王子峰[1]2003年在《转Bt基因抗虫棉种子PCR检测技术研究》文中认为本研究以当前生产上广泛使用的9个棉花品种为试材，在DNA快速提取方法、PCR反应体系、特异引物筛选叁个方面进行了研究，为转基因抗虫棉种子快速检测提供了依据。通过研究，得到如下结果： (1) 建立了可用于转基因抗虫棉检测的DNA快速提取方法：①将种子去皮、砸碎，加入10倍(ul／mg)预热(70℃)提取缓冲液(100mM Tris-HCL，PH=8.4，1.5％SDS)。②70℃水浴提取10min，取出后立即加入等体积的酚—氯仿，8000rpm离心10分钟。③取上清液1ul，用作PCR反应的模板。 (2) 建立了适用于DNA粗提液的相应PCR反应体系：循环参数为：94℃预变性2min，94℃变性40s，适当温度退火40s，72℃延伸50s，30个循环，72℃延伸5min。反应体系：2.5ul 10×Buffer，1.5ulMg~(2+)(25mM)，1ul dNTP(2.5mM)，0.2ul TaqE(5U)，0.5ul Primer(20pmol)，1ul DNA约60ng，H_2O 17.8ul，共25ul。 (3) 筛选出四对可用于转Bt基因棉检测的特异性引物： ① 35S区引物： Primer1 5’—CCATCATTGCGATAAAGGAAA—3’ Primer2 5’—GTCTTGCGAAGGATAGTGGG—3’ ② 35S区(Primer3)与Bt目的基因区(Primer4)引物： Primer3 5’—CATCATTGCGATAAAGG—3’ Primer4 5’—CTAGAGATGGCCTGGTT—3’ ③ Bt目的基因区引物： Primer5 5’—CACAGTTTCTGCTCAGCGAGTT—3’ Primer6 5’—CTGGAGTCATAGTTCGGGAAG—3’ ④ Bt目的基因区引物： 转Bt基因抗虫棉种子PCR检测技术研究 Primer7 5’－CCATACAACTGCTTGAGTAACCCAGAAGTTG、3’ ＂rimers 5’、GGGCcCGCrGAATCCAACTGGAGAGGC＊3’ （4）用建立的KR法对转基因抗虫棉样品33B、GK—l进行了检测，检测结果两样品中转基因抗虫棉所占比例分别是：94％、92％。证明所建立的检测体系是有效的。
汪巧[2]2011年在《转cry1Ac基因抗虫棉鄂杂棉1号外源插入序列分析及特异性PCR检测方法》文中研究表明转基因作物的分子结构特征既是对其进行安全性评价的基础,也是建立定性和定量检测方法的基础。本研究以转cry1Ac基因抗虫棉“鄂杂棉1号”为实验材料,探索了其外源DNA插入结构的分析方法,并对其基因组一端旁侧序列进行了初步解析;在此基础上建立了品系特异性定性PCR及定量PCR检测方法,所建立的定性定量检测方法稳定性好、特异性强、灵敏度高,各项参数满足国际转基因成分检测技术要求。得到的主要结果如下:一、解析了转cry1Ac基因抗虫棉“鄂杂棉1号”的外源DNA插入结构,并通过Genome Walking方法获得了其外源基因插入位点处基因组序列信息。获得的外源插入序列及其旁侧序列的长度为13198bp,其中1-11901bp属于外源DNA序列,11902-13198bp属于棉花基因组序列;插入片段包含1个完整拷贝的cry1Ac抗虫基因和1个完整拷贝的nptII报告基因。二、基于转cry1Ac基因抗虫棉“鄂杂棉1号”基因组DNA的一端旁侧序列,分别建立了品系特异性定性PCR及定量PCR检测方法。其中,定性PCR检测方法所设计引物对14-QF/14-F4的检测灵敏度是43个拷贝,相当于检测极限为0.1%(以模板DNA为100ng计);初步试用结果表明,该定性检测方法稳定性好、特异性强、灵敏度高,适用于“鄂杂棉1号”定性检测。定量PCR检测方法的定量限为50拷贝,检测限为不大于50拷贝,这几项参数的测试指标可以满足目前国际国内5%-0.5%的转基因成分标识阈值或检测水平的需要。通过转基因与非转基因5%和3%的混合样品的检测,发现该定量方法稳定性和准确性符合要求。通过对转cry1Ac基因抗虫棉“鄂杂棉1号”外源DNA插入结构的初步分析,初步明确了该转基因品种的分子结构特征信息,研究结果为外源基因后续研究奠定了基础,为育种材料鉴别与筛选、知识产权保护,以及转基因植物安全性评价与监管提供了科学依据和测试方法。
张京飞[3]2014年在《转Bt基因抗虫棉抗虫性研究与新品系筛选》文中提出转Bt基因抗虫棉品种的推广种植，具有显着的社会和经济效益，选育高抗、优质、高产的转Bt基因抗虫棉新品系是育种工作的重心。本研究以14个转Bt基因抗虫棉品系和对照品种中棉所8号，对各品系的抗虫性、抗病性、产量、品质、种子纯度等方面的表现综合分析，筛选出适宜参加棉花区试的转基因抗虫棉新品系，并初步探究转Bt基因抗虫棉抗虫性表现规律。主要研究结果如下：1.经多代选育，田间表型一致的转Bt基因抗虫棉新品系，田间卡那霉素检测其阳性率多数未达到100%，由卡那霉素检测为阳性的植株，用Bt基因PCR检测和Bt胶体金免疫试纸条检测，多数阳性率达到100%，还存在未达到100%的品系；14个转Bt基因抗虫棉的Bt蛋白表达都属于高表达，但不同品系间差异显着，最高表达量是最低表达量的约一倍，Bt蛋白表达量在800ng/g鲜重以上的有5个品系；转Bt基因抗虫棉不同时期其叶中Bt蛋白表达量存在差异，同一时期不同组织中Bt蛋白表达量存在差异，叶中含量高于铃中高于花中；NDP7叁个时期叶中Bt蛋白表达量均高于其它品系，NDP14、NDP2等品系叁种组织中的Bt蛋白量均较高。2.抗虫棉新品系的抗虫性室内鉴定结果表明，不同品系的抗虫性存在差异，一般Bt蛋白表达量高其抗虫性强，NDP7的Bt蛋白量表达最高，对棉铃虫幼虫的致死率达到了100%。筛选出了NDP7、NDP8等6个抗虫性表现良好的转Bt基因抗虫棉品系。3.使用24对核心引物，利用SSR分子标记技术测定14个转Bt基因抗虫棉的种子纯度，结果显示14个转Bt基因抗虫棉育种系为杂交棉，种子纯度均在85%以上。4.抗黄萎病性鉴定结果显示，无高抗品系，有两个抗病品系，多数品系属于耐病类型，NDP8品系属于感病。5.产量及其构成因素的数据分析结果显示NDP8、NDP11、NDP6、NDP4四个个品系在产量性状中表现良好。6.各转Bt基因抗虫棉品系的棉花纤维品质进行检测，由结果可知，由表可知，只有NDP6的棉纤维达到了品质优良，各指标均达到了普通优质型标准要求，其它品系综合品质较好，达到了叁型标准。7.综合考虑14个转Bt基因抗虫棉在各方面的表现，筛选出NDP2、NDP8、NDP11叁个表现优良的新品系。
王叶[4]2017年在《转化体迭加的转基因棉花cry1Ac基因表达及启动子甲基化分析》文中指出转Bt抗虫棉是我国种植面积最大的转基因作物,在我国已有20年种植历史。外源基因表达稳定性一直是转基因遗传分析和分子特征评价的重要内容,为了深入研究转Bt抗虫棉外源基因表达稳定性,本研究以保铃棉中的MON531转化体(MON531)、7S非功能插入(简称7S),以及与MON531相同载体的MON757转化体(MON757)为研究材料,分析了单个转化体插入和复合转化体插入在外源杀虫蛋白表达、mRNA转录和启动子甲基化水平上的差异,主要研究结果如下:1.以棉花基因组与插入序列的连接区为靶标,建立7S的定性、定量PCR检测方法。利用建立的方法分析了2014年我国湖北省市售的48份转基因棉花种子,有8份检测到7S非功能插入,定量PCR检测表明,其含量介于0.46%-34.39%。进一步跟踪检测表明,保铃棉531中7S非功能插入与抗虫功能性插入在遗传上不连锁。2.利用ELISA方法测定MON531、MON757、7S及其复合转化体Cry1Ac蛋白表达情况。对3个市场棉种材料研究表明,7S非功能插入不影响MON531中Cry1Ac蛋白表达;对具有相同遗传背景的纯合MON531、MON757及其复合转化体(MON531/MON757)五个阶段(亲代种子、苗期、蕾期、铃期、子代种子)Cry1Ac蛋白表达进行跟踪检测,表明MON757高于MON531,而MON531/MON757显着低于两个单一转化体(除子代种子)。3.通过实时荧光定量PCR分析了MON531、MON757及MON531/MON757中cry1Ac基因在苗期、蕾期、铃期的转录情况。结果表明,mRNA转录整体呈现先升后降的总趋势;MON757中cry1Ac基因始终处于较高水平的转录,与MON531保持大致的两倍关系;复合转化体MON531/MON757中cry1Ac基因剂量在DNA水平上较MON531、MON757增加一倍,但mRNA转录水平却显着低于单一转化体(p<0.05)。4.运用亚硫酸盐测序法(BSP)分析比较MON531、MON757、MON531/MON757全长cry1Ac基因35S启动子甲基化水平变化。结果表明,不同生育期的MON531在CG、CHG、CHH及总甲基化率变化差异小,亲代为1.0%-1.7%,苗期为4.2%-5.0%,子代为0.8%-1.3%;MON757在CG、CHG区段的甲基化率约为MON531两倍,除子代外两者在CHH区域及总甲基化水平差异较小;复合转化体MON531/MON757启动子功能区甲基化主要集中于CG、CHG,不同世代甲基化率高达55.0%以上,显着高于两个单一转化体;CpG区域分析表明,不同时期的MON531、MON757目标基因启动子均处于低水平甲基化,但两者复合后该区域呈现显着的甲基化增高。本研究针对保铃棉531中7S非功能插入建立特异性定性、定量PCR检测方法,对市场棉种进行了初测,为转基因抗虫棉安全管理提供检测技术手段;对同一转化事件的MON531、MON757、7S及其复合转化体进行目的蛋白检测,初步探索了不同转化体复合后的蛋白变化关系;从mRNA转录水平、启动子甲基化水平揭示了多基因复合后的基因沉默现象。这一研究的深入推进,可为今后新品种培育提供参考,同时也对复合转基因安全评价提出更高要求:不能仅仅局限于单一转化体安全评价,应更多的关注基因间相互作用产生的表观遗传变化。
管敏[5]2006年在《棉花arf1启动子表达的特异性研究》文中研究指明Bt抗虫转基因植物己经在生产上广泛应用。杀虫基因在植物体内定时、定量和定点表达来增强抗虫效果,这是第二、叁代植物抗虫基因工程研究及生物安全所关注的重要内容。启动子在基因表达调控中起关键性作用,它在很大程度上决定目的基因表达的时间、空间和强度。目前,植物基因工程广泛应用的启动子是组成型启动子,它们驱动外源基因在植物各种组织和所有发育阶段表达,这无疑增加了植物的代谢负担,并造成物质和能量的浪费,往往还会引起植物形态发生改变,甚至影响植物生长发育。因此,本研究对本实验室分离到的棉花ADP-ribosylation factor 1(arf1)基因启动子的功能进行鉴定,尝试在棉花抗虫基因工程研究中应用。 本研究所构建的植物表达载体pGBI121.A1Bt(A)携带棉花arf1启动子驱动cry1A基因的表达盒;植物表达载体pGBI35SBtA1Bt(B)含有两个cry1A基因的表达盒,分别由CaMV35S启动子和棉花arf1启动子驱动。对照载体pGBI121.4AB(CK)携带CaMV35S启动子驱动cry1A基因的表达盒。 将A、B及CK叁个植物表达载体利用根癌农杆菌介导法分别导入烟草,经过卡那霉素筛选,最终得到再生植株231株。转对照载体的烟草再生植株为68株,载体A的烟草再生植株为61株,载体B的烟草再生植株为102株。利用ELISA方法对阳性植株不同部位进行Bt杀虫晶体蛋白表达量测定。在烟草的蒴果中,A系的表达量是CK系的1.5倍,B系的表达量是CK系的2.4倍:在烟草的蒴果壳中,A系的表达量是CK系的1.5倍,B系的表达量是CK系的1.9倍;在烟草的花瓣中,A系的表达量是CK系的1.4倍,B系的表达量是CK系的1.5倍;在烟草的叶中,A系的表达量是CK系的0.3倍,B系的表达量是CK系的1.4倍。结果表明arf1启动子驱动外源杀虫基因在烟草的蒴果、蒴果壳、花瓣中的表达比对照CaMV35S有显着提高,而在叶中较低。并且发现这两个启动子在功能上可迭加。 进一步将上述叁种植物表达载体用花粉管通道法导入陆地棉品种Y18和P13中,共获得T_0代种子的重量分别为456.89g和2468.58g。在Y18中通过卡那霉素进行筛选和PCR鉴定,得到转对照载体的CK系转基因植株10株,A系4株,B系3株;在P13中获得A系转基因植株19株,B系8株。并用ELISA方法对阳性植株幼蕾及叶中杀虫蛋白的表达进行了初步检测,结果表明,不同植物表达载体的杀虫基因在棉花中的表达情况比较复杂,与烟草中的情况不完全一致,但数据清晰表明由arf1启动子驱动杀虫基因表达的A转基因株系的幼蕾中,杀虫蛋白的表达量显着高于对照。 本研究分析了arf1启动子在烟草及棉花中表达的特异性,验证了该启动子在植物生殖器官中具有优势表达特性,为arf1启动子应用于转基因抗虫棉研究,在棉花蕾铃中优势表达杀虫蛋白,针对性提高转基因棉花中蕾铃抗虫性的新一代抗虫棉研究奠定了基础。
许新[6]2013年在《利用SSR分子标记辅助选育转Bt基因抗虫棉》文中指出本研究以转Bt基因抗虫棉品系JR-1为外源Bt基因的供体亲本,以综合性状优良的B11和荆I5为受体亲本,建立两个回交群体,利用卡那霉素鉴定和PCR扩增鉴定目的基因,利用SSR分子标记技术和田间表型进行背景选择,以期获得具有外源Bt基因(CrylAb/Ac)、农艺性状优良的抗虫棉纯合株系。主要研究结果如下：1.对两组合的BC2F1群体利用卡那霉素筛选标记进行前景选择,结果表明,两个组合BC2F1群体卡那霉素抗性植株与非抗性植株的分离比例经卡方测验,结果为0.12和0.15(P>0.05),符合孟德尔分离定律。回交群体中抗卡那霉素的植株,与NPTII的PCR扩增检测结果相吻合。在两组合BC2F3代抗卡那霉素纯合株系中,用特异性引物扩增出抗虫基因CrylAb/Ac片段。2.从组合BllxJR-1中选出的3个抗虫纯合株系,遗传背景接近受体品种B11,遗传背景回复率为91.94%～96.77%,平均遗传背景回复率为94.09%,比理论回复率高6.59个百分点。从组合荆I5×JR-1中选出的4个抗性纯合株系,遗传背景回复率介于93.55%～96.77%,平均遗传背景回复率为95.16%,比理论值高7.66个百分点。两组合7个中选抗性纯合株系的遗传背景回复率都明显高于理论值,说明利用分子标记辅助选择可以尽快选择到遗传背景回复率较高的株系。3.组合BllxJR-1的3个中选株系与B11相比,在纤维品质上没有显着差异,不同株系在产量、铃重和单铃重性状上有显着差异,有的优于受体亲本,有的差于受体亲本。组合荆I5×JR-1的4个中选株系与受体亲本荆I5相比,在产量上没有显着差异,但个别株系在衣分、马克隆值和伸长率等指标上有显着差异。总的来说,7个中选株系中只有个别株系在少数性状上与轮回亲本有显着差异,说明这些回交改良株系在大部分性状上已经和轮回亲本具有较高的一致性了。4.两个组合的7个中选株系与各自的轮回亲本相比,产量和产量构成因素、纤维品质等方面的表现变异方向不定,以分子标记计算的遗传背景回复率的高低不能直接反应农艺性状、纤维品质的优劣。因此在育种实践中,不能仅仅依靠分子标记辅助的背景选择,还要结合植株的田间表现来提高选择效果。5.对7个中选株系进行室内抗虫性鉴定结果显示,抗虫纯合株系棉叶对棉铃虫的抗性死亡率低于供体亲本JR-1,除A4-4的幼虫死亡率低于感虫对照B11外,其余的株系的幼虫死亡率均高于各组合的感虫对照；大部分中选株系对棉铃虫的抗性表现属低抗类型,仅组合BllxJR-1的B22-1的抗性表现接近供体亲本JR-1,属中抗类型。中选株系整体的抗虫性表现一般,所选材料难以进行商业化推广。
张金龙[7]2009年在《转Bt基因抗虫棉抗虫性鉴定方法研究》文中认为棉铃虫是棉花生长发育过程中的主要害虫,常年受其危害造成的棉花减产特别严重。目前在棉花生产中,转基因抗虫棉得到了广泛的推广应用,如转Bt基因抗虫棉等。由于我国转基因抗虫棉研究起步较晚,目前还没有建立标准统一的转Bt基因棉抗虫性鉴定技术。本研究通过对国内现有转基因抗虫棉鉴定方法的比较,对鉴定指标的考察和抗虫性分级标准的划分,以期为建立易于掌握、标准统一的转Bt基因抗虫棉抗虫性鉴定技术提供参考。1.2007年利用卡那霉素涂抹法、Npt-Ⅱ的PCR检测法及Bt金标免疫检测试纸条检测法对转Bt基因材料的阳性株率进行了检测。所检测的8份材料中,只有绿亿棉11号、中长杂4138和鄂杂棉10号的阳性株率相差较大,在10%以上。方差分析结果显示,叁种检测方法之间的差异不显着,不同材料之间的阳性株率差异较大,达到极显着水平。对叁种不同方法的阳性株率的相关性分析结果显示,叁种方法的相关系数均在0.97以上,达到极显着水平。说明叁种检测方法的检测结果一致性高,而卡那霉素涂抹法在这叁种方法中最为简单、经济,可以作为转Bt基因抗虫棉阳性株率的主要检测方法。2.转Bt基因抗虫棉材料的阳性株率反映了材料本身的纯度高低。将2007年叁种方法的检测结果平均以后发现,8份材料中,除绿亿棉11号和湘杂棉10号的阳性株率较低之外,其他各材料的阳性株率均在90%以上,是合格的转Bt基因抗虫棉。2008年所测的3份材料中,亿K9F1的阳性株率为98%,广源棉980和湘杂棉10号的阳性株率较低,不足80%。3.室内生物测定法是转基因抗虫棉抗虫性的主要检测方法。2007年检测的8份材料中,接虫后5d,荆03-88和冈C04的幼虫校正死亡率大于90%,抗性级别为高抗,其他各参试材料的幼虫校正死亡率小于90%,抗性级别为抗;2008年的3份材料的幼虫校正死亡率均在60%至90%之间,抗性级别为抗。叶片平均受害等级的统计结果显示,接虫后5d,2007年各参试材料中,湘杂棉10号叶片平均受害等级在2.1～2.5之间,其他各参试材料的叶片平均受害等级均在2.0以下;2008年的3份材料中,湘杂棉10号的叶片平均受害等级为3.0,亿K9F1和广源棉980的抗性级别均小于2.5。存活幼虫发育状况的统计结果显示,接虫后5d,2007年各参试材料的存活幼虫基本都在分布在1龄和2龄,而感虫对照鄂棉24号的幼虫基本达到3龄,且数目远远大于各参试材料的存活幼虫数;2008年各参试材料的幼虫体长和体重均比鄂棉24号的小,幼虫体长减退30%左右,幼虫体重减退50%～70%。以上结果表明,接虫后5d,转Bt基因抗虫棉材料对棉铃虫幼虫有明显的抑制生长和毒杀作用。4.2008年,卡那霉素涂抹法对已知转Bt基因抗虫棉杂交组合的亲本及F_1、F_2分离群体检测结果显示,非抗虫棉亲本全部表现为阴性,转基因抗虫棉亲本及F_1全部表现为阳性,F_2群体共检测了147株,表现为转基因的阳性株数与阴性株数的比为106:31,卡方测验结果显示,分离比符合3:1,说明Bt基因为单拷贝插入,显性遗传。室内生物测定的各指标结果显示,转Bt基因亲本119和F_1的抗虫性水平基本相同,F_2分离群体中的阳性株的抗虫性水平略低于转Bt基因亲本119和F_1,反映了在分离后代中Bt基因的抗虫性在退化。5.对各考察指标的抗性级别进行赋值,综合评价结果表明,荆03-88和冈C04的综合抗性级别为高抗,湘杂棉10号两年的综合抗性级别均为中抗,其他各参试的材料的综合抗性级别为抗。
张亚玲[8]2017年在《Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫棉的抗虫性鉴定及新Bt(Cry1C*)基因在棉花上的遗传转化》文中提出据国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)统计,从1996年到2015年的20年间,全球转基因作物累计种植面积达到20亿公顷,其中,转基因棉花累计种植面积达3亿公顷。转基因作物为农户及消费者带来的利益不言而喻。转Bt基因抗虫棉的应用及推广有效地解决了棉铃虫害对棉花生产的影响。随着研究的不断深入,发现其存在几个问题:一方面,Bt基因在棉花体内的表达存在时空差异;另一方面,目前抗虫棉花品种选育普遍采用的方法是利用获得转基因应用安全证书的品种作供体,与非转基因棉花杂交,转Bt基因抗虫棉品种间Bt蛋白表达量差异较大,尤其是其杂交后代Bt蛋白的表达量差异很大,对棉花的抗虫育种造成很大困难;第叁,抗虫基因单一,现有的抗虫基因主要用于防治鳞翅目的棉铃虫(Helicoverpa armigera)和棉红铃虫(Pectinophora gossypiella),使得棉田其他害虫如甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、斜纹夜蛾(Prodenia litura)、玉米螟(Pyrausta nubilalis)等对棉花的危害逐渐加重,其中,甜菜夜蛾于2001年被列入重要害虫的潜在爆发名单。本研究测定了不同抗虫棉花品种、不同遗传背景棉花品种杂交F_1代及不同熟性棉花品种杂交F_1代棉花Bt蛋白表达量的差异,探究Bt基因在棉花中的表达及遗传规律,为抗虫棉的育种工作提供理论依据;在保证Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)基因继续发挥作用的同时,尝试将Cry1C*基因转入棉花,研究其对棉花害虫的控制效果,保证抗虫棉花的健康发展。主要结论如下:1)连续两年对6个不同抗虫棉花品种不同组织器官中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量进行测定及室内生物测定,结果表明:不同棉花品种间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量及棉铃虫幼虫校正死亡率均存在显着差异,其中冈383和鲁6269两个棉花品种Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量和棉铃虫幼虫校正死亡率均较其他几个品种高,Cry1Ab/Cry1Ac蛋白在不同品种组织中的表达规律大体相同:苗期叶片>蕾期叶片>铃期叶片>蕾期小蕾>铃期小铃;2)不同遗传背景棉花杂交F_1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显着,但与抗虫亲本相比,F_1代显着低于抗虫亲本;二代、叁代棉铃虫幼虫校正死亡率在不同杂交组合间存在显着差异,说明遗传背景对棉花的抗虫性有影响。3)不同熟性棉花品种杂交F_1代之间Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量差异不显着,但F_1代Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量显着低于抗虫亲本鲁6269;棉花熟性与各组织中Cry1Ab/Cry1Ac蛋白含量、棉铃虫幼虫校正死亡率均不存在显着的相关性,说明棉花的熟性对其抗虫性没有显着的影响。4)得到转Cry1C*基因棉花T_0代2株(能收到种子的),后续的转化工作仍在继续,T_1代阳性植株22株,初步筛选到Cry1C*-5-7、Cry1C*-5-8、Cry1C*-5-14叁个Cry1C*蛋白表达量较高,抗虫性好的植株。
赵俊侠, 陈耕, 潘转霞, 郭海莉, 夏芝[9]2018年在《一种快速批量转Bt基因抗虫棉杂交后代的筛选方法》文中研究表明Bt抗虫基因的棉花品种与高产优质抗病棉花品种作为亲本进行杂交和回交,获得大量的后代种子。种子经硫酸脱绒后,用70%酒精浸泡2 s,然后放入10%～15%H2O2消毒2～4 h,将已经消毒处理的棉花种子接种到150 mg/L的卡那霉素的培养皿或碗碟中,2～4 d后根据种子萌发长度进行抗虫筛选应用。
朱美霞, 马兴树, 韩改英, 孟庆福, 王建书[10]2009年在《抗虫棉及其杂交后代Bt基因的检测》文中进行了进一步梳理根据Bt基因序列设计特异引物,对100株抗虫棉杂交后代进行PCR扩增,获得98个Bt基因条带,Bt条带出现频率为98%;对其他10个棉花品种基因组进行Bt基因扩增,抗虫棉中棉所45出现Bt基因特异条带,除非转基因亚洲棉中出现Bt条带外,其他非转基因棉品种均无Bt基因条带。
参考文献：
[1]. 转Bt基因抗虫棉种子PCR检测技术研究[D]. 王子峰. 山东农业大学. 2003
[2]. 转cry1Ac基因抗虫棉鄂杂棉1号外源插入序列分析及特异性PCR检测方法[D]. 汪巧. 中国农业科学院. 2011
[3]. 转Bt基因抗虫棉抗虫性研究与新品系筛选[D]. 张京飞. 河北农业大学. 2014
[4]. 转化体迭加的转基因棉花cry1Ac基因表达及启动子甲基化分析[D]. 王叶. 中国农业科学院. 2017
[5]. 棉花arf1启动子表达的特异性研究[D]. 管敏. 中国农业科学院. 2006
[6]. 利用SSR分子标记辅助选育转Bt基因抗虫棉[D]. 许新. 华中农业大学. 2013
[7]. 转Bt基因抗虫棉抗虫性鉴定方法研究[D]. 张金龙. 华中农业大学. 2009
[8]. Bt(Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫棉的抗虫性鉴定及新Bt(Cry1C*)基因在棉花上的遗传转化[D]. 张亚玲. 华中农业大学. 2017
[9]. 一种快速批量转Bt基因抗虫棉杂交后代的筛选方法[J]. 赵俊侠, 陈耕, 潘转霞, 郭海莉, 夏芝. 山西农业科学. 2018
[10]. 抗虫棉及其杂交后代Bt基因的检测[J]. 朱美霞, 马兴树, 韩改英, 孟庆福, 王建书. 江苏农业科学. 2009