剥夺左眼和单眼学习与雏鸡脑内Jun样蛋白表达的相关性研究1）*，本文主要内容关键词为：雏鸡论文,单眼论文,相关性论文,左眼论文,蛋白论文，此文献不代表本站观点，内容供学术参考，文章仅供参考阅读下载。
1 前言
鸡的前脑结构主要由新纹状体、不发达的海马以及旁嗅球叶等组成。已有资料表明，雏鸡具有两条视觉通路：一条称作离顶盖投射，视觉信息由顶盖向外纹状体投射；另一条称作离丘脑投射，视觉信息由丘脑向上纹体投射[1]。利用雏鸡一次性味觉厌恶条件反射的实验证明， 内侧上纹体腹核（MHV）参与记忆的巩固过程；旁嗅球叶（LPO）对长时记忆的贮存起更重要的作用[2～4]。近年来，大量的研究表明，外部施加的很多因素都可以诱发原癌基因c－fos、c－Jun蛋白在神经元的表达，因此，被广泛地用作神经元活动的一个标志物[5]。同时Fos和Jun蛋白可以转为细胞核内第三信使诱导靶基因的表达。它对神经元功能的变化特别是长时变化方面具有十分重要的作用[6]。本实验目的是利用Jun蛋白的免疫组化技术，观察剥夺左眼和单眼学习在HV和LPO的Jun样蛋白的表达，并进行比较。
2 材料和方法
本实验选用雄性京白904二日龄雏鸡24只， 由北京种禽公司孵化场供应。雏分为八个组，每组三只。第1、2、3组（G[,1]、G[,2]、G[,3]）分别剥夺左眼2.5、4、24小时；第4、5组（G[,4]、G[,5]）剥夺左眼2小时后进行一次性味觉厌恶回避训练，分别于学习后10分钟和70分钟进行记忆保持测试；第6、7组（G[,6]、G[,7]）剥夺左眼24小时后进行训练，记忆保持测试时间与4、5组相同。第8组（G[,8]）为空白对照组。学习训练方法同以往实验[7]。
剥夺左眼训练组分别于记忆保持测试后以及剥夺左眼组在相应时间内，用10%水合氯醛深麻醉（800mg／kg），之后迅速开胸暴露心脏，经心脏，经心脏插入升主动脉后先用20毫升生理盐水快速冲洗，随后用4%多聚甲醛磷酸缓冲液（4℃）pH7.4灌注约5分钟。灌注完毕立即取脑先后浸入上述固定液及20%蔗糖溶液中各2天。 于是从额极开始在冰冻切片机上行50μm厚的连续冠状切片，第25张切片经Jun免疫组化染色。切片在0.2%Tritom x-100液中孵育40分钟后（室温），将切片放入兔抗HSP70单克隆抗体（1∶100）孵育48小时（4℃），抗体用1%血清蛋白磷酸缓冲液（PBS）配置。经PBS洗约10分钟后，切片浸入生物素结合抗兔抗鼠IgG（1∶300Zymed,美国）孵育2小时（室温）。再经PBS洗后，切片浸入链卵白素—生物素结合辣根过氧化酶（1∶300Zymed,美国）孵育2小时（室温）。用PBS充分洗后，采用二氨基联苯胺（DAB）——镍法呈色，呈色液由0.05%DAB，2.5%硫酸镍胺和0.01%过氧化氢在0.05MTris－HCl中配置，pH7.4。呈色后贴片，空气干燥，酒精梯度脱水，透明，D.P.X.封片。
结果处理：第25张切片包含HV和LPO，经c－Jun免疫组化染色后，在400倍光镜下，每张切片取5个视野（100mm[2]／视野）行c－Jun免疫阳性细胞计数，每组取三张。数据经方差分析和t检验处理。
3 结果
经免疫组化染色后，免疫阳性反应的神经元核为深染的蓝黑色，呈圆形或卵圆形、胞质不着色（如图版Ⅰ）。 对于染色较浅的细胞不作为阳性反应计算。
根据观察及计数免疫阳性细胞所做的统计结果显示如表1、2。
表1 剥夺左眼不同时间后在雏鸡HV和LPO内的Jun蛋白表达的比较
剥夺左眼(M±SD)
(阳性反应细胞数)
2.5小时4小时 24小时
(G[,1])
(G[,2])(G[,3])
HV 19.47±1.60
27.60±3.18
30.73±2.69
LPO 22.87±1.92
32.67±2.92
34.20±2.60
从图版I和表1可看到：1）剥夺左眼，无论HV还是LPO部位的阳性反应都随视剥夺时程的增加而急剧上升，视剥夺4小时上升幅度最快， 到了视剥夺24小时这种上升虽然还在继续，但幅度已经开始变慢，尤其是在LPO这种变慢更为明显。方差检验和t检验2.5小时、4小时、24小时各组HV、LPO的组间差异均显著（P＜0.05）。2）LPO 的阳性反应显著多于HV的阳性反映。方差检验和t检验2.5小时、4小时、24小时各组HV、LPO的组内差异显著（P＜0.05）。
表2 单眼学习后不同记忆阶段
Jun样蛋白在雏鸡HV和LPO内表达的比较
剥夺左眼(M±SD)(阳性反应细胞数)
2小时
对照组学习后10分钟
学习后70分钟对照组
(G[,1]) (G[,4])(G[,5])
(G[,3])
HV19.47±1.60
24.60±2.4737.47±3.52 30.73±2.69
LPO
22.87±1.92
31.47±2.6741.47±2.67 34.20±2.60
24小时
学习后10分钟学习后70分钟
(G[,6])
(G[,7])
HV 37.67±3.39 44.33±3.33
LPO42.20±2.81 50.27±4.99
图版I、图版Ⅱ和表2显示：1）单眼学习组HV、LPO的阳性反应在学习后都均显著升高，而且LPO的这种升高明显高于HV，方差检验和t检验各组组内差异显著（P＜0.05）。2）各学习组学习后70分钟HV、LPO的阳性反应都显著高于学习后10分钟HV、LPO的阳性反应（P＜0.05）。
空白对照组（G[,8]）即正常雏鸡HV和LPOJun样蛋白的表达几乎没有。
4 讨论
上述实验结果表明，单眼视剥夺作为一种刺激因素也能导致雏鸡脑内HV、LPO c－Jun蛋白的大量表达，这种表达随剥夺时间的增加而增加，这种增加到何时才达到一个稳定水平、到何时才开始下降还有待于进一步的实验来证实。
单眼视剥夺作为一种应激刺激，必将引起雏鸡脑内一系列应激反应，上述结果表明c－Jun蛋白在这种反应中起重要作用，通过c－Jun蛋白的活动调节了雏鸡脑内神经元的功能，从而调动神经系统应付应激刺激。LPO c－Jun蛋白表达显著高于HV提示可能LPO在应激反应中起更为重要的作用。
我们的实验还表明，学习能促使单眼视剥夺雏鸡c－Jun蛋白表达在HV、LPO进一步显著增加，长时记忆阶段（学习后70 分钟）明显高于短时记忆阶段（学习后10分钟）；学习后LPO的c－Jun蛋白表达显著高于HV。雏鸡不同记忆阶段c－Jun蛋白表达的差异更进一步证实了Gibbs和Ng的记忆三阶段理论[8]，表明长时记忆阶段与蛋白质的表达、 合成关系更为密切。同时表明c－Jun的表达与新的行为经验的获得，与神经元功能的长时变化密切相关[9]。Rose 等人所作的一系列实验表明中间内侧上纹体腹核（IMHV）参与雏鸡记忆的巩固过程，LPO 对长时记忆的贮存起非常重要的作用，而且还通过损毁实验证明记忆信息是由左IMHV经右IMHV向双侧半球的LPO传递的[2～4]，LPO与HVc－Jun蛋白表达的差异提示c－Jun蛋白更多的参与长时记忆的贮存过程， 同时长时记忆阶段HVc－Jun蛋白表达的显著升高暗示HV除了IMHV以外的其它区域可能在长时记忆的贮存过程中也发挥作用。
图版Ⅰ说明：
G[,1]LPO、G[,1]HV：剥夺左眼2.5小时后在雏鸡HV和LPO内Jun样蛋白的表达
G[,2]LPO、G[,2]HV：剥夺左眼4小时后在雏鸡HV和LPO内Jun样蛋白的表达
G[,3]LPO、G[,3]HV：剥夺左眼24小时后在雏鸡HV和LPO内Jun样蛋白的表达
G[,4]LPO、G[,4]HV：视剥夺2小时后单眼学习10分钟后Jun样蛋白的表达
图版Ⅱ说明：
G[,5]LPO、G[,5]HV：视剥夺2小时单眼学习70分钟后Jun样蛋白的表达
G[,6]LPO、G[,6]HV：视剥夺24小时单眼学习10分钟后Jun样蛋白的表达
G[,7]LPO、G[,7]HV：视剥夺24小时单眼学习70分钟后Jun样蛋白的表达
1）本文初稿于1997年3月21日收到，修改稿于1997年5月9日收到。
*国家自然科学基金资助项目。本文作者还有陈双双，姜树军，匡培根。
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