谷守芹[1]2007年在《调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的STK基因的克隆与功能分析》文中提出由凸脐蠕孢菌引起的玉米大斑病是玉米生产上的重要病害之一，常造成严重经济损失。研究表明，MAPK信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号转导途径，并对植物病原真菌的生长、发育和致病性有重要的调控作用。本文利用候选基因法克隆了玉米大斑病菌中的3个MAPK基因(STK1、STK2、STK3)，分别与调控玉米大斑病菌的渗透胁迫调节、致病性与分生孢子发育、细胞壁合成等3种类型的已知MAPK基因有非常高的同源性。在获得玉米大斑病菌STK1基因突变体的基础上，进行了玉米大斑病菌STK1基因的表达研究，确定了STK1基因在玉米大斑病菌分生孢子发育和渗透胁迫调节方面的重要功能，为研究其他MAPK基因提供了思路和方法。经对玉米大斑病菌STK1基因反义诱导表达突变体的构建，不仅为该基因作为靶基因进行病害防治奠定基础，而且STK1基因正义诱导表达突变体的构建还将为该基因在其它物种中的转化以及研究该基因与其它基因之间的关系提供了材料。对ATMT突变体和黑色素缺失突变体中STK1基因表达的研究，证明了玉米大斑病菌调控生长和发育有着更复杂的机制。本文主要结果如下：1．利用候选基因法克隆了3个玉米大斑病菌MAPK基因，即STK1，STK2和STK3。其中STK1和STK2基因获得了基因的cDNA全长和DNA全长，STK3基因为一个片段，获得了该基因的部分DNA序列。STK1基因cDNA全长和DNA全长的获得使前期研究获得的STK1基因片段得到完整化，并对GenBank中登录的该基因进行了更新(登录号为AY849317)。2．对STK1、STK2和STK3基因的结构进行了分析。STK1基因DNA全长1506bp，cDNA全长1071bp，编码356个氨基酸，有9个外显子和8个内含子，外显子1071bp，内含子共435bp；STK2基因DNA全长1277bp，cDNA全长1059bp，编码352个氨基酸，含有5个外显子，4个内含子，外显子共1059bp，内含子共218bp；STK3基因片段长度为591bp，可能存在3个内含子，共172bp，4个外显子总长419bp，该基因的编码序列从该片段的第3位开始，编码区域为417bp，预测编码蛋白中含有139个氨基酸。试验中发现的所有内含子均符合GT-AG法则。3．对玉米大斑病菌STK1、STK2和STK3叁个MAPK基因的同源性和功能进行了分析和比较，其中STK1基因可能主要与渗透胁迫和应激胁迫调节有关：STK2基因主要与病菌的致病性和孢子发育有关；STK3基因主要与细胞壁合成有关。为了明确STK1基因的表达量的变化，本试验获得了长度为1287bp的玉米大斑病菌β-微管蛋白基因片段，该序列与玉米小斑病菌的β-微管蛋白基因同源性均为100％。以该基因为内参，利用半定量RT-PCR技术，研究了高渗条件对玉米大斑病菌STK1基因表达的影响，在高渗处理8h内，STK1基因的表达量比较稳定，但超过8h后，STK1基因的表达量迅速下降。4．在高渗胁迫条件下，玉米大斑病菌的菌落形态、颜色、生长速度发生严重变化，但STK1基因突变体则变化不明显。5．利用原核表达载体pET28a(+)及原核表达宿主菌BL21构建了玉米大斑病菌STK1基因的原核表达载体STK1-pET28a(+)，并成功进行了STK1基因的原核表达分析。为STK1蛋白的分离和在细胞中的定位研究奠定了基础。Southern杂交结果表明，玉米大斑病菌的STK1基因在基因组中以单拷贝形式存在。6．在优化玉米大斑病菌原生质体制备和再生条件的基础上，根据基因同源重组原理构建了含有潮霉素磷酸转移酶基因和氨苄青霉素基因两个抗性标记的STK1基因敲除载体，通过PEG介导的原生质体转化，获得了246个抗性转化子，通过使用设计的潮霉素磷酸转移霉基因特异性引物及STK1基因特异性引物对转化子的筛选，得到了一个STK1基因突变体，命名为STM-35。STK1基因敲除突变体STM-35的菌丝灰白色、气生菌丝少，菌落低矮，菌落中部菌丝呈浸润状，菌丝细胞中色素沉积少、菌丝较透明，没有发现分生孢子的形成，提取的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显着下降，致病性分析表明，该突变体的致病性大大降低。7．基于pSOI质粒构建了玉米大斑病菌STK1基因的反义和正义诱导表达载体，获得了30个反义转化子，其中有5个转化子为反义抑制突变体，它们与STK1基因敲除突变体的表现基本一致。在构建玉米大斑病菌ATMT突变体库的基础上，对与STK1基因突变体在菌落和菌丝形态方面非常相似、也不产生分生孢子的ATMT突变体STAM-26，进行了STK1基因的表达分析，发现该突变体中STK1基因能够正常表达，说明调控玉米大斑病菌菌丝和分生孢子发育的机制非常复杂，并不是由某一条途径单独调控。结论推测，STK1基因对玉米大斑病菌菌丝的生长发育没有影响，但可能与菌丝中色素等物质的积累有关，并调控病菌分生孢子的发育、HT-毒素的活性和致病性。
范永山[2]2004年在《玉米大斑病菌MAPK基因的克隆和功能分析》文中认为促分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)，也称细胞外信号调节激酶(Extracellular-signal kinase，ERK)，是一组进化上高度保守的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在生物体内的多种细胞信号转导途径中占有非常重要的地位，例如渗透调节、细胞壁合成、形态建成、有性交配、致病性、生长和分化等。目前在许多植物病原真菌中鉴定了MAPK基因，发现在病菌的生长、发育、繁殖和致病性等方面具有重要的调控作用，因此研究植物病原真菌中MAPK途径的功能，不但可以使人们更多地了解病害发生过程，而且每一个与致病性有关的MAPK途径相关基因都可能成为病害防治的目标。玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)是玉米上的一种重要病原真菌，引起的玉米大斑病是玉米上的重要叶部病害。为了明确MAPK途径在玉米大斑病菌中的可能功能，本论文在系统研究MAPK途径在玉米大斑病菌生长、发育、侵染和毒素产生等方面调控作用的基础上，获得了115个MAPK途径调控基因的表达基因片段，并克隆了1个玉米大斑病菌MAPK基因——STK1基因。 1、建立了一套切实可行的检测MAPK活性的荧光素酶／荧光素技术体系，并发现MAPK途径抑制剂U0126和CaM抑制剂TFP对MAPK活性都有显着的抑制作用。 2、玉米大斑病菌的分生孢子的水悬浮液和PD悬浮液在玻璃平板上12h以内、在玉米叶片的上表面和下表面24h以内都可以产生成熟的附着胞，在叶片上附着胞和侵入丝的产生时间晚于玻璃平板，产生数量也少于玻璃平板。在一定湿度条件下，影响玉米大斑病菌附着胞生长和发育的决定因素是温度。附着胞的形成过程除了受气候因素影响外，还与不同菌株间的遗传差异有关。 3、在PDA培养基上，U0126对玉米大斑病菌、玉米黄斑病菌、小麦根腐病菌等10种植物病原真菌的菌落形态和生长速度没有显着影响，可以形成正常的菌丝、分尘孢子，但U0126处理的玉米大斑病菌分生孢子萌发时间晚，芽管短，分生孢子的萌发百分率下降。U0126对分尘孢子萌发的抑制程度随着浓度增加而上升，但随着处理时间的延长而下降。此外，U0126处理后分尘孢子还会发生质壁分离现象。 4、U0126和TFP单独或混合处理对玉米大斑病菌附着胞产生都有一定的抑制作用，抑制作用随着浓度增而增强，随处理时间延长而减弱。但加入cAMP后，它们的抑制作用消失，从而表明，MAPK途径与Ca~(2+)-CaM途径和cAMP途径间即有协同作用，又相互影响，它们之间组成一个复杂的信号网络调控玉米大斑病菌的分生孢子和附着胞发育。 5、U0126处理后，玉米大斑病菌HT-毒素的组成及活性都发生了变化，部分组分的产生受到了抑制，并诱导产生了一些新的毒素组分。抑制剂浓度不同，新组分的种类和含量不同。 6、在含有少量离子的蒸馏水中，U0126对菌丝的细胞膜透性和PAL活性没有显着影响，但POD和PPO活性变化明显，推测U0126对病菌细胞可能没有直接的毒否作用，而与病菌的活性氧代谢有关。 8、利用DDRT-PCR和反式Northem杂交技术，获得了1巧条特异于U0126处理的差异表达基因片段，对4个差别表达簇因片·段进行克隆并测序，获得了长度分别为296bp、333bp、479bp和60lbp的4条eDNA序列。同源性分析表明，它们与TCA循环、膜内外物质转移、信号转一导、蛋白质合成、反转录等生命活动的相关基因同源性较高，对这些基因片段进行深入分析和功能研究，将会对MAPK途径在玉米大斑病菌生长、代谢和基因表达调节等方面的功能有更全面的了解。 9、利用巢式PCR和RACE技术获得了1个玉米大斑病菌MAPK同源基因一STKI基因的cDNA序列、部分基因组序列及其两侧序列，在基因内部存在3个内含子。该基因含有MApK、Ser/Thr蛋白激酶、JNK(Jun一N一 terminal kinase)等同源结构域，与一许多真菌和动物中与应激反应和致病性有关的MAPK蛋白有较近的亲缘关系和较高的同源性，在基因组中主要以单拷贝形式存在，发现多数供试菌株中都含有57’K了基因，但菌株间既具有较强的保守性，又存在一定的序列差异。 10、30pMU0126和TFP对STKI荃因的表达都有一定的抑制作用，浓度降低，抑制作用不明显。在产生分生袍子前、产生分生抱子时、菌丝的对数生长期和产生附着胞时都可以检测到STKI基因的表达。
刘晓妹[3]2012年在《巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌MAPK基因（CCK1）和毒素基因（ct）克隆与功能鉴定》文中研究表明巴西橡胶树是重要的热带作物之一,其产品天然橡胶与钢铁、石油、煤炭并列为四大工业原料。多主棒孢菌[Corynespora cassiicola(B.&C.)Wei]是重要的植物病原真菌,可为害300多种植物,由其侵染引起的巴西豫胶树棒孢霉落叶病是影响天然橡胶生产的主要病害之一。目前国内外对该病害的研究集中在病原菌生物学、病害流行学和防治技术等方面,对病原菌致病机理,特别是致病相关功能基因及其调控等方面的研究很少。以巴西橡胶树棒孢霉落叶病作为研究对象,开展病原菌致病相关功能基因及其调控等方面的研究,对揭示该病原真菌的致病机理、了解该病原菌与寄主之间的互作机制具有重要的学术价值,同时也有助于我们发展新的防治措施。本研究工作运用基因同源克隆技术,从巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌(C.cassiicola)中克隆了蛋白激酶(MAPK)同源基因CCKl和毒素编码基因ct的全长序列,通过潮霉素基因hygB插入突变和PEG介导的原生质体转化,获得了它们的基因敲除突变体,并对其表型做了测定。主要结果如下：1.根据真菌中已发现的MAPK蛋白的保守序列设计一对简并引物,从C.cassiicola基因组DNA中扩增获得了一段PMKl类MAPK同源基因片段,利用SEFA-PCR技术经两步扩增获得了该片段的5’端(1802bp)和3′端(652bp)侧翼序列,拼接校正后的DNA全长2710bp,命名为CCKl。将所得CCKl的DNA序列与GenBank中PMK1类MAPK同源基因的cDNA序列比对后,从内含子外侧设计引物,以C.cassiicola基因组RNA为模板经RT-PCR扩增获得了一段1065bp的cDNA片段,比对已获得的CCKl基因的DNA和cDNA序列,发现起始密码子ATG位于第1227～1229bp处,附近序列符合Kozak规则,即ACCATGT,终止密码子TAA位于第2502～2504bp处,自ATG到TAA的DNA全长1278bp,其中含5个外显子和4个内含子,外显子大小分别为110bp、196bp、382bp、348bp和29bp(位于第1227～1336,1390～1585,1640～2021,2072～2419和2476～2504碱基处),内含子大小分别为53bp、54bp、50bp和56bp(位于第1337～1389,1586～1639,2022～2071和2420-2475碱基处)；推测开放阅读框编码354个氨基酸残基,分子量约40.98kDa,等电点(PI)为6.43,是一种微酸性蛋白质。经过在GenBank数据库搜索CCK1的相似蛋白和系统聚类分析,发现CCK1与丝状真菌禾谷类叶枯病病菌(Phaeosphaeria nodorum)的MAK2(XP_001793869.1),油菜黑胫病病菌(Letosphaeria maculans)的MAPK(AAM89501.1),稻胡麻斑病病菌Cochliobolusmiyabeanus)的BMKl(AB180104.1),玉米小斑病病菌(Cochliobolus heterostrophus)的CHK1(AF178977.1),稻瘟病病菌(Magnaporthe grisea)的PMK1(U70134.1),番茄枯萎病病菌(Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici) FMKl(AF286533.1)等PMKl类基因编码的蛋白高度同源,相似性分别为99%、99%、98%、98%、93%和93%,而且含有一个参与双重磷酸化作用的MAPK蛋白激活域TEY(182AA·184AA)和Ser/Thr蛋白激酶保守结构域。因此可以推测本试验获得的CCKl基因为C.cassiicola的PMKl类MAPK基因,序列已提交GenBank(GU373808.1)。2.采用在pMD18-T Vector的T克隆位点、Sph I和Sal Ⅰ酶切位点,先后依次插入CCKl基因5′端、3′端和潮霉素基因hygB叁个片段,成功构建了C.cassiicola的CCKl基因敲除载体pFHB,从该载体上扩增一段插有hygB基因的重组CCKl基因片段,转化C.cassiicola原生质体,对所得转化子经过PDA平板初筛、PCR验证和Southern杂交证实,确定得到的编号为FHB4的菌株是多主棒孢菌蛋白激酶基因CCKl的敲除突变体。表型测定结果表明：与野生型菌株相比,CCKl突变体完全失去了产孢能力,菌落颜色由棕灰色变为墨绿色,紧贴培养基生长,气生菌丝显着减少,菌丝生长速率明显下降,菌丝刚直、分支和隔膜数减少,菌丝细胞中色素沉积多,颜色加深呈深褐色,原生质浓缩明显；菌丝更耐高温；对酸碱环境的最适范围变窄；对多种盐的渗透胁迫反应减弱；对多菌灵和甲基硫菌灵更敏感；用菌饼接种嫩叶完全不能致病,但用粗毒素测定致病性时却表现出弱致病力；产漆酶时间相对延后,但漆酶相对产量提高,纤维素酶的相对产量也明显提高；在菌丝生长方面,外源Ca2+的促进作用和cAMP的抑制作用对突变体的影响更大。说明蛋白激酶CCKl在巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌菌丝的生长、发育、分化、色素的沉着,分生孢子、毒素、漆酶和纤维素酶的产生,对环境的适应性和对寄主的致病性方面可能起着重要的调控作用,而且有些调控作用可能是与钙信号或cAMP途径相互协调共同完成的。3.根据NCBI网站EF667973.1序列设计一对引物,用同样的方法从C.cassiicola中克隆了1个毒素基因ct,DNA全长2800bp,cDNA全长180bp,起始密码子ATG位于第802～804bp处,终止密码子TAA位于第1095～1097bp处,白ATG到TAA的DNA序列全长296bp,存在3个外显子和2个内含子,外显子大小分别为105bp、60bp和15bp(位于第802～906,974～1033和1083～1097碱基处),内含子大小分别为67bp和49bp(位于第907～973和1034～1082碱基处),推测开放阅读框编码59个氨基酸序列,分子量约5.92kDa,等电点(PI)为5.70,是一种酸性蛋白质,与C. cassiicola pro-cassiicolin(ABV25895.1)的氨基酸序列相似性达85%。因此初步确定本试验获得的ct基因是预期的C.cassiicola的毒素基因,序列已提交GenBank (GU373809.1)。4.用pMD18-T Simple Vector做启始载体,将含全部编码序列的-段毒素基因片段克隆在该载体的T克隆位点上,经Sal I酶切后反向插入hygB基因,成功构建了C.cassiicola毒素基因敲除载体pCTH。以该载体为模板,扩增获得一段插有hygB基因的重组ct基因片段,转化巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌原生质体,对所得转化子经过PDA平板初筛、PCR验证和Southern杂交证实,确定得到的是多主棒孢菌毒素基因ct基因的敲除突变体。表型测定表明：与其野生型CC004相比,毒素突变体在菌落和菌丝形态、生长,产孢量、孢子萌发,菌丝生长对温度、pH要求,产生漆酶和纤维素酶的能力方面基本未发生明显的改变。用菌饼接种嫩叶,致病性虽有减弱但仍很强,用粗毒素测定致病性时症状却明显减轻。说明毒素是巴西橡胶树棒孢霉落叶病菌的一个重要的毒力因子,但不是唯一的因子。
王嘉渊[4]2011年在《玉米弯孢霉叶斑病菌Clm1基因的克隆与功能分析》文中研究指明玉米弯孢霉叶斑病是一种主要由新月弯孢霉Curvularia lunata(Wakker)Boedijn所引起的玉米叶部真菌性病害,其在我国玉米产区分布十分广泛。目前,人们对于该病害致病分子机理领域的研究尚未深入,因而进行此方面的研究对于深刻揭示该病原真菌致病性机制以及防控该种病害的发生、发展均具有十分重要的意义。现已知作为生物体内信号传递主要功能因子之一的MAPK在病原真菌致病性方面承担着重要的作用。为此,本文以玉米弯孢霉叶斑病菌MAPK基因之一的Clm1基因作为对象来进行一系列的研究。主要采取Inverse PCR和RACE技术从玉米弯孢霉叶斑病菌中克隆获得了该基因的全序列及其所在区域的旁侧序列,该基因DNA全长1.609kb,cDNA全长1.251kb(GenBank:HQ851366),包含6个内含子,与酿酒酵母中参与细胞壁完整性途径的Slt2基因同源。同时通过构建该基因5’非编码区与eGFP融合表达载体,转化自身出发菌株,确定了其为Clm1基因的启动子序列,进一步验证了该基因ORF框的正确性。为分析Clm1基因的功能,运用根癌农杆菌介导的靶基因定向敲除技术成功对其进行了敲除。比较Clm1基因敲除突变株与野生型菌株后发现敲除突变株表现为:分生孢子总产量明显下降,其中变形孢子数比例上升;菌落和分生孢子色泽变浅,色素形成相关基因Brn1的表达下降;菌丝外层细胞壁基本缺失;侵染离体叶片的能力存在明显下降;纤维素酶活性和毒素化合物产生水平均发生改变,同时发现Clm1基因与毒素相关基因Clt1之间存在一定的相关性。总之,Clm1基因与弯孢霉叶斑病菌的多项致病相关发育性状有关,与一些致病性生化因子的形成及活性亦有着密切联系,从而也再次证实了MAPK信号传导途径在病原真菌的致病性方面发挥了重要的作用。
杨阳, 张长志, 范钰, 谷守芹, 董金皋[5]2012年在《玉米大斑病菌StMKP2基因的克隆和敲除载体的构建》文中研究表明玉米大斑病(Northern Leaf Blight of Corn)是世界各地玉米主产区的一种重要的真菌性病害,引起该病的病原菌为玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)。研究表明,MAPK(mitogen-activated protein kinase)信号转导途径是在植物病原真菌中普遍存在的细胞外信号转导途径,并对病菌的生长、发育和致病性有重要的调控作用。在病原真菌中,目前发现存在Fus3/Kss1、Hog1和Slt2 3条MAPK途径。其中,Fus3/Kssl-MAPK途径与病菌的致病性密切相关,Hog1-MAPK途径主要与渗透胁迫相关,Slt2-MAPK途径与细胞壁合成相关。在植物病原真菌中,Fus3/Kssl-homolog MAPK级联途径又被称为PMK(Pathogenicity MAPK Cascade)级联途径,主要通过影响病菌的附着胞及侵染结构的形成来影响病菌的致病性。在MAPK级联途径中,MAPK蛋白激酶可被其上游激酶逐级激活,从而产生活性,而激活的MAPK主要被其相应的促分裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)去磷酸化而灭活。所以,MAPK蛋白激酶的磷酸化与去磷酸化之间的平衡决定了级联途径的活性强度和持久度。本实验室前期的研究中明确了Fus3/Kssl-MAPK途径中MAPK基因STK2的功能,本研究拟在克隆STK2基因的磷酸酶基因StMKP2的基础上,构建基因敲除载体,为创制该基因敲除突变体、分析基因的功能奠定基础。本试验利用JGI网站(www.jgi.doe.gov)公布的玉米大斑病菌的基因组序列,查到了玉米大斑病菌MAPK途径中作用于STK2基因的磷酸酶基因StMKP2的基因序列。生物信息学分析显示,该基因DNA全长为1 521bp,cDNA全长1 464bp,含有1个内含子,其长度为57 bp。本试验设计了带有XhoⅠ、HindⅢ和SacⅠ、SmaⅠ酶切位点的引物,以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,分别扩增得到了StMKP2基因的同源臂片段Ⅰ(500 bp)和同源臂片段Ⅱ(500bp),将其凝胶回收后分别与克隆载体pMD19-T Simple Vector连接,送样测序。将测序正确的重组质粒与pBS载体分别进行双酶切后连接,获得重组载体。通过PCR及酶切验证对该载体进行检测。结果表明,成功构建了玉米大斑病菌StMKP2基因敲除载体。下一步拟将该重组载体利用PEG介导的转化方法,转化玉米大斑病菌原生质体,利用潮霉素B抗性筛选基因敲除突变体,通过对突变体和野生型菌株致病性比较,明确StMKP2基因的功能。
李坡[6]2009年在《玉米大斑病菌MAPK级联途径中STK1基因的功能研究》文中进行了进一步梳理由玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)引起的玉米大斑病是威胁玉米生产安全的重要病害之一,常造成严重经济损失。研究表明,许多植物病原真菌的生长、发育及致病性都受到细胞信号转导途径的调控,其中MAPK信号转导途径是普遍存在的并有重要调控作用的信号转导途径。玉米大斑病菌中的STK1基因是编码MAPK信号途径中MAP kinase一个基因,本实验室前期研究发现该基因与大斑病菌的致病性和分生孢子萌发有关,但该基因参与玉米大斑病菌渗透调节的具体作用尚不明确。本试验在克隆STK1基因的基础上,对其进行了生物信息学的分析,发现它与其他真菌的渗透调节相关的MAP kinase基因具有很高的同源性。为了进一步明确该基因的功能,本实验采用功能互补的方法,构建了酿酒酵母胞内表达载体,使该基因在酿酒酵母HOG1基因缺失突变体中表达,以进一步明确STK1基因的功能。主要结果如下:1.获得了STK1基因全长序列,并最终确定一个全长为1071 bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。对STK1基因的开放阅读框进行了生物信息学分析,利用相关软件对该基因进行翻译,发现该基因编码356个氨基酸的蛋白。经对该基因的预测蛋白进行同源性分析,发现预测蛋白与许多植物病原真菌渗透调节相关的MAP kinase都有90%以上的同源性;通过比对发现,该蛋白与这些真菌中MAP kinase相似,含有渗透胁迫相关的MAP kinase所具有的保守结构域:TGY motif、CD domain、BD domain。其中,171～173位的TGY motif是渗透相关的MAP kinase的典型特征,CD domain和BD domain是MAP kinase上游调节物和下游效应物的结合和催化部位;聚类分析将不同的MAP kinase分为3个不同的类群,即Hog1、Fus3/Kss1和Slt2,其中Stk1与Hog1类群聚类在一起。2.构建了酿酒酵母表达载体pVT102U-STK1,进而以该重组质粒转化酿酒酵母HOG1基因缺失突变体,通过酿酒酵母相关的氨基酸合成缺陷筛选及PCR验证获得了阳性转化子。3.对获得的转化子进行了多种胁迫处理,发现在盐胁迫下该基因能够恢复酿酒酵母HOG1缺失突变体对盐的敏感性,并能恢复其异常的的细胞形态至正常的表型。并能恢复HOG1缺失突变体对氧胁迫的敏感性,说明STK1基因具有抵抗氧胁迫的的作用。4.研究发现,STK1基因不仅能够抵抗各种盐胁迫,其转化子在钠盐胁迫下的生长速度及胞内甘油的累积高于野生型,说明该基因对钠胁迫的耐受力更强。由于盐碱土壤中钠盐为主要的盐类,所以我们希望该基因能够尽早转入到植物体内来提高植物的抗盐能力,从而为大量废弃盐碱土壤的利用提供遗传资源。
周斐红[7]2010年在《玉米弯孢霉叶斑病菌Clk1基因的克隆与功能分析》文中进行了进一步梳理玉米弯孢霉叶斑病是由新月弯孢霉[Curvularia lunata (Wakker) Boed.]引起的在我国玉米产区广泛分布的重要病害,研究该病原真菌致病分子机理对于持续控制该病害的发生具有重要意义。MAPK途径是植物病原真菌接收外界信号、调控致病因子表达的重要信号转导途径。为此,本文以MAPK基因Pmk1为对象,研究该基因调控玉米弯孢霉叶斑病菌致病因子及相关基因表达的特点。首先,成功从玉米弯孢霉叶斑病菌中克隆了与Pmk1基因高度同源的Clk1基因,该基因以单拷贝形式存在,全长1271 bp,包含4个内含子,编码352个氨基酸。为验证该基因的功能,对该基因进行了敲除试验,获得的两个Clk1基因敲除子均具有相似的特征。与野型菌株相比,敲除子表现为:白色气生菌丝多;在培养初期生长速度慢,后期生长速度达到或超过野生型菌株;易受低温抑制;不产生分生孢子;丧失侵染玉米离体叶片能力;可侵染受损的玉米叶片,但侵染速度减缓;细胞壁降解酶(PG、PMG、Cx)和毒素活性明显下降,但在色素性状上没有显着变化。敲除子形成一种类似厚垣孢子结构,推测可能与病菌致病力减弱有关。因此,Clk1基因在玉米弯孢霉叶斑病菌的致病过程中发挥着重要的调控作用,这一结论也再次证实了该MAPK途径在调控植物病原真菌致病性上具有的保守性。
吴敏[8]2012年在《玉米大斑病菌MAPK级联途径中StSTE12基因的克隆与功能分析》文中指出为了明确玉米大斑病菌Fus3/Kss1-homolog途径在病菌生长发育及致病过程中的调控作用,本研究通过候选基因法和Genome-walking技术克隆得到了玉米大斑病菌MAPK级联途径Fus3/Kss1通路下游的一个基因StSTE12;利用生物信息学方法对该基因进行保守结构域和进化树分析,发现它与其它植物病原真菌的Ste12-like蛋白聚为同一类,具有这类转录因子特有的保守结构域;利用β-半乳糖苷酶法检测发现,StSte12具有转录自激活活性;通过酵母双杂交技术初步证明StSte12受StStk2的调控;通过酵母异源互补和RNA干扰(RNA interference,RNAi)两种方法分别创制酵母异源互补转化子和RNAi沉默转化子,并通过对酵母功能互补转化子和RNAi转化子进行分析,明确了该基因主要参与了病菌的附着胞发育及侵染过程,本试验的主要研究结果如下:1.利用候选基因法及Genome-walking技术得到了玉米大斑病菌StSTK2基因下游的转录因子StSTE12,该基因DNA全长为2816 bp,cDNA为2085 bp,编码694个氨基酸,包含5个外显子和4个内含子;通过蛋白比对发现,StSte12具有转录因子特有的STE homeodomain和ZnF_C2H2锌指结构;同源性分析显示,该基因与其它植物病原真菌的STE12-like基因有较高的同源性。2.利用β-半乳糖苷酶法检测发现,StSte12能够激活下游基因LACZ的表达,经X-α-Gal染色后显示蓝色,说明StSte12具有转录自激活活性;通过酵母双杂交技术发现,StSte12受StStk2的调控,对于它们之间究竟如何作用还需进一步的研究。3.将StSTE12基因转化至酿酒酵母ScSTE12基因的缺失突变体中,筛选酿酒酵母ScSTE12基因的功能互补突变体并对其进行分析,发现StSTE12基因可以回复酿酒酵母ScSTE12基因的功能,能够调控酵母细胞的侵入生长。4.以pSilent-1质粒作为载体,构建StSTE12基因的RNA干扰载体,将该载体通过PEG介导的转化方法转化玉米大斑病菌原生质体,通过潮霉素B筛选、PCR检测以及RT-PCR的验证得到了3株StSTE12基因的RNAi转化子。5.对StSTE12基因的RNAi转化子进行分析,发现转化子的致病力均降低,且不能够直接侵染健康的玉米植株,只能通过伤口侵入,但是转化子的毒素活性并不减弱。此外,与野生型菌株相比,转化子的分生孢子产量、黑色素的生物合成明显减少,附着胞发育不正常、膨压降低、穿透玻璃纸的能力下降。以上结果表明,StSTE12基因与玉米大斑病菌附着胞的发育及侵染过程密切有关。
武晓波[9]2009年在《玉米大斑病菌MAPK级联途径中STK2基因的功能研究》文中认为由玉蜀黍大斑刚毛座腔菌(Setosphaeria turcica)引起的玉米大斑病是玉米生产上的重要病害之一,常造成严重经济损失。研究表明,MAPK信号转导途径是真菌中普遍存在的细胞外信号转导途径,并对植物病原真菌的生长、发育和致病性有重要的调控作用。本论文通过基因敲除技术创制STK2基因的缺失突变体来研究玉米大斑病菌MAPK信号转导途径中STK2基因的功能。初步明确了玉米大斑病菌信号转导途径中的STK2基因在玉米大斑病菌分生孢子发育、附着胞形成、致病性及次生物质代谢调节等方面的重要功能,为研究其他信号转导调控基因提供了思路和方法。根据实验室前期已克隆得到的STK2基因的DNA序列分别设计5’和3’特异性引物,以玉米大斑病菌基因组DNA为模板,利用Genome walking技术得到了STK2的DNA侧翼序列,最终得到了STK2基因5’端1 951 bp、3’端1 062 bp的非编码区,使用国际上通用的启动子分析软件Sofeberry、NNPP对其进行启动子活性区域分析,结果发现,在起始密码子前1056 bp左右范围内有强的启动子和增强子活性结构,其中在起始密码子前356 bp和1 562 bp处存在CAAT BOX,没有发现TATA BOX,存在3个GpC岛。另外利用生物信息学软件对STK2基因编码的蛋白进行结构及功能预测。根据基因同源重组原理,以潮霉素磷酸转移酶基因取代STK2基因的部分编码区序列,构建了含有潮霉素B抗性标记的STK2基因敲除载体。利用重组DNA片段通过PEG介导转化玉米大斑病菌原生质体,获得了潮霉素B抗性转化子,通过潮霉素磷酸转移酶基因特异性引物和STK2基因特异性引物对转化子进行PCR筛选,并以潮霉素基因为探针进行Southern blot验证,最终确定1个转化子为突变体,命名为Δstk2。对突变体菌株Δstk2进行了表型分析,结果显示,Δstk2菌株菌丝呈白色、气生菌丝稠密,菌落低矮,菌落中部菌丝呈灰白色毡状,其生长速率明显大于野生型。生物测定结果表明,该菌株的HT-毒素对感病寄主叶片的毒力显着下降;突变菌株在洋葱表皮上不能够萌发产生附着胞进而不能侵入洋葱表皮;取其菌盘接种于感病寄主叶片,不能导致寄主发病;此外,突变体菌株对高渗胁迫的耐受能力不及野生型菌株。PCR扩增STK2基因的ORF,将其克隆到穿梭质粒pPIC9K中,转化DH5α,经PCR和测序鉴定后,提取测序正确的pPIC9K-STK2重组载体质粒,线性化后电击转化GS115毕赤酵母菌株,使用G418筛选出稳定表达的酵母重组子,经PCR验证正确后,用甲醇诱导酵母重组子,表达产物经SDS-PAGE分析后推测有目的蛋白的表达,为下一步Western Blot鉴定以及蛋白活性检测奠定基础。根据MAPKK基因核苷酸序列的保守区域设计简并引物,以玉米大斑病菌01-23菌株的DNA为模板,通过PCR技术获得MAPKK基因的部分片段,命名为STKK2,Southern杂交表明,STKK2基因在病菌基因组中以单拷贝形式存在。
刘艳梅[10]2008年在《玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因的克隆与功能分析》文中提出钙调磷酸酶(Calcineurin,CaN)是一种直接受Ca~(2+)/钙调素(CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,在调控真菌生长发育及致病性方面起重要作用。本论文对玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因(calcineurin B,CnB)进行了克隆、生物信息学分析和反义抑制表达分析,初步研究了钙调磷酸酶在玉米大斑病菌生长发育中的作用。根据已知病原真菌CnB基因氨基酸序列保守区域设计简并引物,采用cDNA末端快速扩增(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)技术,首次在玉米大斑病菌中克隆得到了CnB基因全长cDNA序列(GenBank登录号:EF 469732)和DNA序列。生物信息学分析表明,CnB基因含4个外显子和3个内含子,最大开放阅读框为525 bp,编码174个氨基酸。蛋白保守结构域分析显示,CnB基因的预测蛋白含有高度保守的4个“EF-hand”Ca~(2+)结合区域,属于Ca~(2+)结合蛋白家族成员,与小麦叶枯病菌(Phaeosphaeria nodorum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、粗糙麦孢霉(Neurosporacrassa)等植物病原真菌中CnB基因有90%以上的氨基酸同源性。Swiss-model预测叁维结构发现,CnB空间结构由8个螺旋和4个折迭片组成,形成4个螺旋-环-螺旋区域,这与CnB蛋白4个“EF-hand”保守结构功能域相吻合。利用Genomic Walldng技术获得CnB基因5'端上游约2 kb的DNA序列。分析发现,该区域含有明显的启动子活性结构,但没有发现类似TATA盒的元件。存在光应答转录因子G-box以及与细胞分化相关的转录因子DET1、CDA-1等结合元件,推测CnB基因可能在细胞形态建成及光信号传导通路中起作用;发现热激转录因子(HSF)结合元件,推测CnB基因可能在真菌的耐热性和抗逆性方面发挥作用。以CnB基因的DNA序列为探针进行Southern杂交试验,结果表明CnB基因在玉米大斑病菌中以单拷贝形式存在。在优化玉米大斑病菌原生质体制备和再生条件的基础上,基于pSOI质粒构建了玉米大斑病菌CnB基因正义、反义表达载体。利用PEG介导的转化系统,通过转化玉米大斑病菌原生质体获得23个阳性转化子。对继代培养后的阳性转化子进行PCR验证,获得5个潮酶素磷酸转移酶基因插入的转化菌株。转化菌株菌丝细腻,菌落平坦致密,其中两个转化菌株菌落生长速度缓慢。
参考文献：
[1]. 调控玉米大斑病菌生长发育和致病性的STK基因的克隆与功能分析[D]. 谷守芹. 河北农业大学. 2007
[2]. 玉米大斑病菌MAPK基因的克隆和功能分析[D]. 范永山. 河北农业大学. 2004
[3]. 巴西橡胶树棒孢霉落叶病病菌MAPK基因（CCK1）和毒素基因（ct）克隆与功能鉴定[D]. 刘晓妹. 海南大学. 2012
[4]. 玉米弯孢霉叶斑病菌Clm1基因的克隆与功能分析[D]. 王嘉渊. 上海交通大学. 2011
[5]. 玉米大斑病菌StMKP2基因的克隆和敲除载体的构建[C]. 杨阳, 张长志, 范钰, 谷守芹, 董金皋. 中国植物病理学会2012年学术年会论文集. 2012
[6]. 玉米大斑病菌MAPK级联途径中STK1基因的功能研究[D]. 李坡. 河北农业大学. 2009
[7]. 玉米弯孢霉叶斑病菌Clk1基因的克隆与功能分析[D]. 周斐红. 上海交通大学. 2010
[8]. 玉米大斑病菌MAPK级联途径中StSTE12基因的克隆与功能分析[D]. 吴敏. 河北农业大学. 2012
[9]. 玉米大斑病菌MAPK级联途径中STK2基因的功能研究[D]. 武晓波. 河北农业大学. 2009
[10]. 玉米大斑病菌钙调磷酸酶B亚基基因的克隆与功能分析[D]. 刘艳梅. 河北农业大学. 2008