广东省湛江卫生学校 524037
摘要：目的：建立酶标法测定鸡骨草提取物有效成分含量的方法。方法：在单因素试验基础上，利用正交实验优化酶标法测定鸡骨草提取物含量的反应条件。结果：酶标法测定骨草提取物有效成分含量的最优组合为反应温度30℃、测定波长为510 nm、反应时间为12 min。芦丁质量浓度在0.0~0.075 mg/mL范围内与吸光度呈良好的线性关系（r =0.9991），且精密度良好（RSD=0.53%），平均加样回收率为100.13%，RSD为1.18%。结论：该方法简便、快速，是一种价廉快捷测定鸡骨草提取物有效成分含量的好方法。
关键词：鸡骨草提取物；有效成分；酶标法
【Abstract】Objective：To establish a method for the content determination of the effectiveIngredients in extracts from Abrus cantoniensis Hance.Methods：Orthogonal design was used to investigate the enzyme labeled method determination condition in extracts from Abrus cantoniensis Hance.Results：The optimal enzyme labeled method determination condition in extracts from Abrus cantoniensis Hance was the reaction temperature 30 ℃，the wavelength 510 nm and reaction time 12 min.There was a good linear relationship between the quality concentration of rutin and the absorbance in the range of 0.0~0.075 mg/mL（R2=0.9991），and the RSDs of precision test was 0.53%.And the average recovery was 100.13%，RSD=1.18%.Conclusion：The developed method was sensitive and had low detection limit and could be suitable for determining the effective ingredients in extracts from Abrus cantoniensis Hance.
【Key words】Abrus cantoniensis Hance；effective ingredients；enzyme labeled method.
鸡骨草，又名广州相思子（Abrus cantoniensis Hance），为豆科相思子属植物[1]。主要分布于我国广东、广西、福建、海南等地，以全株入药，具有利湿退黄、清热解毒、疏肝止痛等功效，常用于湿热黄疸、胁肋不舒、胃脘胀痛、乳痈肿痛等[1-3]。现代医学研究发现，鸡骨草的主要有效活性成黄酮类物质具抗炎、抗菌、抗病毒、保肝、调节免疫等作用，临床上可用于肝硬化、急慢性肝炎、胆囊炎、外感风热等治疗[4-8]。目前，对黄酮类化合物单体的含量测定主要使用高效液相色谱仪，而对于天然药物的总黄酮类含量的测定多使用紫外分光光度计。本实验拟选用酶标仪对鸡骨草提取物中主要有效活性成黄酮类物质进行含量测定，以期为鸡骨草提取物有效成分含量的测定提供一种简单、快捷、价廉的方法。
1材料和方法
1.1材料与仪器
鸡骨草：市售；芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、无水乙醇等其余试剂为国产分析纯；GZX-9070ME数显鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；AR323CN 型电子天平（美国奥豪斯）；KQ3200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-5285A旋转蒸发仪（上海亚荣生化器厂）；DZF-6090真空干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；600 数显三用恒温水箱（常州澳华）；ELX-800多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）。
1.2 鸡骨草提取物有效成分的制备
综合文献[9，10]中对鸡骨草有效成分的提取工艺，将干鸡骨草粉碎，过40目筛，得鸡骨草粉末。取鸡骨草粉末2g置于500ml锥形瓶中，加入50%的乙醇溶液（料液比为1：40），于65℃水浴中超声提取3次，每次20 min，合并提取液，减压浓缩至无醇味，加入5倍体积乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯层萃取液，常压浓缩，回收乙酸乙酯，减压浓缩至稠浸膏，于真空干燥箱烘箱干燥至恒重，即得鸡骨草提取物。
1.3 鸡骨草提取物有效成分含量的测定
1.3.1 鸡骨草提取物溶液的配置
精密称取鸡骨草提取物25.0 mg于25 ml量瓶中用50%乙醇定容摇匀即得鸡骨草提取物溶液。
1.3.2 对照品标准溶液的配置
精密称取芦丁标准品25.0 mg于50 ml量瓶中用50%乙醇定容、摇匀，即得芦丁标准溶液。
1.3.3 酶标法测定鸡骨草提取物有效成分的含量
分别取0 μL、100 μL鸡骨草提取物溶液于2mL EP管中，分别加入50%乙醇溶液至1000 μL，摇匀，然后分别加入60 μL质量分数为5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，一定温度下避光放置6 min；取出，再分别加入60 μL质量分数为10%的硝酸铝溶液，摇匀，一定温度下避光放置6 min；取出，再分别加入800 μL质量分数为4%的氢氧化钠溶液，最后分别加入50%乙醇溶液至刻度，摇匀，于恒温水箱中避光放置一段时间后，取200μL于96孔板中，放入酶标仪中测定溶液吸光度（A）。96孔板中A1孔以未加入鸡骨草提取物溶液管调零。
1.3.4正交设计优化酶标法测定鸡骨草提取物有效成分的条件
在单因素实验基础上，实验选择反应温度、反应时间和测定波长3因素，各设计3水平进行L9（34）正交试验（见表1.），以溶液吸光度（A）为评价指标，综合审评后确定优化方案。
2 结果
2.1 单因素对酶标法测定鸡骨草提取物有效成分的影响
2.1.1 反应时间对酶标法测定的影响
由图1可知，当待测液混合均匀，避光放置12 min后溶液的吸光度达到最大值，且48 min内待测液吸光度值基本趋于稳定，因此本实验选择在待测液混合均匀避光放置12 min后测定其吸光度。
2.2 正交设计优化酶标法测定鸡骨草提取物有效成分的条件
由表2.正交实验结果和表3.方差分析结果可以直观看出，不同因素对酶标法测定影响的大小为A＞B＞C，即体系的反应温度＞测定的波长＞反应时间。其中因素A反应温度和因素B 测定的波长对实验结果具有显著性影响；而因素C反应时间对实验结果的影响无统计学意义，说明在待测液混合均匀放置12 min后，体系的吸光度基本趋于稳定。综合各因素考虑，酶标法测定鸡骨草提取物有效成分条件的最优组合为A 2B2C1，即反应温度30℃、测定波长为510nm、反应时间为12 min。
2.3 线性关系考察
按“2.2”实验结果的优化条件下，分别向体系中加入0、50、100、150、200、250、300μL芦丁标准溶液，按“1.3.3”实验方法操作，测定各组吸光度（A）。以芦丁标准溶液的质量浓度（x，mg/mL）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为y＝10.546x - 0.00546（R2＝0.9991），检测质量浓度线性范围为 0~0.075mg/mL。
2.4 精密度考察
精密吸取100 μL鸡骨草提取物溶液于2 mL EP管中，在“2.2”实验结果的优化条件下，按“1.3.3”实验方法测定溶液的吸光度值，连续测定6次。测得RSD为0.53%，提示该方法精密度良好。
2.5 加样回收实验
精密吸取100 μL鸡骨草提取物溶液6份，分别置于2 mL EP管中，其中3份加入芦丁标准溶液50 μL，另外3份加入芦丁标准溶液100 μL，在“2.2”实验结果的优化条件下，按“1.3.3”实验方法操作，分别测定溶液的吸光度值。测得加样回收率为100.13%，RSD为1.18%，提示该法准确度良好。
3 讨论
文献研究发现，鸡骨草提取物中主要有效活性成为黄酮类物质，能与Al3+生成黄色配合物，在NaNO2的碱性溶液中呈红色，在510nm波长处有最大吸收。本实验综合文献[11，12]中对鸡骨草有效成分进行提取，制得鸡骨草提取物，并利用酶标仪法对鸡骨草提取物中有效成分进行含量测定，结果显示酶标法测定条件的最优组合为反应温度30℃、测定波长为510 nm、反应时间为12 min，这从体系的吸光度值（A）得到验证。此外，经方法学考察发现在0.0~0.075 mg/mL的质量浓度范围内鸡骨草提取物与吸光度具有良好的线性关系，且该方法的精密度和准确度良好。综上所述，本实验建立的酶标法测定鸡骨草提取物有效成分含量的方法，简单、快捷，为后续对我国传统中药材鸡骨草有效成分的开发利用提供了一种新的检测方法。
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论文作者:庞谢辉
论文发表刊物:《健康世界》2016年第15期
论文发表时间:2016/9/1
标签：鸡骨草论文; 提取物论文; 溶液论文; 光度论文; 有效成分论文; 芦丁论文; 含量论文; 《健康世界》2016年第15期论文;