向隆宽[1]1998年在《卡特利链霉菌A520基因文库的构建以及硫霉素生物合成基因的初步研究》文中研究表明用大肠杆菌／链霉菌穿梭载体pKC505在大肠杆菌DH1中构建了卡特利链霉菌A520的基因文库，基因文库由4000个转化子组成，插入的外~1源DNA片段的大小为20—30kb，所含重组质粒的频率很高，基因组的覆盖率在99％以上，基因文库中的重组质粒在—70℃保存两年后检测重组，酶切带型没有变化，重组质粒DNA没有发生重排，基因文库稳定。 根据基因同源性不同杂交严谨度要求不同的条件，应用三个来源的DNA探针杂交筛选基因文库，筛选进行了在不同的严谨度下首在不同的严谨度下先进行了预实验，用卡特利链霉菌A520硫霉素环化酶基因tcs上游1.5kb片段杂交筛选基因文库，得到32个阳性克隆(pKW101—pKW132)，用利波曼链霉菌的IPNS基因杂交筛选得到一个阳性克隆pKW201，用带小棒链霉菌的cs2基因为探针杂交筛选得到一个阳性克隆pKW301。 转化阳性克隆的重组质粒到变铅青链霉菌TK24中，转化子在不同的培养基发酵，以对青霉素G不敏感的沙雷氏菌AG4410为指示菌，进行了活性物质的检测，从4000个转化子中得到变铅青链霉菌转化子(pKW102)和(pKW105)产生对指示菌有抑制作用的活性物质，重组质粒pKW102和pKW105中插入的外源DNA片段为25.3kb和29kb，提示该外源DNA片段可能成在编码硫霉素生物合成基因。 通过Southern杂交分析表明质粒pKW201含有与利波曼链霉菌的IPNS基因、与卡特利链霉菌A520硫霉素tcs基因和与带小棒链霉菌中克拉维酸中cs2基因同源的DNA片段，它们分别位于pKW201／BamHI 2.7kb，4.3kb，和1.9kb的DNA片段上。因此，对pKW201进行了深入的研究。绘制了pKW201限制性酶切图谱并将其BamHI酶切后的外源DNA片段亚克隆到pUC18中，得到pKWG1，pKWG2，pKWG3，pKWG4，pKWG5，pKWG6，pKWG7，pKWG8重组质粒，pKW201含有22.9kb的DNA片段，与IPNS基因同源的DNA片段位于pKWG4上，与tcs基因同源的DNA片段位于pKWG3上，与：cs2基因同源的DNA片段位于pKWG6上。tcs基因紧位于IPNS基因上游，与带小棒链霉菌cs2同源的DNA片段位于IPNS基因下游的2.0kb处。 测序分析结果证实，与利波曼链霉菌IPNS基因同源片段为IPNS基因，其转录方向也与其它β—内酰胺产生菌中的IPNS的转录方向和终止位置一致。 用染色体步移法，以IPNS基因为中心，对位于其上游的tcs基因上游的1.5kb的DNA片段进行了测序，序列测得1097bp个核苷酸，DNA序列分析和编码的氨基酸序列同源性比较表明G+C％为75.3，符合链霉菌GC含量高的特点，由其编码的氨基酸序列和tcs编码的一起与点黄青霉菌的
向隆宽, 王以光, 戴剑漉[2]1998年在《硫霉素产生菌卡特利链霉菌A520基因文库的构建》文中研究说明以大肠杆菌／链霉菌穿梭柯斯质粒ｐＫＣ５０５为载体，构建了卡特利链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃａｔｌｅｙａ）Ａ５２０在大肠杆菌ＤＨ１的基因文库，重组质粒插入外源片段的概率在９５％以上，插入外源片段的大小为２０～３０ｋｂ。以链霉菌染色体分子量为１０４ｋｂ计算，由４０００个转化子构成的基因文库可以概括卡特利链霉菌Ａ５２０约９９％的基因组。用已经克隆的硫霉素环化酶基因上游的１．５ｋｂＤＮＡ片段作为探针杂交，从基因文库得到３２个阳性克隆。用利波曼链霉菌（Ｓ．ｌｉｐｍａｎｉ）中的ＩＰＮＳ基因作为探针杂交，从基因文库得到１个阳性克隆ｐＫＷ２０１／ＤＨ１，并为Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交进一步证实杂交片段在ＢａｍＨⅠ２．７ｋｂ片段上。用来自带小棒链霉菌（Ｓ．ｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ）的克拉维酸生物合成途径中的环化酶基因ｃｓ２作为探针杂交进行筛选，得到１个阳性克隆ｐＫＷ３０１／ＤＨ１，说明所构建的基因文库比较完整，并为进一步研究硫霉素产生菌卡特利链霉菌Ａ５２０中抗生素生物合成基因打下了良好基础
参考文献：
[1]. 卡特利链霉菌A520基因文库的构建以及硫霉素生物合成基因的初步研究[D]. 向隆宽. 中国协和医科大学. 1998
[2]. 硫霉素产生菌卡特利链霉菌A520基因文库的构建[J]. 向隆宽, 王以光, 戴剑漉. 中国抗生素杂志. 1998