染色体及基因疾病是新生儿死亡及病残的重要原因，这类患儿的出生给家庭及社会带来了沉重负担。绝大多数染色体及基因疾病无彻底根治的方法，只能通过孕期产前筛查及诊断避免这类患儿的出生。目前针对胎儿染色体及基因疾病的筛查方法包括血清学指标、侵入性产前诊断、无创产前检测，其中血清学指标的检出率较低，侵入性产前诊断虽被认为是产前诊断的“金标准”，但其操作复杂，流产及感染的风险较大。目前，采用无创DNA技术进行非整倍体染色体疾病的筛查检出率高，对其他基因疾病筛查技术逐渐提高，具有操作方便、风险低的优点被大力推广。1 无创DNA产前检测技术实现依据我国的卢煜明教授誉为“无创DNA产前检测”第一人，早在二十年前就在孕妇外周血中发现了胎儿的游离DNA，但由于当时受到实验条件及检测技术的限制，在大量母亲游离DNA的背景下，要明确胎儿游离DNA的碱基序列十分困难且耗时较长，成本较高[1]。随着分子生物学技术的飞速发展，基因组测序技术更加敏感，可以同时量化千万数量的游离DNA片段，准确分析及度量孕母外周血中的胎儿DNA。在孕12周后，抽取母体足量的静脉血，利用新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA片段进行测序分析，可获得胎儿基因信息，从而排查胎儿染色体疾病，胎儿游离DNA存在于孕妇外周血中是该项技术实现的现实依据[2]。有研究报道，孕妇外周血中胎儿游离DNA含量约为全部游离DNA含量的3%-13%，甚至更高，主要来源于胎盘，胎儿出生后极短时间内即被清除[3]。胎儿染色体的异常会对孕母外周血中DNA含量带来影响，灵敏度极高的基因探测及分析技术可发现其中的微小变化，为该技术的实现提供理论依据。2 无创DNA产前检测技术的临床应用2.1单倍体染色体疾病的筛查2011年无创DNA技术首次应用于临床产前检测，并且很快受到各国医疗行业的追捧。有研究表明无创DNA技术可排查99%的唐氏综合征，且假阳性率低于0.1%,丝毫不逊于传统的有创羊膜腔穿刺羊水胎儿细胞培养的准确性，且大大降低了对母体健康及胎儿安全的影响，将检测周期由原先的2周缩短到1-2天[4、5]。专业人士一致认为无创DNA检测对胎儿非整倍体疾病的筛查大有益处，应积极推广，将无创DNA检测技术作为孕10周后产前检测的首选方法[6]。2.2单基因疾病无创DNA技术在筛查胎儿染色体非整倍体疾病外，进一步发展为对单基因疾病的筛查[7]。目前所知，人类23个染色体上分布有约3万余基因，每个基因约包含27000个碱基。单个基因突变导致的基因信息改变从而致病，称为单基因病。迄今已明确的单基因病有近五千种，涉及基因三千余，其中一部分发病率高，危害性大的常见单基因病已能进行临床基因诊断，如遗传性耳聋、地中海贫血等[8、9]。在无创DNA检测染色体非整倍体疾病日渐成熟的今天，科学家在努力实现单基因病的检测，该项技术最大的障碍是在母体外周血中得到足量的胎儿遗传物质。前文已述，在母体外周血中胎儿游离核酸以及有核红细胞含量极低，必须通过特定的方法将其从母血中准确的识别、分离和鉴定出来，才能对其所含基因进行准确分析。目前,国际上多通过采集孕妇抗凝外周血后再离心两次得到血浆成分，最后再手工过柱法商品化试剂盒提取血浆[10、11]。目前有效的分离纯化方法还十分有限，在一定程度上限制了临床使用。2.3父源性遗传疾病的筛查目前,使用游离胎儿DNA筛查单基因遗传病的研究已经从性别筛查逐渐过渡到直接检测胎儿所携主要致病基因是否以父源性为主。这类疾病不受母亲遗传物质的影响，遵从父系常染色体显性遗传规律，一旦在母亲外周血中发现这类基因，即可证实来自于胎儿，而非母体本身[12]。分析父系遗传的等位基因还可以获得其他临床相关信息,包括分析Y染色体基因序列的出现或缺失得知患儿性别（特异性与灵敏性可达到100%），鉴别胎儿性别还有利于常染色体隐性疾病的筛查，例如先天性肾上腺增生等，减少了对男性胎儿进行不必要的地塞米松治疗[13、14]。对于常染色体显性遗传病,可以直接诊断胎儿是否携带突变基因,即是否有患病的风险。而对于常染色体隐性遗传病,主要是检测胎儿是否遗传了父源性的致病基因,这样可使部分孕妇免受有创性产前诊断的痛苦。目前应用无创DNA作为首选筛查手段的此类疾病包括β-地中海贫血、纤维样囊性变、先天性肾上腺皮质增生[15-18]。获取血浆成分之后,学者多通过检测孕妇血浆中的男性胎儿特异性基因序列(SRY, DYS14, ZFXY等)来确定提取的血浆中是否含有胎儿成分。但是这一技术的缺陷在于选择基因作为母血浆中胎儿游离的检测标记存在性别依赖性,因为阴性结果既可能是由妊娠女胎造成也有可能是由提取失败造成,因而无法对检测出的阴性结果进行明确的判断；诊断结果缺乏父系基因的阳性对照，若进一步检查父亲的基因，则可证实母亲血浆中的这类基因来源于胎儿。2.4母源性遗传疾病的筛查这类基因在胎儿与母体之间具有一致性，在强大的母亲基因背景下，评估母体血浆中胎儿这类突变基因的情况更为困难，研究者对这类基因的检测建立了更为复杂的策略。随着科技的进步，这类策略得以实现，例如大规模平行测序技术，数据化聚合酶链反应技术等使外周血中DNA的含量的测量更为敏感且精确，使遗传自母亲的等位基因变异疾病的筛查成为现实。目前最为常用且有效的基因筛查技术为相对突变剂量（relative mutation dosage，RMD）分析以及相对单倍型剂量（relative haplotype dosage,RHDO）分析[19]。RMD可以确定母体血浆中突变的相对量和致病基因的野生型等位基因。这种方法需要针对每个突变设计特异性检测，然后推测出胎儿是否受影响[20]。该方法较PCR技术更为便宜，但需要胎儿DNA比例相对较大，对部分突变检测效果有限。例如，在先天性肾上腺皮质增生症中发生突变的21-羟化酶基因具有高度同源的假基因，因此很难针对高度片段化的母体血浆DNA进行检测。此外，定制检测有时需时较长，应用受限。RHDO不依赖于特异性突变的检测，可对整个胎儿基因组进行基因分型，并与父母双方的单倍体型进行比较[21]。RHDO可同时分析多个基因位点的突变条件，不要求反应条件最优化（PCR化验对此要求非常严格），更为敏感。3 无创DNA产前检测技术的局限性胎儿DNA碎片是无创DNA检测结果分析的最重要的稳定性参数，因此母亲外周血浆中胎儿游离DNA碎片含量过低是无创DNA结果无意义的最重要原因[22]。胎儿游离DNA含量受胎儿染色体状态、母亲子痫前期及是否吸烟等有关，受孕早期筛查参数的影响[23]。母亲体重是影响胎儿DNA碎片的最重要因素，有研究表明肥胖的孕妇无创DNA检查失败及假阴性率明显上升，其他的生物学因素，包括植入胎盘、多胎流产、母亲基因型异常、母亲患恶性肿瘤等也对无创DNA结果的准确性产生不利影响[24、25]。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆尽管无创DNA检测的巨大优势是毋庸置疑的，但是应用此项技术的核心问题在于明确它潜在的局限性。由于胎盘嵌合体的存在，导致胎盘的游离核酸与胎儿本身的核型并非总是一致，导致可能出现假阳性和假阴性结果，因此，针对胎儿游离核酸的检测技术只能作为筛查手段不能代替诊断。对每位都要接受产前检查的孕妇，必须告知她们无创DNA检测不能取代传统常规产前检测。每一个无创DNA的阳性结果在作出最终结论前均应被传统有创产前检查结果论证，同样的，其阴性结果也不影响自然妊娠的其他产前检测。4 展望较传统的产前检查项目无创DNA技术可减低产前检查的成本，将无创DNA作为所有怀孕妇女的筛查胎儿染色体非整倍体疾病的首选检查是目前较为可行的方法之一，或者在传统产前检查结果的基础上将无创DNA作为进一步筛查胎儿非整倍体疾病的手段。除了筛查13三倍体，18三倍体，21三倍体这类常见的胎儿染色体异常外，同样适用于筛查性染色体异常等疾病，还能筛查多胎妊娠的胎儿染色体异常，可以探测基因突变（具体适应症仍在探索中）。且随着各种分子技术的发展，单基因疾病的无创DNA技术日益成熟，RMD、RDHO分析技术是检测母亲遗传突变或父母亲共同遗传突变的强有力的工具。此外，随着测序费用的减少，靶基因序列检测联合RDHO分析技术将成为单基因疾病无创DNA检测的首选。并且学者研究发现，在孕早期的母血中存在微量的胎儿有核红细胞，因其单核、含有完整胎儿遗传信息且细胞周期短，被认为是实施无创DNA产前检测较理想的靶点。参考文献[1]田埂. 无创产前DNA检测技术[J]. 生命世界,2016,(11):32-35. [2]刘俊娇,郑天生,崔凤姬,于鹏,许佳琦,郑云静. 1696例孕妇无创DNA产前筛查结果分析[J]. 中国计划生育学杂志,2017,(07):484-487.[3]Kinnings SL, Geis JA, Almasri E, et al. Factors affecting levels of circulating cell-free fetal DNA in maternal plasma and theirimplications for noninvasive prenatal testing. Prenat Diagn 2015;35(8):816e22.[4]Norton ME, Jacobsson B, Swamy GK, et al. Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy. N Engl J Med2015;372(17):1589e97[5]Gil MM, Quezada MS, Revello R, et al. Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies:updated meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol 2015;45(3):249e66.[6]Benn P, Borrell A, Chiu RWK, et al. Position statement from the Chromosome Abnormality Screening Committee on behalfof the Board of the International Society for Prenatal Diagnosis. Prenat Diagn 2015;35(8):725e34.[7]Li Y, Page-Christiaens GC, Gille JJ, et al. Non-invasive prenatal detection of achondroplasia in size-fractionated cell-free DNA by MALDI-TOF MS assay. Prenat Diagn 2007;27(1):11e7.[8]赵雪,张玲. 胚胎培养液中游离DNA应用于植入前遗传学筛查中的研究进展[J/OL]. 国际生殖健康/计划生育杂志,2017,36(04):323-326. [9]雷彩霞,张月萍,孙晓溪. 植入前遗传学诊断/筛查技术指征进展[J/OL]. 中华生殖与避孕杂志,2017,37(03):235-239.[10]冯杏琳,申华,刘丹,罗素霞,李彬,董瑞丽,葛瑶. 胎儿出生缺陷产前筛查及无创基因测序技术的临床应用研究[J]. 中国优生与遗传杂志,2017,25(04):8-10.[11]徐滨,张朝霞. 基于高通量并行测序的无创DNA产前检测的应用价值[J]. 中国优生与遗传杂志,2017,25(03):4-6. [12]Chan KCA, Ding C, Gerovassili A, et al. Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma: a universal fetal DNA marker thatimproves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis. Clin Chem 2006;52(12):2211e8[13]Chitty LS, Finning K, Wade A, et al. Diagnostic accuracy of routine antenatal determination of fetal RHD status acrossgestation: population based cohort study. BMJ 2014;349:g5243.[14]Wright CF, Wei Y, Higgins JP, et al. Non-invasive prenatal diagnostic test accuracy for fetal sex using cell-free DNA areview and meta-analysis. BMC Res Notes 2012;5:476.[15]Li Y, Di Naro E, Vitucci A, et al. Detection of paternally inherited fetal point mutations for beta-thalassemia using sizefractionatedcell-free DNA in maternal plasma. JAMA 2005;293(7):843e9.[16]Gonzalez-Gonzalez MC, Garcia-Hoyos M, Trujillo MJ, et al. Prenatal detection of a cystic fibrosis mutation in fetal DNAfrom maternal plasma. Prenat Diagn 2002;22(10):946e8.[17]Bustamante-Aragones A, Gallego-Merlo J, Trujillo-Tiebas MJ, et al. New strategy for the prenatal detection/exclusion ofpaternal cystic fibrosis mutations in maternal plasma. J Cyst Fibros 2008;7(6):505e10.[18]Chiu RWK, Lau TK, Cheung PT, et al. Noninvasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasmaanalysis: a feasibility study. Clin Chem 2002;48(5):778e80.[19]EMAD A，LAMOUＲEUX J，OUELLET A，et al． Ｒapid aneuploidy detection of chromosomes 13，18，21，X and Y using quantitative fluorescent polymerase chain reaction with few microdissected fetal cells［J］． Fetal Diagn Ther，2015，38( 1) : 65.[20]Lun FMF, Tsui NBY, Chan KCA, et al. Noninvasive prenatal diagnosis of monogenic diseases by digital size selection andrelative mutation dosage on DNA in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci U S A2008;105(50):19920e5.[21]Snyder MW, Adey A, Kitzman JO, Shendure J. Haplotype-resolved genome sequencing: experimental methods andapplications. Nat Rev Genet 2015;16(6):344e58.[22]Benn P, Cuckle H. Theoretical performance of non-invasive prenatal testing for chromosome imbalances using counting ofcell-free DNA fragments in maternal plasma. Prenat Diagn 2014;34(8):778e83.[23]Snyder MW, Simmons LE, Kitzman JO, et al. Copy-number variation and false positive prenatal aneuploidy screeningresults. N Engl J Med 2015;372(17):1639e45.[24]Osborne CM, Hardisty E, Devers P, et al. Discordant noninvasive prenatal testing results in a patient subsequentlydiagnosed with metastatic disease. Prenat Diagn 2013;33(6):609e11.[25]Bianchi DW, Chudova D, Sehnert AJ, et al. Noninvasive prenatal testing and incidental detection of occult maternalmalignancies. JAMA 2015;314(2):162e9.
论文作者:陈咏梅（通讯作者）,王青云
论文发表刊物:《中国保健营养》2019年第7期
论文发表时间:2020/1/16
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