郑磊[1]2000年在《新型骨基质材料复合骨髓基质干细胞体内外成骨能力的组织工程研究》文中研究说明【目 的】理想的骨基质材料的选择和研制是骨组织工程研究中的重要领域。由于目前单纯生物类材料、无机陶瓷类材料和有机聚合物类材料均不能满足要求，研制复合类新型材料便成为组织工程学者面临的重要而紧迫的任务。 基于此，我们研制出一种有机-无机复合类多孔块状新型骨基质材料（NBM），并对NBM的体内外成骨能力进行了初步研究。我们还针对组织工程中细胞与材料间粘附这一重要问题，建立检测细胞与多孔生物材料粘附的方法并试图寻找促进细胞粘附特性的有效手段。 本课题研究的主要目的是：（1）初步检测NBM与骨髓基质干细胞（BMSC）体外复合培养时的生物相容性；（2）探讨碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对BMSC与NBM粘附特性的影响；（3）观察NBM复合BMSC体内植入后的成骨能力。 【方 法】（1）NBM与BMSC生物相容性检测：应用组织培养技术，对体外复合培养的兔骨髓基质干细胞和NBM等骨基质材料，进行形态学观察、细胞增殖、细胞蛋白与碱性磷酸酶（ALP）测定；（2）NBM与BMSC的粘附特性研究：建立细胞与多孔生物材料粘附特性检测的方法，研究不同浓度bFGF诱导细胞后细胞粘附特性的改变；（3）NBM与BMSC复合体内植入成骨能力检测：选择新西兰兔为实验动物，对细胞-材料复合体植入体内不同时期的骨形成情况，进行大体观察和组织学观察。 【结 果】（1）NBM对BMSC的体外增殖和ALP的表达无明显抑制作用；（2）BMSC可以在NBM上发生良好的粘附、增殖，并能长入材料的孔隙内，分泌大量细胞外基质；（3）改良荧光法是一种简便可行的检测细胞与多孔生物材料粘附的方法；（4）10ng/ml浓度的bFGF诱导BMSC后，可以明显提高细胞与基质材料间的粘附率，1000ng/ml浓度bFGF诱导后对BMSC粘附特性无明显影响。（5）NBM与BMSC复合肌内植入4周左右可见大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，8周左右未见新生骨组织；（6）生物活性玻璃陶瓷（BGC）与BMSC复合肌内植入8周左右可产生新生骨组织，成骨过程中未见软骨形成。（7）NBM具有比 BGC更优良的主物降解性。l ［结 论】（）NBM是一种新研制的有机－无机复合类骨基质材料，l 具有网状孔隙结构；NBM于燥状态下具有一定机械强度；NBM在材料 l 结构等方面基本达到骨基质材料的设计理想；（二）NBM经过适当处理，I 在体外有良好的生物相容性，对 BMSC粘附、增殖和分化无明显阻滞作 l 用；（3）一定浓度的 bFGF诱导 BMSC后，可以提高细胞粘附率，其最 D 佳有效浓度为 10 ＂g／ml： N）NBM表现出一定的免疫原性，与 BMSC复 合植入体内后，可5；起以大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润为主要特征的细D 胞免疫排斥反应；（5）组织工程化组织中基质材料的移植免疫问题应引 l 起研究者的重视；“）NBM在体内有良好的生物降解性：门）BGC有1 良好的生物相容性，与 BMSC复合植入体内可产生组织工程化新生骨组 l 织，但降解性能差。
周大利[2]2003年在《磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究》文中提出骨组织工程复合材料至少包括两个最重要的组成部分：支架材料和种子细胞(或者因子)。种子细胞通过体外和体内增殖、分化和分泌胞外基质构建新的骨组织，骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)能够异位诱导间充质细胞分化为软骨和骨细胞，支架材料提供新骨组织形成所需的临时空间和力学支持。因此种子细胞及因子的选择、扩增和支架材料的研制是骨组织工程的关键。本文进行了BMP/α-TCP骨水泥、rhBMP-2/β-TCP陶瓷、兔骨髓基质细胞/β-TCP陶瓷、β-TCP/PLLA与大鼠骨髓基质干细胞复合及β-TCP/PLLA与大鼠骨膜成骨细胞复合几个体系骨组织工程复合材料的研究。 本研究首先开发了制备高性能的β-磷酸三钙(tricalcium phosphate，TCP)、α-TCP超细陶瓷粉及高性能多孔β-TCP陶瓷新工艺。将自制高纯、超细CaCO_3用去离子水调和成浆料加入到分析纯磷酸配制成的一定浓度的磷酸溶液中反应，配料按Ca/P原子比为1.50。反应在搅拌和超声波震荡下进行，并在十分钟内完成，制得组成为Ca_3(PO_4)_2nH_2O的TCP前驱体沉淀，该沉淀粒度细(0.8-几μm)而均匀，过滤性能优良，固液能快速分离。在1170℃下煅烧TCP前驱体制备β-TCP超细陶瓷粉料，在1230℃下煅烧TCP前驱体制备α-TCP超细陶瓷粉料。TCP前驱体沉淀用3％PVA溶液作粘结剂，20-30目的柱状硬脂酸作成孔剂，经压模成型、干燥、在1170℃下煅烧制得高性能多孔β-TCP生物陶瓷。研究表明，CaCO_3粒度对TCP前驱体粒度、陶瓷的孔隙率、抗压强度以及溶解速度均有影响，根据临床应用需要可以通过选用不同CaCO_3粒度及致孔剂形状大小来调节陶瓷的孔隙率、孔结构，以控制陶瓷强度和溶解速度。 该新工艺制备的高纯微细α-TCP粉体具有优良的凝结性能和水化性能。自制高纯微细磷酸氢钙(DCP)、Cao(ds。分别为1.72和1.2 pm)为辅配料，摩尔比为:a一TCP:DCP:CaO=0.95:0.025:0.025，用0.25M NaHZP04/NaZHP04混合液调和，其初凝时间为7分钟，终凝时间为35分钟，在Hank’s溶液里浸泡5天其抗压强度可达到35MPa，达到了颅骨修补材料的强度要求。用Uri St法自小牛长管状骨中提取部分纯化的活性BMP，将BMP与a一TCP固相粉体按比例混合均匀后再与液相反应，制成BMP含量不同的BMP/a一TCP磷酸钙骨水泥复合材料。分别采用单纯a一TCP和BMP含量不同的BMP/a一TCP修复成年兔较大颅骨缺损，4周时可见BMP/Q一TCP材料内大量类骨组织生成并见少量钙沉积;8周时新骨量增加，钙化更多、强度明显增加;16周骨组织进一步成熟，骨缺损由新骨桥连修复。而a一TCP组8、16周时骨生成量和强度均低于BMP/Q一TCP，骨缺损区未形成新骨桥连，但软组织量却明显多于后者。16周时BMP/Q一TCP和Q一TCP的材料吸收量基本相等。 本研究将多孔p一TeP和重组人的骨形成蛋白一2(recombinant human bonem6rphogenetie proteins一2，rhBMP一2)复合，制得rh朋P一2/p一TCP复合人工骨材料，将其植入小鼠肌肉内，观察复合物的骨诱导和降解能力。72小时可见幼稚软骨，1周见成熟软骨，2周编织骨和少量板层骨，3周和4周成熟的板层骨生成，对照组则无骨或软骨生成。2周开始间充质细胞和纤维组织长入材料，3~4周将材料包裹分割，同时可见多核巨细胞反应及吞噬现象，这些是降解早期组织学改变。 兔骨髓基质细胞(MSC)在本研究制备的多孔p一TCP表面贴壁生长状态良好，并合成大量胶原纤维，胶原的合成量也较多，表明本研究制备的D一TCP载体具有良好的生物组织相容性，可将p一TCP载体复合MsC制得BMP/p一TCP复合材料，应用于骨组织工程。 本论文采用溶液浇铸一模压成型一沥滤三步法研制成具有一定孔隙率、孔径的B一TCP/PLLA多孔复合材料，详细地研究了材料的组成和孔隙率等因素对该复合材料力学性能的影响。结果表明:B一TCP/PL以多孔复合材料的压缩强度和模量随孔隙率的增加而大幅度的降低。低孔隙率(小于70%)时，可以通过改变材料的成分比例和p一TCP的粒径来改善材料的力学性能。而高孔隙率时，材料的力学性能较差，且基本不受成分比例和p一TCP的粒径影响。体外和体内实验表明，经成骨诱导的骨髓基质细胞和骨膜成骨细胞在B一TCP/PLLA多孔复合材 II料能够粘附、增殖、分化，表现出正常的生化功能。B一TCP/PLLA多孔复合材料具有成骨传导性，是骨组织工程支架材料的较好选择。而相对与成骨细胞来说，经成骨诱导的骨髓基质细胞是种子细胞的较好选择。因此可以认为:以B一TCP/PLLA多孔复合材料为细胞支架、经成骨诱导的细胞为种子细胞的复合材料是新型的骨组织工程骨缺损修复材料。
方滕姣子[3]2016年在《双重递送miRNA-2861和FK506的PLGA/Gelatin复合电纺纳米纤维支架促骨再生的研究》文中认为背景:由于外伤、肿瘤、炎症等多种原因导致的颌面部骨缺损或骨量不足,不仅影响患者咀嚼、发声和美观,还对患者的身心健康和生存质量产生了严重影响。因此,如何治疗骨缺损从而达到更好的骨组织修复和再生目的是国内外众多学者一直致力于研究的热点。近年来,随着骨组织工程学的蓬勃发展,各种满足不同临床需求的新型生物医用支架材料层出不穷。然而,骨损伤的微环境因受炎症、低氧和高乳酸盐等多种因素的影响变得十分复杂,但传统的生物工程支架只依赖于递送单一的基因或药物对骨损伤处发挥修复作用,这也就解释了目前很多治疗骨缺损策略其最终治疗效果欠佳的原因。采用静电纺丝技术制备的纳米纤维支架不仅具有独特的小尺寸效应和表面效应,且交错的纳米纤维排列结构类似于天然细胞外基质,有利于细胞黏附并促进细胞增殖及分化,是递送基因或药物的理想的支架材料。因此,基于骨损伤的微环境及愈合过程,通过有针对性地递送多种生物活性因子作用于局部骨缺损,可能会缩短修复周期达到更好的骨再生效果。目的:利用静电纺丝技术制备PLGA/Gelatin复合纳米纤维支架,通过局部递送具有促成骨细胞分化作用的mi RNA-2861,以及能够抑制骨愈合中不良炎症反应的FK506,使两者协同发挥修复骨缺损、促进骨再生的功能。材料与方法:用聚乙烯亚胺(PEI MW=1800)作为mi RNA-2861的载体转染骨髓基质细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)。利用RT-PCR技术检测BMSCs中mi RNA-2861和成骨相关基因的m RNA表达,并进行茜素红染色。首先用MTT细胞增殖试验筛选FK506的最佳作用浓度;利用ALP(碱性磷酸酶)技术和RT-PCR检测炎症条件下,FK506对BMSCs成骨相关基因表达的影响;利用茜素红染色确定炎症条件下FK506对BMSCs成骨分化能力影响。采用静电纺丝技术制备PLGA/Gelatin电纺纳米纤维支架,利用扫描电镜对支架的表面形貌进行表征,通过吸水率和接触角方法检测支架的亲水性和机械性能;将FK506混入纺丝液中制备出载药的PLGA/Gel支架,根据静电吸附作用将PEI/mi RNA复合物吸附于纤维膜空隙中,置入冻干机获得载mi RNA和FK506的PLGA/Gel复合电纺支架,分别检测基因和药物从支架上的释放情况。最终制备载FK506/mi R-2861的复合纳米纤维支架,分别进行体外和体内实验,检测该支架对骨髓间充质干细胞成骨向分化的作用及在大鼠颅骨缺损模型中的骨再生能力。结果:RT-PCR和茜素红结果显示,PEI/mi RNA复合物能明显促进成骨相关基因的表达水平,增加钙结节形成。MTT细胞增殖检测表明不同浓度的FK506对细胞无明显毒性,100n M的FK506表现出轻微的促细胞增殖作用;RT-PCR、ALP和茜素红染色结果均显示,FK506在单独使用和炎症环境中,均表现出促进BMSCs细胞成骨相关基因的表达,增强相对ALP酶活力和促进基质钙盐沉积这一系列特征性成骨指标。扫描电镜结果显示,PLGA/Gelatin静电纺丝表面光滑,纤维相互交错形成三维网络状,且交联后仍保持较好的孔隙率和表面形貌。用Ribo Green试剂盒检测mi RN A释放,结果表明mi RN A从支架上早期快速释放,3小时快速释放31%,到7天时mi RN A约释放了61%,至14天时仍有mi RN A释放。由于FK506包裹在纺丝中,因此该药物释放随着支架材料的降解能逐渐释放并一直持续到30天左右。载FK506/mi R-2861的PLGA/Gel纳米纤维支架在体内外均具有显著的成骨诱导活性,能促进BMSCs细胞成骨分化并促进骨组织再生,此外该复合支架发挥的协同成骨作用优于任一单载支架。结论:通过制备PLGA/Gelatin静电纺丝纳米纤维支架,能够有效递送mi RNA和FK506,使其协同发挥促进成骨细胞分化作用的同时减轻局部炎症反应,达到修复局部骨缺损、促进骨再生的目的。
郑磊, 王前, 裴国献, 马建标, 王亦农[4]2002年在《复合新型骨基质材料体内外成骨能力的组织工程研究》文中指出为评价一种新型无机 有机复合骨基质材料 (newbone matrixmaterial,NBM)的体内外成骨能力 ,取骨髓基质干细胞来源的成骨细胞与材料进行体外复合培养 ,复合体再行肌内植入 ,通过相差显微镜、扫描电镜以及组织学观察体内外成骨情况。结果发现 ,体外培养时成骨细胞与材料可发生良好的粘附、增殖 ,并分泌大量细胞外基质成分 ,而细胞 材料复合体肌内植入后 4周可见大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润 ,8周仍未见新生骨组织生成。作者认为NBM的这种体内外成骨能力的差异可能与NBM具有免疫原性 ,引起宿主免疫反应 ,从而丧失体内成骨环境有关
徐展望[5]2009年在《中药调控种子细胞复合生物材料修复骨缺损的实验研究》文中认为目的:各种原因引起的大段骨缺损很难愈合,随着组织工程学理论与技术的发展,将具有成骨能力的种子细胞复合可降解生物材料构建成具有生命活力的组织工程人工骨移植到骨缺损处,发挥骨诱导、骨传导甚至直接成骨作用,成为这一棘手问题的新的解决方案。中医认为,骨折后如肾生养精髓不足,则无以养骨而难以愈合,中医治疗骨折促进骨折愈合,无不从补肾壮骨入手。如果能够证实补肾壮骨中药具有促进骨髓基质细胞(mesenchymai stem cells,MSC)增殖、分化或两者兼有的功能,就能从骨生长的细胞学层面上阐述这类药物的具体作用机制和靶点。通过本研究希望解答以下问题:1.中药骨碎补促进骨折愈合(接骨续筋)的细胞学机制,即是否是骨髓基质细胞—成骨细胞—骨生长—骨愈合的过程,为印证髓满骨充理论提供依据;2.中药参与培养的骨髓基质细胞特性维持的能力,即是否具有稳定增殖和传代的能力;3.中药参与培养的骨髓基质细胞能否分化为成骨细胞,即骨髓基质细胞的多潜能分化和定向分化能力的维持;4.骨碎补提取物在细胞培养过程中的量效关系;5.这种特定条件下培养的种子细胞与生物基质材料的复合是怎样的,即能否制成具有生命活性的组织工程人工骨;6.该人工骨植入骨缺损处后的成骨效能如何。一、骨碎补提取液对兔骨髓基质细胞增殖的影响方法:1.分组:实验共分五组:①空白对照组(标准培养液);②诱导对照组(成骨条件诱导培养液);③中药Ⅰ组(含骨碎补20mg/ml的培养液);④中药Ⅱ组(含骨碎补2mg/ml的培养液);⑤中药Ⅲ组(含骨碎补0.2mg/ml的培养液)。将从2月龄纯种新西兰大白兔提取的骨髓悬液分离漂洗出骨髓基质细胞,加入以上培养液中培养。结果:1.细胞生长状况中药Ⅰ组细胞贴壁数量少,生长缓慢,细胞形态细长,胞质较少,细胞萎缩脱落。空白组细胞基本呈长梭形,其他各组细胞逐渐增多,伸出伪足,呈梭形、星形、多角形等不同形状。胞浆内有较多小颗粒,核仁明显,一周左右细胞基本长满并呈集落存在。2.细胞活力及生长曲线的测定结果诱导组与空白组未见显著性差异,中低浓度提取液有促进骨髓基质细胞增殖作用,而低浓度较中浓度作用更强,高浓度提取液抑制骨髓基质细胞的增殖,还能导致其凋亡。3.细胞分裂指数的测定结果测量分裂指数记录并绘制成曲线,将贴片的细胞行HE染色,中药Ⅰ组明显抑制细胞生长,曲线低平。结论中低浓度骨碎补提取液促进骨髓基质细胞增殖,而高浓度提取液抑制细胞增殖,甚至引起凋亡,条件诱导培养液对细胞增殖的影响不明显。二、骨碎补提取液对兔骨髓基质细胞分化的影响方法骨髓基质细胞培养同上。结果1.倒置相差显微镜观察中药Ⅰ组细胞脱壁漂浮,数量明显减少,细胞边缘粗糙皱缩,核固缩,裂解。中药Ⅱ、Ⅲ组、诱导对照组细胞呈梭形、多角形,融合为单层后继续增殖成复层生长,形成多个岛状致密细胞群,中间细胞排列紧密,渐被含有高折射的空泡和深色颗粒的基质包埋形成白色钙化结节。空白对照组,融合为单层后细胞发生接触抑制,最终停止分裂增殖。2.扫描电镜观察中药Ⅱ、Ⅲ两组细胞多为单层细胞结构,细胞为梭形或多角形,带多个突起,数目不等,长短粗细各异,可见细长微丝形成细胞间的连接,细胞表面及细胞间可见钙盐结晶沉积。3.碱性磷酸酶染色中药Ⅱ、Ⅲ组和诱导组染色阳性率分别为35.6%、31.4%和72.4%,空白组仅为3.6%。诱导组与空白对照组及中药各组之间有极显著性差异(P＜0.001),中药Ⅱ、Ⅲ组与空白组之间也有极显著性差异(P＜0.001),中药两组之间无明显差异(P＞0.05)。4.Ⅰ型胶原免疫组织化学染色各组Ⅰ型胶原在细胞内和基质均有阳性染色,诱导组与空白组有极显著性差异(P＜0.001),中药Ⅱ、Ⅲ组虽明显低于诱导组(P＜0.05),但都明显或显著高于空白组(分别为P＜0.05,P＜0.01),而中药两组之间无明显差异(P＞0.05)。5.钙结节染色中药Ⅱ、Ⅲ组在每个标本上均可见到金黄色钙结节,低倍视野平均为1～2个,少于诱导组的平均3～4个,而空白组仅偶见钙结节。结论高浓度骨碎补醇提液引起了BMSCs的死亡或凋亡,不利于BMSCs向成骨细胞分化。中、低浓度骨碎补醇提液具有促进BMSCs向成骨细胞分化的作用。三、成骨细胞与多孔支架材料的生物相容性研究方法传代增殖的兔成骨细胞制成5×10~4/ml浓度的细胞悬液,置入已有支架材料的培养板中,使细胞悬液充分渗入支架材料孔隙内联合培养,8小时后加入条件培养液,其后隔日更换培养液,连续培养。结果1.倒置相差显微镜和扫描电镜观察培养7天,紧密贴附于支架表面的成骨细胞分化增殖连接成片,细胞多为梭形、三角形向周围伸出伪足,分泌的基质包绕于细胞周围,充填于支架材料周边孔隙中,可见钙结节。2.碱性磷酸酶染色培养2周钙钴法在成骨细胞的胞浆中呈现浅棕色至棕黑色颗粒。3.成骨细胞在支架材料上的成活和增殖能力测定值为0.221±0.017,对照组为0.140±0.015,(P＜0.01),表明支架有利于细胞的附着和增殖。结论成骨细胞在生物支架上分布均匀,粘附力强,并能很好地分化增殖及分泌新的骨基质,生物活性玻璃能够为种子细胞提供良好的载体和生存环境,二者生物相容性好。四、组织工程人工骨修复兔骨缺损的实验研究方法将20只新西兰大白兔分为4组,在其桡骨缺损处分别植入组织工程人工骨(Ⅰ组)、生物活性玻璃(Ⅱ组)、自体髂骨(Ⅲ组),每组6只,另2只保留骨缺损作为空白对照组(Ⅳ组)。缝合肌层皮肤包扎。术后每天肌注青霉素,连续三天,常规饲养。结果1.大体观察12周Ⅰ组骨缺损区修复良好,与正常骨无差异;Ⅱ组骨缺损初步修复,有少量连续骨痂通过;Ⅲ组骨缺损完全修复,有连续性骨痂通过骨折端,质地坚硬;Ⅳ组假关节形成。2.X线观察12周ⅠⅢ组骨缺损完全修复,可见皮质骨及髓腔形成,皮质骨厚度接近正常骨;Ⅱ组有少量连续性骨痂通过断端;Ⅳ组骨端硬化分离,形成假关节。3.组织学观察12周Ⅰ组移植颗粒间骨桥和小梁状结构已建立,髓腔进一步开通,逐步恢复自然骨的特点。Ⅱ组颗粒周围形成少量新骨,颗粒间骨桥连接不紧密,骨小梁也不明显。4.扫描电镜12周Ⅲ组已形成隆起密集的结合,Ⅰ组分界模糊过渡自然,结合部密集。Ⅱ组也有明显的修复,但不紧密。Ⅳ组全部为纤维组织,中央有裂隙。5.生物力学测试结果显示:Ⅲ组桡骨扭转强度最高,与Ⅰ组无明显差异(P＞0.05)。Ⅱ组及Ⅳ组修复效果较差,有明显差异。结论成骨细胞与生物活性玻璃复合的组织工程骨的成骨能力与自体髂骨的修复结果相似,明显优于其它组,该人工骨能很好地修复骨缺损。
常峰[6]2006年在《组织工程化人工骨修复骨缺损的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨应用兔骨髓基质细胞与生物活性玻璃联合培养构建的组织工程化人工骨修复兔桡骨缺损的效果,证明骨髓基质细胞作为组织工程的种子细胞,与生物活性玻璃复合构建组织工程化人工骨能很好地促进骨缺损的修复。方法:体外分离培养兔的骨髓基质细胞,经过传代扩增后,与生物活性玻璃联合立体培养构建组织工程化人工骨后,植入兔桡骨缺损处。通过大体形态观察、影像学、组织学及扫描电镜检查,分别与单纯植入生物活性玻璃、髂骨以及空白组进行对比,观察各组对骨缺损修复的效果。结果:植入组织工程化人工骨的兔骨缺损完全愈合,骨髓腔通畅,组织学观察见有明显的新骨生成,骨小梁连接成网状,成骨效果明显优于其他组。结论:骨髓基质细胞作为组织工程的种子细胞,复合生物活性玻璃构建的组织工程化人工骨能很好的修复骨缺损。
韩冬[7]2004年在《hBMP-2基因腺病毒表达载体体内外成骨的实验研究》文中进行了进一步梳理BMP是一组分泌型蛋白质，由于其肽链C-末端的半胱氨酸具有高度同源性，因而属于转化生长因子β超家族成员（TGF-β）。BMP在体内能够趋化、聚集间质干细胞，使其增殖、分化为成软骨细胞和成骨细胞，从而启动成骨的级联过程。随着分子克隆技术的出现，高度纯化的rhBMP被生产出来，从而对BMP的理化性质、成骨机制和临床应用前景有了更加深入的了解。但是，使用外源性rhBMP存在着缺乏合适的承载体，在体内降解较快，生物活性时间短等缺点。近几年来，随着基因载体系统和转移技术的日益完善，学者们开始尝试着将BMP基因导入到骨损伤部位，使具有更高生物活性的BMP在损伤部位持续、稳定表达，从而达到治愈骨科疾病的目的。其中，BMP-2具有较强的成骨诱导活性，显示了广阔的临床应用前景。由于腺病毒载体不整合到宿主细胞的染色体中，从而具有更大的安全性和非长期表达的特点，这正适合骨科疾病短期治疗的需要，加之腺病毒载体具有很高的转染效率而被学者们广泛采用。BMSC位于骨髓的基质细胞系中，分裂增殖能力强，可分化为成骨和成软骨等多种结缔组织细胞，易于被外源基因转染且表达稳定，是基因治疗的理想靶细胞之一。成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，在体内分布广泛，取材方便，易行培养，分裂增殖迅速，是骨折后参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分，因此也是一种比较理想的种子细胞。本实验在成功构建AdBMP-2的基础上，在体外实验部分，探讨了AdBMP-2分别转染兔BMSC和小鼠L929成纤维细胞后对其生物学变化的影响，hBMP-2基因在mRNA水平与蛋白质水平的表达情况以及两种细胞经AdBMP-2转染后是否向成骨细胞方向分化及其分化机制。在体内实验部分，采用了In vivo的方法，将AdBMP-2直接注射到裸鼠后肢肌群，评价AdBMP-2<WP=124>的成骨能力，并探讨AdBMP-2在体内诱导成骨的机制和利用基因转移技术构建组织工程骨的可行性，从而建立一个利用AdBMP-2构建组织工程骨的方法。在本实验中，采用了密度梯度离心法和贴壁法自兔胫骨骨髓中获得了原代BMSC，并经多次传代进一步纯化后，应用AdBMP-2病毒液转染BMSC（MOI=100）,MTT法和流式细胞仪等检测转染后细胞生物学变化，并在同等条件下转染Adβgal以确定其转染效率。AdBMP-2转染兔BMSC后7d，采用原位杂交和免疫组化法测定hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达；采用原位杂交法检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF等mRNA的表达；免疫组化法检测OC和Ⅱ型胶原的蛋白质表达；钙钴法检测细胞内ALP的表达。同时，又选取了小鼠L929成纤维细胞系对AdBMP-2的成骨能力进行了评价，AdBMP-2病毒液转染小鼠L929成纤维细胞系（MOI=100），采用MTT法和流式细胞仪检测转染后细胞生物学变化，同等条件下转染Adβgal以确定其转染效率。AdBMP-2病毒液转染小鼠L929成纤维细胞7d后，采用原位杂交和免疫组化法测定hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平的表达；采用原位杂交和免疫组化法法检测Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原和VEGF等mRNA水平和蛋白质水平的表达，免疫组化法检测OC的蛋白质表达，钙钴法检测细胞内ALP的表达。在体内实验部分，用微量注射器抽取AdBMP-2病毒液（滴度为2×1012pfu/ml）30μl,分别注射到裸鼠左后肢一侧股四头肌和胫骨前肌处，注射后20d、30d、60d取材，大体观察、X线片、组织学、免疫组化和原位杂交等方法评价AdBMP-2的体内成骨能力并分析其成骨机制。Adβgal（滴度2×1012pfu/ml）30μl对侧右后肢腓肠肌内注射，注射后20d、30d和60d取材观察作为对照。Adβgal（滴度为2×1012pfu/ml）30μl裸鼠右后肢腓肠肌内注射，3d后取材，X-gal组化染色检测βgal的表达以确定转染细胞类型。经AdBMP-2转染后的BMSC增殖能力未见明显改变，hBMP-2基因在mRNA<WP=125>水平和蛋白质水平都获得了强阳性表达；细胞合成Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、VEGF、OC及ALP的能力都明显增强；空白对照组细胞极少见阳性表达；X-gal免疫染色显示Adβgal的转染效率接近100％。同样，经AdBMP-2转染后的成纤维细胞的增殖能力也未见明显改变，hBMP-2基因在mRNA水平及蛋白质水平表达强阳性；细胞合成Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、VEGF、OC及ALP的能力明显增强；空白对照组细胞极少见阳性表达；X-gal组化染色显示Adβgal的转染效率接近100％。在裸鼠肌肉内直接注射AdBMP-2后20d，大体观察到左后肢注射部位软骨性和骨性隆起，较对照侧粗重，X线片下见注射部位出现高密度钙化影像，组织学观察到肌组织内软骨化骨有少量编织骨形成，原位杂交法显示间质单核细胞，软骨细胞，成骨细胞、骨细胞及周围肌肉hBMP-2、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原表达阳性；软骨细胞，间质单核细胞、成骨细胞和血管内皮细胞VEGF表达阳性，免疫组化法显示hBMP-2、Ⅱ型胶原和OC等强阳性；AdBMP-2注射后30d，注射部位骨性隆起增大，X线片下见注射部位高密度钙化结节增大，组织学观察到肌内继续软骨化骨，编织骨组织增多，并有少量板层骨形成。原位杂交法显示骨组织及周围肌肉hBMP-2、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原表达仍阳性，成骨细胞和血管内皮细胞VEGF表达阳性，免疫组化法显示hBMP-2、Ⅱ型胶原和OC等阳性；AdBMP-2注射后60d，注射部位骨性隆起较以前未明显增大，X线片下见注?
许卫兵[8]2004年在《兔骨髓基质干细胞体外培养复合β-磷酸三钙构建组织工程化骨进行胸椎后路融合的实验研究》文中认为组织工程技术为骨缺损的修复和脊柱融合提供了崭新的思路和方法。骨髓基质干细胞具有较强的自我增殖能力和多向分化潜能。 理想的骨组织工程支架材料应具有良好的生物相容性、生物降解性、多孔性和一定的机械性能，以利于细胞的粘附、生长、增殖和分化。β—磷酸三钙具有良好的生物相容性、孔隙率、孔径大小和力学强度，是良好的骨组织工程支架材料。 本实验以体外培养的骨髓基质干细胞为种子细胞为复合β—磷酸三钙构建组织工程化骨，作为自体移植骨的替代物进行脊柱融合。 目的： 探讨诱导培养兔骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的方法和技术，成骨细胞体外复合β—磷酸三钙构建组织工程化骨体内成骨能力和进行脊柱融合的效果。 材料和方法： 实验一：取健康成年新西兰大白兔红骨髓，加入DMEM标准培养液中，并加入地塞米松、β—甘油磷酸钠、维生素C条件培养液培养。通过倒置显微镜、透射电镜、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、骨钙素检测和Von Kossa钙染色等手段对获得的细胞进行生物学特性研究。 实验二：以体外培养诱导的兔成骨细胞为种子细胞，选用β—磷酸三钙为支架材料，构建组织工程化骨，分别在4周和12周取材，进行组织学检查，对其在肌肉内部成骨活性进行评价。 实验三：60只兔子按应用融合材料分四个实验组进行胸椎后路融合：Ⅰ组(组织工程化骨即β—TCP复合BMSCs)，Ⅱ组(β—TCP+自体红骨髓)，Ⅲ组(单纯β—TCP)，Ⅳ组(自体髂骨)。术后4周，每组随机选3只兔子处死行组织学检查：术后12周，处死其余动物进行放射学、组织学、手工力学检查。 结果： 实验一：体外培养条件下，骨髓基质干细胞在条件培养液中呈梭形、多角形等多种形态：早期呈集落样生长，逐渐可长满瓶壁，并可呈多层生长，无接触抑第二军医大学博士学位论文·摘要制现象，具有与成骨细胞相似的形态特征和生长特点。碱性磷酸酶染色、工型胶原免疫组化染色和Von Kossa钙染色阳性，具有与成骨细胞类似的功能性表现。 实验二:骨细胞一p一磷酸三钙复合物能够在兔肌肉内部在第4周有新骨形成，10周时新生骨盘增加。 实验三:从影像学和手工力学比较，I组的融合率高于11、I工I、IV组且有统计学差异。组织学上，I组和H组的新骨形成量较多，陶瓷微孔内部充满新生骨，但H组骨小梁形成量较I组稀疏;IH组的陶瓷微孔内部是新生骨与纤维组织混杂;IV组在椎板与移植骨的交界处有稀疏的新生骨小梁形成，在远离椎板侧可见坏死的骨小梁.结论: 骨髓基质干细胞能够向成骨细胞分化和增殖，是骨组织工程学种子细胞的理想来源，·具有广泛的应用前景。p一磷酸三钙是骨细胞的良好载体;骨细胞一p一磷酸三钙复合物具有成骨能力。p一TCP复合BMScs是脊柱融合自体骨的良好替代物。
李军[9]2004年在《骨形态发生蛋白-2转染骨髓基质细胞的生物学特性和其骨诱导修复作用》文中指出骨缺损和骨折延迟愈合不愈合一直是困扰骨科临床工作的一项难题，每年有数百万的骨缺损和骨折延迟愈合不愈合病例寻求临床治疗。通常，我们仍然应用传统的自体骨、异体骨和人工替代材料的方法解决这个临床难题。但是，自体骨来源有限并造成额外创伤，异体骨有传染疾病和存在免疫排异的潜在危险，人工替代材料在生物相容性、力学性能等方面尚存在诸多问题。自1990年起，大量的研究报告显示，骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)具有促进骨缺损修复和异位成骨的作用。骨形态发生蛋白属于转化生长因子-β超家族成员。其中，骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是骨形态发生蛋白家族中唯一能单独异位成骨和单独促进骨缺损愈合修复的骨生长刺激因子。大量研究表明其在骨科临床上用来促进骨折愈合，进行关节间融合和防止人工假体松动等方面有良好的应用前景。但是，单靠外源性植入往往不能满足骨损伤修复的需要，而且目前尚缺乏理想的载体。基因治疗作为一种新的治疗方法，与植入基因工程重组的BMP相比，理论上讲具有能够进行BMP持续的释放、避免植入载体等多方面的优点。 骨髓基质干细胞(MSCs)因其来源广泛易于获取可以成为基因治疗研究中很好的细胞载体。作为一种具有多向分化能力的前体细胞，骨髓基质干细胞(MSCs)几乎可以从鸡、鼠、兔、羊和人类的所有骨髓中提取分离出，而且，不同于造血干细胞，体外的培养扩增也相对容易。人类骨髓基质干细胞(MSCs)可以在体外的培养15代而不丧失其分化潜能第四军医大学博士学位论文和生物学特性t201。人们已经熟知骨髓基质干细胞(MsCs)具有良好的向骨、软骨、肌键、肌肉和脂肪细胞转化的潜能，这更使它成为骨组织工程种子细胞研究中的首选。 己有较多用逆转录病毒、腺病毒、质粒技术将骨形态发生蛋白(B MP)转染Mscs，局部基因治疗促进骨缺损愈合的研究报道12”261。一般认为，相对于逆转录病毒18一65%125，261，腺病毒20%的转染率[24]，质粒转染的效率较低为11%[241。但由于非病毒质粒易于制备，安全无毒，易形成规模生产，我们的实验选择非病毒的质粒介导骨形态发生蛋白一2(BMP一2)转染骨髓基质干细胞(MSCS)，研究其转染后外源基因表达情况及对骨髓基质干细胞(MSCs)成骨特性的影响，并以新西兰白兔为动物模型，研究其在活体内的成骨效应。骨髓基质干细胞(MSCs)中包括了诱导性骨祖细胞(roPC)和确定性骨祖细胞(DOPC)，后者无需诱导因子的作用本身就具备了成骨分化的能力，而前者在骨形态发生蛋白一2(bone mo印hogenetie protein一2，BMP一2)等成骨刺激因子作用下也向成骨分化[27 .30]。利用脂酷体介导的基因转染技术，将人BMP一2基因导入骨髓基质干细胞(MSCs)，使骨髓基质干细胞(MSCs)在发挥基因治疗的细胞载体的同时，利用自体分泌的活性BMP一2蛋白促进其向成骨细胞系的分化是我们实验的设计思想之一。在对人和兔骨髓基质干细胞(MSCs)体外培养扩增的过程中，我们也着重观察了不同年龄供体的骨髓基质干细胞的生长特性，为今后进一步进行以骨髓基质干细胞作为细胞载体的基因治疗研究打下基础。实验一构建真核细胞表达载体PcDNA3一hBMPZ[目的]:为了研究人类骨形态发生蛋白一2(bone mo印hogenetie protein一2，BMP一2)转染骨髓基质千细胞(MSCs)的稳定表达以及对转染后骨髓基质干细胞(MSCs)生物学特性的影响，为了进一步研究非病毒载体介导的BMP一2转染MSCs在动物体内成骨修复的作用，构建真核表达载体PcDNA3一hBMPZ。〔方法l:本实验应用基因重组技术将人类全长BMPZcDNA定向克隆到真核表达载体PcDNA3内，形成重组真核表达载体peDNA3一hBMPZO peDNA3质粒是一种由CMv为起动子的真核表达载体，第四军医大学博士学位论文除CMV作为其启动子外，在其多接头位点前还附加一高效增强子SV40，后者是能促进基因转录活性的顺式调控元件。我们用Hind川和Xbal双酶切含有人类骨形态发生蛋白一2全长cDNA的pGEM一3一hBMPZ，回收hBMPZ基因片段，将其连入经Hind川和Xbal双酶切后的真核表达载体PcDNA3，构建重组真核表达载体PcDNA3一hBMPZ。重组的真核表达载体peDNA3一hBMPZ经Hind 111和Xbal双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。[结果〕:双酶切后可形成两条带，分子量分别为1.3kb和5.38kb，符合物理图谱。[结论]:真核细胞表达载体PcDNA3一hBMPZ构建成功。实验二人骨髓基质细胞的获取、体外培养及生物学特性的观察[目的]:体外培养了不同年龄段的人骨髓基质细胞(hMsCs)，对其不同的生物学特性进行观察，为进一步了解人骨髓基质细胞作为基因转载和表达的细胞载体和可作为外源性组织细胞的可行性奠定基础。防法]:取年龄分别为4岁、38岁和58岁的三名志愿者的骼骨骨髓，以20 ml PBS混合并剪碎，以Percon氏液梯度离心，吸取中间白色的单核细胞层其中包含人骨髓基质细胞，用含100，0胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM全培养基37℃，5%COZ饱和度条件下培养，适时换液处理，清除未贴壁的血细胞，保留贴壁的骨髓基质细胞扩增培养，倒置显微镜下每
田竞[10]2004年在《转基因骨髓基质干细胞复合冻干骨组织工程骨研究》文中进行了进一步梳理由于肿瘤、炎症、外伤和发育异常等原因造成的骨缺损在临床上十分常见。骨缺损修复的过程中需要骨组织的新生，也需要组织的血管化，它是骨缺损修复的一个重要因素。目前临床常用修复骨缺损的方法有自体骨移植、异体骨移植、基质材料替代，其中自体骨移植的骨来源有限，异体骨移植和基质材料替代缺乏种子细胞支持。骨缺损修复的实验研究方法有：基质材料与种子细胞复合、基质材料与活性因子复合、基质材料与种子细胞加活性因子以及血管化复合组织工程骨的构建等，各实验都取得了一定的效果，但不十分理想。其中，基质材料尚无标准材料；活性因子，如骨形成蛋白等受多种因素的影响；血管化复合组织工程骨程序过于复杂和昂贵。 目前，深冻骨已商品化，免疫排斥反应罕见发生，故本实验以冻干松质骨作为基质材料、转染有血管内皮细胞生长因子(VEGF)的骨髓基质干细胞(BMSC)为种子细胞，这样既保持了骨组织优良的空间结构，又提供了种子细胞和血管化的刺激因子。希望能为骨缺损及缺血性骨病治疗提供实验和理论依据。 1、兔骨髓基质干细胞的体外培养 目的：在体外进行骨髓基质干细胞的培养和扩增，观察其形态学特点，为进一步研究基因转染对骨髓基质干细胞体外转化的影响和绘制生长曲线加以比较奠定工作基础。方法：贴壁法分离第四军医大学硕士学位论文兔骨髓基质干细胞，37℃，5%CO:培养箱培养，观察原代及传代细胞的生长发育情况，并绘制生长曲线;在矿化液中连续培养，观察其骨形成能力。结果:原代细胞培养第18d细胞融合成单层，长满整个培养皿;倒置显微镜下观察，矿化条件下，细胞培养30天，Von一Kassa染色显示有局灶状钙盐沉积。结论:骨髓基质干细胞易于分离培养，体外扩增速度快，在矿化条件下，骨髓基质干细胞在体外即具有很强的成骨能力，可以形成矿化结节，因而可以作为种子细胞，应用于骨组织工程。 2、逆转录病毒表达载体的构建 目的:构建高效的逆转录病毒表达载体，为下一步实验作准备。方法:将pT7Blue/hVEGF165质粒酶切获得hVEGF，65基因片段，构建peDNA3/hVEGF165并用pA317细胞包装，32oCG418培养48h。结果:获得hVEGF165基因片段并构建出peDNA3/hvEGF165逆转录病毒表达载体，经鉴定hVEGF165基因片段序列与GeneBank报道序列一致。结论:实验成功构建了pcDNA3/hVEGF165逆转录病毒表达载体。 3、vEGF在兔BMsc内的表达及其影响 目的:检测逆转录病毒介导血管内皮细胞生长因子 (hVEGFI“)基因转染兔骨髓基质干细胞(BMSC)后目的基因表达情况及促血管生成作用，为进一步将其用于血管化组织工程骨构建奠定基础。方法:构建含VEGF基因的逆转录病毒表达载体，通过感染兔BMSC使其获得稳定表达，使用免疫组化的方法检测其蛋白表达，并通过新生血管计数观察其促血管生成作用。结果:成功构建VEGF逆转录病毒表达载体，免疫组化方法显示经感染的BMSC胞质中有阳性棕色颗粒出现，且动物实验显示新生血管计数明显高于对照组(P<0.01)。结论:采用逆转录病毒介导的基因转移技术可将VEGF基因转染至BMSC中，可获得外源性蛋白的表达，且有明显的促血管生成作用。 4、转基因骨髓基质干细胞复合冻干骨体内成骨的实验研究第四军医大学硕士学位论文 目的:将转基因骨髓基质干细胞复合冻干骨后植入自体新西兰大白兔的肌袋内，观察其体内成骨的情况。方法:体外扩增兔骨髓基质干细胞，用含poDNA3/h vEGF165的病毒上清感染骨髓基质干细胞，然后将此细胞与同种异体冻干松质骨复合，将复合物植入兔竖脊肌肌袋中，以未转染的骨髓基质干细胞复合冻干松质骨和冻干松质骨作为对照。术后8周取材，通过大体和组织学观察体内骨形成的情况。结果:组织切片观察，转基因BMSC复合冻干骨组中，发现有大量纤维长入并有软骨和骨组织出现;未转基因的BMSC复合冻干骨组发现有大量纤维长入并有成骨细胞和破骨细胞出现;而单纯植入冻干骨组仅出现大量纤维长入。结论:冻干骨复合转基因骨髓基质干细胞具有良好的成骨活性。
参考文献：
[1]. 新型骨基质材料复合骨髓基质干细胞体内外成骨能力的组织工程研究[D]. 郑磊. 第一军医大学. 2000
[2]. 磷酸钙系新型骨修复复合材料的研究[D]. 周大利. 四川大学. 2003
[3]. 双重递送miRNA-2861和FK506的PLGA/Gelatin复合电纺纳米纤维支架促骨再生的研究[D]. 方滕姣子. 吉林大学. 2016
[4]. 复合新型骨基质材料体内外成骨能力的组织工程研究[J]. 郑磊, 王前, 裴国献, 马建标, 王亦农. 解放军医学杂志. 2002
[5]. 中药调控种子细胞复合生物材料修复骨缺损的实验研究[D]. 徐展望. 湖北中医学院. 2009
[6]. 组织工程化人工骨修复骨缺损的实验研究[D]. 常峰. 山东中医药大学. 2006
[7]. hBMP-2基因腺病毒表达载体体内外成骨的实验研究[D]. 韩冬. 吉林大学. 2004
[8]. 兔骨髓基质干细胞体外培养复合β-磷酸三钙构建组织工程化骨进行胸椎后路融合的实验研究[D]. 许卫兵. 第二军医大学. 2004
[9]. 骨形态发生蛋白-2转染骨髓基质细胞的生物学特性和其骨诱导修复作用[D]. 李军. 第四军医大学. 2004
[10]. 转基因骨髓基质干细胞复合冻干骨组织工程骨研究[D]. 田竞. 第四军医大学. 2004
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