王亚明通讯作者 尹清臣 孔 维 温桂海 赵曙虹 杨龙龙 王 涛 王 静 张桂东
邯郸市中心医院 河北邯郸 056001
【摘 要】目的：构建针对人MIR-214基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒载体，观察其对胃癌细胞株中MIR-214基因的沉默效应，以及基因沉默后对细胞生物学行为及药物敏感性的影响。方法：运用RT-PCR检测5株胃癌细胞株中MIR-214的表达状况；构建人MIR-214基因的RNAi慢病毒载体，并转染MIR-214高表达的胃癌细胞株，运用Western-blot方法鉴定其对MIR-214基因的沉默效果；MIR-214基因沉默后运用细胞增殖实验及软琼脂克隆形成实验检测其对细胞增殖能力的影响，运用MTT方法检测胃癌细胞株对化疗药物敏感性的变化。结果：MIR-214高表达于胃癌细胞株BGC823中；成功构建了MIR-214 RNAi慢病毒载体，Western-blot实验显示其可抑制BGC823细胞中MIR-214的表达；抑制MIR-214的表达后，增殖实验表明BGC823细胞增殖能力下降，软琼脂克隆形成实验表明BGC823细胞的克隆形成率下降；MTT实验表明MIR-214表达抑制后奥沙利铂对BGC823细胞的半数抑制浓度（IC50）显著降低。结论：MIR-214表达抑制后，MIR-214高表达的胃癌细胞株BGC823的增殖能力下降，并能增加其对奥沙利铂的敏感性。
【关键词】胃癌；MIR-214；RNA干扰；药物敏感性
【中图分类号】R735.2 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）6-0107-02
方法
1方法
1.1人胃癌细胞株SGC-7901、BGC823、MGC803及GES-1常规培养于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养液中，于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中，3-4天传代1次。取对数生长期细胞，按一定的浓度接种培养用于实验。
1.2慢病毒表达载体构建：将合成好的shRNA寡核苷酸序列（共设计4对MIR-214 shRNA寡核苷酸序列，委托上海生工生物合成得到，具体见表1）退火形成双链DNA片段。与双酶切线性化后的pLKO.1-TRC载体（含GFP编码序列）连接。取4μl所得的连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃恒温培养过夜。挑取3个单克隆菌落接种至Ampicillin抗性的LB培养液中，小摇过夜。用试剂盒小量提取质粒后，分别用EcoRI和NcoI酶切鉴定，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。鉴定正确的质粒命名为：pLKO.1-TRC-miR214-shRNA。将酶切鉴定正确的细菌培养扩增，取冻存菌液用于测序以进一步确认。
1.4慢病毒感染：取对数生长期胃癌细胞，接种于6孔板培养12h后，弃上清每孔滴加病毒悬液200μl，加入含polybrene(浓度4μg/m1)的培养基，感染8h后换普通培养基；48h后加含嘌呤霉素(浓度0.5μg/ml)的培养基，隔2天更换该培养基。3次筛选后加普通培养基培养24h后收集细胞于培养瓶中培养，进行后续实验。
1.5 RT-PCR：收集各组细胞，用Trizol提取细胞总RNA，使用MMLV逆转录酶逆转录为cDNA。以各组cDNA为模板，加入缓冲液、引物等进行PCR，各样本重复3次。PCR结束后加入上样缓冲液后对产物进行1.5%的琼脂糖电泳，凝胶成像系统观察结果。
1.6 Western-blot：冷的PBS淋洗细胞2遍，在RIPA裂解液中冰上裂解细胞，提取细胞蛋白后在10%的SDS-page胶上电泳。蛋白分离后经恒流1.5h电转移到PVDF膜后，使用含5%脱脂牛奶的封闭液封闭1h，与MIR-214特异性抗体室温孵育1h或者4℃过夜后，次日加入二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，取出膜后加入ECL发光液，暗室中压片显影。
1.7细胞增殖：细胞增殖曲线使用四甲基偶氮噻唑蓝法（MTT assay），实验前1天细胞按1×104/孔铺96孔板，设shRNA 稳定干扰组（经过嘌呤霉素筛选后稳定沉默MIR-214的BGC823细胞），vector组（经过嘌呤霉素筛选后的空白载体组），每个时间点设5个复孔，分别于0h，24h，48h，72h和96h收集细胞，加入5mg/ml的MTT溶液，37℃孵育4h后，弃上清每孔加150μl DMSO后在酶标仪上550nm处读取吸光值（A550）。实验重复3次。以时间和A550值绘制增殖曲线。
1.8软琼脂克隆形成实验：取对数生长期细胞，消化吹打成单细胞，活细胞计数，用含20%FBS的DMEM培养液调整细胞密度至4×104细胞/ml。按1:1比例混合已高压灭菌的1.2%的琼脂糖PBS溶液和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20%FBS)，100μl/孔加入至96孔板，冷却凝固后为底层胶。按1:1比例混合高压灭菌的0.8%琼脂糖PBS溶液和细胞混悬液，按100μl/孔加入至含底层胶的96孔板中，待上层琼脂凝固后，置入37℃ CO2培养箱培养，每隔2-3天加少许培养液防琼脂胶变干。培养14天后用0.005%结晶紫染色1h后，在显微镜下计算克隆形成率。设5个复孔，实验重复3次。
2.统计分析
计量资料数据符合正态分布的表示为均数±标准差（means±SD），采用配对设计t检验进行比较；计数资料的比较采用χ2检验。采用SPSS13.0软件进行统计分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
结果
1MIR-214在不同胃癌细胞株中的表达水平
RT-PCR检测结果表明，5株胃癌细胞株中BGC823细胞的MIR-214 mRNA表达明显高于其它细胞株，见图1A。Western-blot检测结果也表明，5株胃癌细胞株中BGC823细胞的MIR-214蛋白表达也明显高于其它细胞株，见图1B。这表明无论RNA水平或者蛋白水平，MIR-214的表达水平以BGC823细胞株最高，因此后续实验以该细胞株作为研究对象。
2.重组慢病毒感染BGC823细胞后MIR-214的表达
含不同序列shRNA重组慢病毒感染BGC823细胞48h后，提取感染细胞的RNA进行反转录后检测mir214表达，与空载体（vector）组相比，含MIR-214-shRNA2的重组慢病毒感染BGC823细胞后MIR-214表达明显下降，而含其它序列MIR-214-shRNA的重组慢病毒感染BGC823细胞后MIR-214表达仍较高。这表明含shRNA2的重组慢病毒可有效沉默BGC823细胞的MIR-214基因表达,见图2。
3目标细胞的筛选
含shRNA2序列的重组慢病毒颗粒感染BGC823细胞48h后，加入嘌呤霉素进行筛选得到稳定沉默MIR-214的细胞株，荧光显微镜下观察可见大量荧光，表明获得了高效率的感染，见图3。
4.MIR-214沉默后对BGC823细胞增殖能力的影响
BGC823细胞分设vector组及pLKO.1-MiR214-shRNA2组（shRNA2稳定干扰组）。MTT法检测表明，两组细胞培养不同时间后，pLKO.1-MiR214-shRNA2组的A550值均明显较vector组低，在培养96h时，两组的A550值差异具有统计学意义，P＜0.05，见图4A。这表明，稳定沉默MIR-214基因后BGC823细胞的增殖能力显著变慢。
讨论
慢病毒感染靶细胞发挥基因沉默的作用稳定而持久，可显著提高RNA干扰的抑制效率，该技术作为新一代高效表达载体大大促进肿瘤的基因基础研究[1-2]。从本研究结果来看MIR-214的表达仅在胃癌细胞株BGC823中有较高的表达，因此后续的实验主要以BGC823细胞为主要研究对象。MIR-214通过影响PTEN，抑制其表达，最后引起肿瘤细胞增殖能力。通过提高Akt磷酸化后增强胃癌细胞的存活能力，本研究还考察了MIR-214基因沉默前后BGC823细胞对临床化疗药物敏感性的变化，结果显示，MIR-214基因沉默后显著提高其对奥沙利铂的药物敏感性，而对氟尿嘧啶及伊立替康的敏感性提高并不明显，这说明MIR-214在胃癌的奥沙利铂耐药方面可能扮演着重要角色。
MIR-214在实体瘤中的致癌作用尽管得到了部分了解，但仍需要进一步探索其在相关肿瘤信号途径中的调控作用。进一步探索MIR-214对胃癌中癌基因及抑癌基因的影响，以及MIR-214通过何种途径促进胃癌的耐药，探明MIR-214在胃癌生长及耐药中的机理。这些都有待进一步的研究。
参考文献
[1]张德太，张科，杨文等.siRNA沉默G6PD对人胃癌细胞HIF-1α表达的影响[J]．中国病理生理杂志，2011，27(8):1544-1548
[2]代新珍，黄学平，钟琳，等.siRNA特异性沉默septin 2基因抑制胃癌细胞迁移[J]．中国病理生理杂志，2012，28 (8):1362-1366
项目资助：
邯郸市科学技术与发展规划项目
通讯作者：
王亚明*，男，本科，主治医师，研究方向：消化系统肿瘤的发病机制及综合治疗
论文作者:王亚明 尹清臣 孔 维 温桂海 赵曙虹 杨龙龙 王 涛 王
论文发表刊物:《中医学报》2015年6月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/10
标签：细胞论文; 细胞株论文; 胃癌论文; 基因论文; 琼脂论文; 沉默论文; 培养基论文; 《中医学报》2015年6月第30卷供稿论文;