尹增芳[1]2000年在《美洲黑杨维管形成层发生发育的细胞生物学研究》文中研究说明利用光学显微镜和电子显微镜首次详细地观察研究了美洲黑杨维管形成层的发生和发育，结果表明： 1．美洲黑杨茎端由原形成层向维管形成层的转化是逐渐进行的，其细胞的超微结构特征呈现渐进式的变化，在叶发育成熟，节间伸长生长停止后，转化基本完成。 2．维管形成层为非叠生型，只具一层原始细胞，其细胞核分裂的过程与植物根尖和茎尖分生组织细胞基本相似，但胞质分裂方式非常特殊，新细胞板沿着细胞质柬的方向发育形成。 3．维管形成层木质部母细胞进一步分化形成导管、胶质纤维、韧型纤维和木薄壁细胞。木质部管状分子的分化分三个阶段进行：①细胞径向扩张；②具缘纹孔的发生和次生壁的构建；③原生质体的自溶。 4．维管形成层韧皮部母细胞分裂分化形成筛管、伴胞、韧皮薄壁细胞、韧皮纤维和少量的石细胞，筛管和伴胞来源于筛管母细胞的不均等有丝分裂。按照液泡膜和质膜的是否发生裂解可将筛管的发育划分为三个时期：①未成熟期；②成熟期；③衰退期。伴胞在筛管的衰退期表现出典型的细胞编程性死亡的细胞学特征。 5．维管形成层的活动具有明显的周期性。南京地区生长的美洲黑杨维管形成层一般在每年的3月中旬开始恢复活动，4月中旬至7月下旬为活动旺盛期，随后维管形成层的活动减弱，8月底到12月初为由活动向休眠转化时期，12月到翌年的2月为维管形成层的休眠期。在维管形成层细胞周期性活动中，细胞器及细胞内含物发生了一系列的动态变化。
尹增芳, 樊汝汶[2]2006年在《美洲黑杨次生维管组织发育的内在节律性与细胞内含物的动态变化》文中认为美洲黑杨(Populusdeltoids)是一种重要的商业用材树种,在我国多用作胶合板和纸浆原料,其速生性的特点也很早为人们所认识。众所周知,树木次生维管组织的发育具有内在的节律性,与此同时维管组织的细胞内含物也会发生动态变化。利用电镜技术及细胞化学方法,研究了美洲黑杨次生维管组织的发育以及细胞内含物分布的变化,发现次生维管组织的发育具有内在节律性,在年周期中表现为分化期和休眠期交替出现;次生韧皮部与次生木质部交替分化形成。在维管组织发育过程中,早期蛋白质和脂类物质首先减少,然后淀粉粒解体消失,发育期内维管组织的蛋白质、脂类和淀粉的积累最少,休眠期内维管组织细胞内最早出现淀粉的积累,然后蛋白质和脂类物质积累大大增加。杨树维管组织发育过程的内在节律性与细胞内含物的动态变化密切相关。
李少锋[3]2011年在《美洲黑杨(Populus deltoides)材性相关侯选基因的克隆和功能验证》文中研究说明林木木材性状的改良是树木遗传改良的重要组成部分,目前对林木木材性状调控机理的研究已成为树木分子生物学研究的热点。美洲黑杨(Populus deltoides Marsh.)具有速生、丰产、木材品质优良等优点,前期研究发现成年美洲黑杨树木主干不同高度处基因的表达量与木材密度、微纤丝角大小等木材性状指标存在差异,由此建立了未成熟木质部c DNA表达芯片。通过芯片研究发现,小GTP结合蛋白基因Pd RAN、膜结合蛋白基因Pd REM、扩展蛋白Pd EXT和细胞分裂素结合蛋白基因Pd CYTOB,这四个基因与材性指标木材密度和微纤丝角密切相关。通过RT-PCR方法对这四个材性候选基因进行了分离,并进行基因功能分析和验证,初步阐明了这些基因的材性功能和可能的分子作用机理,进而为培育速生丰产、具备优良材性价值和用途的杨树新品种奠定基础。获得的主要研究结果如下:1.首次从杨树中克隆与木材性状相关小GTP结合蛋白基因Pd RAN。该基因编码区全长为666bp,可编码221个氨基酸残基的蛋白质。基因表达模式研究发现,Pd RAN在叶芽中的表达量尤其高,在未成熟木质部、未成熟韧皮部、叶片、韧皮部、花芽依次降低,而木质部中检测到的Pd RAN基因表达量最低。亚细胞定位研究表明Pd RAN蛋白定位在细胞核。为进一步研究Pd RAN基因在材性方面的功能,构建了该基因的正、反义和RNAi表达载体,并利用农杆菌介导的叶盘法将其导入杨树和烟草中,花序浸染法将其导入拟南芥。PCR检测和Southern杂交实验显示,Pd RAN基因已整合到受体杨树基因组中。荧光实时定量PCR分析表明转基因植株目标基因的转录水平发生了改变。山新杨株系的表型观察发现,Pd RAN正义转化植株分支增多,而反义转基因植株则促进生长和加粗。相比对照野生型拟南芥,转Pd RAN基因正义表达载体拟南芥植株茎粗叶茂,高度增加,生殖期推迟。对转基因山新杨茎横切面进行组织切片研究发现,Pd RAN正义转基因植株木质部区域明显变窄,反义转化植株木质部明显变宽,韧皮部的变化趋势与木质部大致相似,由此可初步推测Pd RAN可能作为负调控因子参与木材的发育和品质的形成。Pd RAN基因正义转化植株的微纤丝角变小,有利于木材品质的改良。2.首次从杨树中分离与木材性状相关的膜结合蛋白基因Pd REM。该基因编码区全长612bp,编码蛋白具有203个氨基酸。基因枪法研究表明,EGFP-Pd REM融合蛋白定位在细胞膜。Pd REM基因的组织时空表达研究发现,Pd REM特异在美洲黑杨叶芽、未成熟木质部和韧皮部有较高水平的表达量,其次在木质部、韧皮部、未成熟韧皮部有一定的表达水平,而花芽中检测到的Pd REM基因表达量最低。构建Pd REM基因的正反义表达载体,遗传转化山新杨、烟草,通过花序浸染法将表达载体遗传转化到拟南芥中。定量RT-PCR研究表明,正、反义Pd REM表达载体改变了转基因植株靶基因的转录水平。Pd REM反义转化的杨树植株比对照茎部粗壮,地径增大,叶片数增多,转Pd REM正义表达载体的杨树植株比对照非转基因植株矮小,茎干变细,地径变小。转Pd REM基因正义表达载体拟南芥植株粗壮,开花期延后。切片观察发现,Pd REM反义转化杨树植株木质部区域相比对照明显变宽,而正义转化植株木质部区域明显变窄,表明Pd REM可能是一个负调控因子。Pd REM正反义转化植株相比对照植株微纤丝角均变小,初步判断该基因在转基因微纤丝角的改良中起作用。3.首次从美洲黑杨未成熟木质部中分离与木材性状相关的扩展蛋白基因Pd EXT。该基因编码区长为423bp,Pd EXT蛋白有140个氨基酸。利用维管组织特异启动子pro NAC068载体,成功构建了美洲黑杨Pd EXT基因的正反义表达载体。运用农杆菌侵染法,将携带有目标基因载体的GV3101农杆菌侵染84k银腺杨叶片,通过花序浸染法将表达载体遗传转化到拟南芥。PCR检测表明获得Pd EXT基因正反义银腺杨转化植株。转Pd EXT基因正义表达载体拟南芥植株相比对照叶片保持鲜绿,茎枝条粗壮,花期延后,株型搭配合理。4.细胞分裂素结合蛋白基因Pd CYTOB的功能验证。利用RT-PCR技术研究了美洲黑杨材性相关候选基因细胞分裂素结合蛋白基因Pd CYTOB的表达谱,结果显示在未成熟木质部、未成熟韧皮部、韧皮部中Pd CYTOB基因具有较高水平的表达量。对导入反义Pd CYTOB的山新杨植株进行Southern杂交和RT-PCR检测,证实Pd CYTOB基因已整合到杨树基因组中并表达。对大田转基因株系及对照植株进行表型观察、组织切片和微纤丝角的测定。结果表明,Pd CYTOB反义转化植株高度明显增加,木质部、韧皮部有所变宽。转Pd CYTOB基因植株的微纤丝角明显变小,初步表明转基因杨树在造纸性能上有所改良。这对于阐明Pd CYTOB在美洲黑杨木材形成中的分子作用机制有重要的理论意义。
尹增芳, 樊汝汶[4]2008年在《美洲黑杨次生木质部导管分化进程的超微结构分析》文中研究表明利用常规电镜技术,观察研究了美洲黑杨Populus deltoides次生木质部导管分化过程的超微结构变化。结果表明:美洲黑杨导管形态的建成可划分为初生壁的延展、次生壁的构建与穿孔板的形成等3个时期。初生壁的延展是导管分化的初始阶段,导管细胞高度液泡化,细胞质及其细胞器贴壁分布。次生壁的构建是导管分化的关键阶段,次生壁物质的沉积在导管液泡膜破裂之前即已开始,此时导管分子内细胞器结构清晰,其中高尔基体及其分泌小泡最为丰富,说明高尔基体与次生壁物质的合成及运输密切相关;导管分子液泡膜裂解后,次生壁物质沉积极为迅速,伴随次生壁物质的合成,导管分子细胞质解体,细胞核染色质凝聚并边缘化,表现出程序化细胞死亡(PCD)的典型特征。穿孔板的形成是导管分化的终极阶段,在导管次生壁形成时,相邻导管分子的端壁上不发生壁物质的积累,而且在次生壁构建后期,端壁上的壁物质降解,最后残余的端壁断裂形成穿孔板。美洲黑杨次生木质部导管的分化阶段彼此相继有序地进行,其中次生壁构建的启动是导管分子不可逆分化的临界期,随后的分化阶段是一种典型的PCD过程。图2参13
杨成超[5]2010年在《黑杨苗期高生长形态建成和杂种优势的研究》文中研究说明杨树(Populus)是具有重要经济学和生态学价值的双子叶木本植物。黑杨派树种,尤其是美洲黑杨(P. deltoides Marshall)和欧美杨(P. euramericana),高生长速度较快,是研究高生长的代表性树种。一年生苗的高生长在杨树高生长形态建成研究中占据重要地位。为探讨黑杨高生长形态建成的分子基础,确定杂种优势分子机理的试验材料和采样策略,本文从形态学、组织学、内源激素、分子生物学角度研究了一年生苗高生长形态建成与杂种优势,试验结果如下:通过对凌丰1号杨、347杨和荷兰3930杨的定位观测,总结出黑杨在苗期具有如下特征:(1)在生长季的某一时间点上,不是所有节间都在伸长。伸长节间的数量是有一定范围的,不同月份伸长节间的数量不同,一般在6个节间之内。在全生长季,在较大的欧美杨及美洲黑杨群体中,群体的伸长节间数的出现频数表现为右偏分布,而伸长节间数为1～6节的出现频数近似于正态分布。伸长节间数为3～4节的出现频数最高,最多的伸长节间数达到8个。(2)在苗木生长的不同阶段,节间长和节间数2个要素对高生长的贡献不同。节间数是高生长构成中最重要的要素,对高生长起主导作用,其次是节间长。节间发生率越高则高生长越快。各节间的伸长是独立的,节间之间是无影响的。(3)在全生长季,欧美杨和美洲黑杨的高生长符合慢～快～慢“S”型曲线规律。总体来看,茎尖的第二节间和第四节间细胞联系比较致密,韧皮部、形成层、木质部之间联系也紧密,细胞长度较短,细胞较小。从第六节间开始,表皮、皮层、韧皮部、木质部等各组织部位间联系松散,节间伸长趋于停止。从茎尖的横切和纵切图可以看出,原生分生组织不断分化出叶,形成茎,是分生区。分生区与伸长区的边界大概在第一节间。而从表皮、皮层等各个组织部位之间联系的紧密程度和细胞尺寸来看,第六节间是分生区和成熟区的界限,这与节间定位观测结果一致。从内源IAA的测定结果来看,顶芽,顶节和幼叶三个组织部位的内源IAA含量都是7月的含量高于5月的含量,而7月的节间数月增加量也高于5月节间数月增加量,从表面上看二者成正相关关系。对凌丰1号杨来说,它在7月的节间数月增量比5月的高,苗高也是7月的高,内源ABA含量也如此。不同发育时期的节间数量增加量不同,这可能与IAA及ABA含量有关。然而不同无性系的高生长量不同,不能通过内源IAA或ABA含量来进行早期预测。采用RACE技术,从欧洲黑杨中克隆出生长素诱导基因IAA9,大小为1786bp。通过计算杂种优势,在50号×荷兰3930和中驻6号×巨霸杨之间选择具有超亲杂种优势中驻6号×巨霸杨为准备做基因表达谱试验的试验材料。同时,从苗高、地径、叶片长和叶片宽四个性状中确定苗高为目标性状。根据定位观测的结果和组织结构切片实验结果确定与高生长密切相关的是顶芽和第一节间,采集茎尖即可代表目标性状。在采样时间上,根据高生长形态建成的“S”型生长曲线图确定采样的最佳时间是7月中旬。本论文为杨树高生长形态建成和杂种优势分子机理研究打造了一个平台。下一步拟定研究内源激素含量配比与苗高生长、IAA9基因功能验证和杂种优势分子机理。
王大海[6]2008年在《美洲黑杨材性侯选基因的克隆和功能分析》文中研究说明近年来,木材形成的分子机制研究已成为植物分子生物学研究热点之一,而针对木材性状控制分子基础的研究很少。基因芯片分析技术具有高通量、高灵敏度和高可信度等特点,是植物功能基因组学研究的有力工具之一。本研究从美洲黑杨(Populus deltoides)主干不同高度存在木材性状差异入手,通过构建杨树未成熟木质部cDNA文库,制作cDNA表达芯片,用于研究主干不同高度处基因表达差异,筛选出树木材性相关候选基因;克隆部分候选基因的全长序列,包括基因组上全长序列,分析其在杨树基因组上的分布情况;在此基础上,构建适合杨树基因功能研究的pRNAi载体和部分候选基因的RNAi、反义表达载体,对杨树组培苗进行遗传转化、转基因鉴定和候选基因表达分析,主要研究结果如下:(1)成年美洲黑杨母树主干不同高度木材密度和微纤丝角(microfibril angle)大小分布存在差异,木材密度(wood density)随高度呈下降趋势,而微纤丝角呈先下降后上升趋势;杨树主干由下而上,木材微纤丝角大小与密度之间相关性不大。(2)利用SMART技术构建了美洲黑杨及美洲黑杨×青杨(Populus deltoides×Populus cathayana) F2子代未成熟木质部全长cDNA文库。从美洲黑杨和美洲黑杨×青杨F2子代未成熟木质部文库中分别随机挑取10000和5000个单克隆用于芯片探针制备,获得11181个单一cDNA探针,制作cDNA表达芯片,用于杨树主干不同高度处基因表达分析。筛选出差异表达点274个,并进行序列测定;得到125条单一序列,与已知功能同源的序列62条,占49.6%;其中,抵抗环境胁迫相关的基因占11%,参与基因功能调控4%,参与合成细胞结构组份有关的基因和转录因子各占6%,与信号传导有关的基因占8%,代谢和次生代谢有关的基因占8%;余下63条序列中,有60条序列在杨树ESTs数据库找到同源序列,有3条序列在EST数据库无同源序列,为美洲黑杨特异表达的序列;(3)芯片实验发现,组成细胞组分的核糖体rRNA在美洲黑杨主干高密度部位(基部)表达量高;而组成染色体组蛋白H2B1在低密度部位(4 m,6 m)表达量高;丙苯氨酸解氨酶和4-香豆酸-CoA连接酶与木材密度之间的相关系数绝对值分别为0.69和0.95,推测两种酶的表达与木材密度相关;植物Remorin蛋白与维纤丝角分布的相关系数为0.92,表现出很高的相关性;转录因子中,锌指蛋白、细胞延伸因子、CCR4相关因子、DNA/RNA结合蛋白与木材密度的相关性高,其表达可能影响木材密度的形成;乙烯应答元件结合因子的不同基因表达各不相同,乙烯应答元件结合因子4、乙烯应答元件结合因子5和乙烯应答元件结合蛋白与木材密度相关性好,但乙烯应答元件结合蛋白3的表达与木材密度相关性差;控制细胞生长发育或组织器官形成有关的基因中细胞周期有关蛋白,微管组织结构形成有关基因,细胞生长/分化有关基因与木材密度相关性较大,可能与木材密度形成有关。从测序结果分析来看木材密度及微纤丝角大小分布与一些调控有关的基因表达水平间具很高的相关性。这一结果表明,控制木材性状的主要是一些调控基因,而非直接行使功能的基因。(4)采用RACE技术克隆ZF-RNG、CytoB和EXO全长cDNA;利用拟基因组文库染色体步行法(VGL-Walking)从杨树基因组上获得ZF-RNG全长序列和CytoB 5’端序列。经Spidey软件分析,ZF-RNG基因包含有9个内含子和10个外显子; Blast软件分析表明,ZF-RNG基因位于杨树基因组LG_VI 16611332-16616623物理位置,并在基因组LG_XVIII上具部分同源序列; CytoB基因在染色体上为双拷贝,分别位于杨树基因组数据簇LG_IX物理位置的8914871- 8915817和LG_I物理位置的17937655-17938359。(5)对目标基因在未成熟木质部、叶片组织、花芽和叶芽中的表达状况分析, ZF-RNG基因在花芽中表达量最高,未成熟木质部组织次之,叶片组织和叶芽中表达量相差无几,结果表明该基因与发育相关;EXO基因在叶片中表达量最高,其它部位间表达量相差无几;CytoB基因在花芽和叶芽组织中表达量最高,在叶片组织中表达量低,而未成熟木质部组织中表达量一般。(6)克隆了ZF-RNG基因内含子Intron 9片断,利用pUC19克隆载体和pBI121植物表达载体,构建pRNAi载体;利用pRNAi载体、pBI121 Hind III、EcoRI酶切载体片段和CytoB扩增的CDS片段,构建成CytoB基因反义表达载体pAntiCytoB和RNAi表达载体pRNAi-CytoB2EX;采用农杆菌介导法,对中国山杨(Populus davidiana)组培苗25#进行遗传转化,获得再生植株;经PCR验证,获得34个CytoB RNAi转化子和7个CytoB反义转化子;随机对其中2个CytoB RNAi转化子和2个CytoB反义转化子进行RT-PCR检测,其中标号为A24的CytoB RNAi转化子的表达量降低到1/5以下,而其它三个转化子基因表达不发生变化。
李红[7]2004年在《杨树高频再生体系的建立及耐盐碱基因转化的研究》文中进行了进一步梳理本研究以毛白杨系品种:二倍体雌、雄株及三倍体雌、雄株和美洲黑杨的芽及叶片为外植体材料,系统的研究了杨树组织培养的影响因素,建立了五种杨树的高频再生体系;并采用农杆菌介导的基因转化法,将耐盐碱基因(OsNHX1)导入美洲黑杨基因组中,经PCR分子鉴定,表明已获得了OsNHX1基因的转化植株。具体工作如下:1. 杨树组织培养和高频再生体系的建立选用五种杨树芽、叶片进行组织培养,诱导再生,得到了白杨系外植体最适分化培养基为:MS+BA1.0(mg·L-1,单位下同)+NAA0.1+GA0.5,分化率可以达到90%以上;美洲黑杨再生培养基为:MS+BA0.5+NAA0.1+GA0.5,分化率可以达到99%以上;生根培养基:MS+NAA0.1。2. 种间基因型的差异是影响植物外植体再生能力的决定性因素;种内基因型此种效应不明显;植物基因组中调控再生能力的基因不是性染色体连锁;调控再生能力的基因不存在染色体组倍数的叠加效应。3. 在建立了美洲黑杨高频转化受体系统的基础上,进行了农杆菌介导的耐盐碱基因(OsNHX1)的转化研究;并从工程菌的活化状态、侵染时间等方面阐述了杨树基因转化中的影响因素;采用分级筛选的方法,对抗性芽进行筛选,并在筛选生根培养基中生根,得到了转化植株;以未转化植株为阴性对照,以质粒DNA为阳性对照,进行PCR检测。结果表明,转化植株扩增的条带和质粒中的目的条带一致,而未转化植株没有扩增出任何条带,说明外源目的基因已经整合到美洲黑杨基因组上。
参考文献：
[1]. 美洲黑杨维管形成层发生发育的细胞生物学研究[D]. 尹增芳. 南京林业大学. 2000
[2]. 美洲黑杨次生维管组织发育的内在节律性与细胞内含物的动态变化[J]. 尹增芳, 樊汝汶. 植物学通报. 2006
[3]. 美洲黑杨(Populus deltoides)材性相关侯选基因的克隆和功能验证[D]. 李少锋. 中国林业科学研究院. 2011
[4]. 美洲黑杨次生木质部导管分化进程的超微结构分析[J]. 尹增芳, 樊汝汶. 浙江林学院学报. 2008
[5]. 黑杨苗期高生长形态建成和杂种优势的研究[D]. 杨成超. 中国林业科学研究院. 2010
[6]. 美洲黑杨材性侯选基因的克隆和功能分析[D]. 王大海. 中国林业科学研究院. 2008
[7]. 杨树高频再生体系的建立及耐盐碱基因转化的研究[D]. 李红. 辽宁师范大学. 2004
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