-D对愈伤组织生长及再分化的伤害,愈伤组织继代培养时可适当降低2,4-D浓度;继代培养基中添加25g/L的甘露醇可以有效地改善愈伤组织的生长状态,促进胚性愈伤组织的形成;MS培养基上诱导的丛生不定芽较粗壮,NB培养基上诱导的丛生不定芽较细密。具体操作方式为:胚端半粒种子于MS+2,4-D 8.0 mg/L(或另添加甘露醇25g/L)上诱导愈伤组织;愈伤组织接种于MS+2,4-D 4.0mg/L+甘露醇25 g/L上进行1-2次继代后于NB+6-BA2.0 mg/L上进行分化;不定芽转接至MS+6-BA2.0 mg/L上进行扩繁或于1/2MS+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/L上进行生根。2.将外源bar+nas双价基因导入多年生黑麦草中获得了转基因植株构建了bar+nas双价基因植物表达载体(EHA105—p3301-gus-nas,LBA4404—p3301-gus-nas),并进行了nas基因的原核表达和多克隆抗体制备,为多年生黑麦草的转化和检测提供了材料。优化了多年生黑麦草愈伤组织农杆菌转化方法。实验结果表明,根癌农杆菌EHAl05菌株对多年生黑麦草的转化效果优于LBA 4404菌株的转化效果;在转化之前一直将受体愈伤组织在含甘露醇的培养基上继代培养可提高受体材料的质量;在共培养过程中采用浸泡共培养基的滤纸代替固体共培养基,既能增强抑菌效果,又可维持愈伤组织状态,提高转化频率,还可简化操作程序。选用Basta作为筛选剂对多年生黑麦草抗性愈伤组织和抗性植株进行筛选,其适宜的筛选浓度为7.5-10mg/L,其筛选时间以40-60天为宜。获得了转基因多年生黑麦草植株。应用本研究所建立的农杆菌转化系统,将bar基因和nas基因导入多年生黑麦草愈伤组织,经筛选剂筛选获得20株抗性植株。通过对部分植株进行PCR,RT-PCR和Western blot杂交等分子检测的结果表明,外源目的基因已整合进了多年生黑麦草转化植株基因组。3.进行了除草剂抗性和抗旱性鉴定经叶面喷施除草剂溶液,转基因植株具有不同程度的抗性,抗性最高可达150-200mg/L Basta。通过反复干旱法,发现转基因植株抗旱性得到增强,整体观感较好;而未转化株经过长期的反复干旱,失水严重,最后死亡。在自然干旱条件下,对转基因植株和未转化株生理生化指标进行了测定,结果表明:转化株土壤保水能力、植株增长速度、根生长速度、叶片相对水含量、叶绿素含量均高于未转化株;丙二醛含量、脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性、过氧化氢酶活性、叶片水势和叶片外渗溶液相对电导率的变化规律表明转基因植株与未转化株相比,抗旱性得到增强。
参考文献：
[1]. 多年生黑麦草组培再生体系的研究[D]. 陈季琴. 北京林业大学. 2004
[2]. 原种黑麦草组培再生体系建立初探[J]. 郑若男, 阮以勒, 郑双双, 杨志红. 安徽农业科学. 2013
[3]. 多花黑麦草特高和多年生黑麦草四季高频组培再生体系的优化与建立[J]. 曾庆飞, 韦鑫, 陈锡, 陈光洁, 马培杰. 草业科学. 2017
[4]. 多年生黑麦草转基因育种研究进展[J]. 陈季琴, 韩烈保. 草业学报. 2004
[5]. 基因枪轰击法获得转P5CS基因黑麦草植株[D]. 杨成民. 内蒙古农业大学. 2004
[6]. 多年生黑麦草再生体系的建立[J]. 魏树强, 钱永强, 刘俊祥, 孙振元. 广西植物. 2015
[7]. 燕麦遗传转化体系的建立和披碱草再生体系的建立[D]. 张艺. 四川大学. 2007
[8]. 几种牧草再生体系和遗传转化体系的优化[D]. 王宇. 兰州大学. 2014
[9]. 过表达FaSAMDC基因提高黑麦草属植物的抗旱性和耐热性[J]. 曾庆飞, 韦鑫, 蔡一鸣, 舒健虹, 吴佳海. 草业学报. 2017
[10]. 外源bar+nas双价基因转化多年生黑麦草的研究[D]. 蔡能. 湖南农业大学. 2008
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