王梦佳1 达雨2 袁晓3
（1.南京市口腔医院 210000 2. 南京同仁医院口腔科 210000 3.青岛市市立医院口腔科 266000）
摘要 目的：本研究的目的即是探讨动物模型模拟功能矫形治疗后其翼外肌组织的生长(改建)的机制并对NF-κB的主要亚基p65是否参与激活该信号传导通路加以研究。方法：将20只4周龄，雄性SD大鼠随机分成4组进行下颌前伸模型构建，在加力1d、7d、14d、21d提纯翼外肌组织后提取蛋白并对其进行浓度测定，应用Western blot检测NF-κB p65蛋白的表达情况。结果：Western印迹显示在实验组大鼠的翼外肌组织核蛋白中p65随张应力作用时间延长而出现表达下调，而对照组中的表达无明显变化。结论：张应力刺激可激活NF-κB信号转导通路中p65的表达变化。
关键词：p65蛋白；NF-κB信号通路；功能矫治
The expression of p65 in NF-κB signal pathway in the musculus pterygoideus laterals of the adolescent rats mandibular posterior with functional appliance
Wang mengjia1，Da yu2，Yuan xiao3＊
(1. Nanjing Stomatological Hospital 2. Department of stomatology, Nanjing Tongren Hospital 3. Department of stomatology, Qingdao Municipal Hospital)
ABSTRACT Objective: The purpose of this study is to investigate the expression of “stress-growth (reconstruction)” at the cellular level for provide new ideas and experimental evidence about functional orthopedic treatment. Methods: Twenty, Juvenile SD rat mandibular anterior extension model was constructed, lateral pterygoid muscle tissue purification after 1d, 7d, 14d, 21d mechanical stress，extraction and determination of the concentration of protein and by Western blot analysis of NF-κB p65 protein. Results: Western blot showed that the expression of p65 was down regulated in the lateral pterygoid muscle tissue of the rats in the experimental group, but the control group had no significant change. Conclusion: activation of p65 may be involved in the expression of skeletal muscle in the. The stretch force stimulates the expression of p65 in the NF-κB signal pathway.
Key words：p65 protein kinase; NF-κB signal pathway; functional orthopedic treatment
应力与肌、骨细胞及组织的改建具有密切的联系，这决定了生物力学在口腔正畸学中的重要作用[1]。应力刺激可直接影响骨骼肌的生长及改建过程，这一理论已经被诸多研究所证实。功能矫治器 (functional appliance)能有效的控制面颌部肌肉对于牙齿和颌骨所施力的大小、方向和作用时间，使口面区域的神经肌肉环境有利于牙合发育和颅面生长以纠正错颌畸形的发生、发展，故被广泛运用于口腔正畸临床治疗。翼外肌是参与功能矫形治疗的主要肌肉之一，由于咬牙合重建下颌被引导性前伸故前伸肌—翼外肌收缩，肌张力增加。为了维持下颌处于这一被动性前伸位，翼外肌随即发生适应性改建。涉及这一过程最重要的细胞学基础是骨骼肌中的成肌细胞。成肌细胞是小的单核梭形细胞，亦是一种源于胚胎中胚层的干细胞。在正常骨骼肌中，它位于基底膜与肌纤维浆膜之间，处于静止状态。当受到外界刺激，在应激状态下可以分裂、增生，形成新的肌纤维，是骨骼肌再生、损伤后修复与适应性改建的储备力量。因此，成肌细胞特有的成肌能力倍受重视[2,3]。
NF-κB（nuclear factor-kappa B）是从B淋巴细胞的细胞核抽提物中找到的转录因子，它是真核细胞转录因子Rel家族成员之一，广泛存在于各种哺乳动物细胞中。迄今为止，在哺乳动物细胞内共发现5种NF-κB/Rel家族成员，它们分别是RelA(p65)、RelB、C-Rel、NF-κB1及NF-κB2。细胞内NF-κB的活化过程被精细调控。通常情况下,在细胞质中的NF-κB与抑制蛋白IκB(inhibitory protein of NF-κB)结合成三聚体复合物。一旦出现TNF-α信号、炎症因子以及LPS、紫外线等外界刺激时，细胞因子与细胞膜表面的NF受体结合后，TNF受体发生多聚化并与细胞质中TRADD分子发生相互作用。TRADD招募TRAF(TNFR-associated factor)和激酶RIP(receptor interacting protein)，由RIP将信号传递给IKK(IκB kinase)。在NF-κB信号通路中IKK扮演了非常重要的角色。IKK由α、β和γ三个亚基组成, 作为激酶的IKK能使IκB的α亚基的Ser32和Ser36残基和β亚基的Ser19和Ser23残基磷酸化。IkB随即从p50/p65/IκB异源三聚体中解离出来,经泛素化修饰后通过蛋白酶体降解。于是，受到IκB抑制的NF-κB得以暴露其核定位序列，迅速从细胞质进入细胞核内，与核内DNA上的特异序列相结合，从而启动或增强相关基因的转录[4]。
本实验模拟临床轻中度骨性II类错颌畸形的功能矫治过程,采用western-blotting技术，分析功能矫形治疗对翼外肌组织中NF-κB p65蛋白表达的影响，并对应力介导下调控NF-κB这一信号通路的作用机制进行初步探讨。
1. 材料与方法：
1.1 实验动物的选择与分组
本实验选用处于青春期的4周龄雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠(山东鲁抗医药公司提供, 动物等级:SPF级)20只。体质量为(100±5)g，饲养温度约27°C。自由饮水，定时摄食，随机分为实验组和对照组，按组别分别戴用1天、7天、14天、21天。
1.2 青春期 SD 大鼠前伸下颌模型构建
SD大鼠试喂养3天后进行试验，期间对实验组大鼠行腹腔注射2%戊巴比妥钠(30mg/kg)后取上颌模型并制作可摘式上颌斜面导板12副。矫治器每天戴用时间为12h，20:00~次日8:00，用人工光源控制12/24小时昼夜节律。实验组大鼠自由供给饮食，对照组大鼠限制饮食，自由饮水，以确保两组动物体重增加量相当。每日去除矫治器后，以牙刷清理食物残渣，置于2%的戊二醛溶液中浸泡消毒12h。再次戴用前以大量清水洗净残留消毒液。矫治器的设计参照Petrovic[5]所使用的矫治器并加以改良。矫治器由塑料底板、斜面导板和口外辅助固位装置三部分构成。斜面导板为6mm×8mm白合金带环片，斜面导板与上颌咬合平面呈约30°，矫治器戴于大鼠上切牙，为防止矫治器脱落，通过固位臂用橡皮圈固位于大鼠鼻上颌复合体。当大鼠闭口进行功能运动时,下切牙咬在斜面导板上,下颌被引导前伸约 3mm。口外辅助固位装置为4cm×3cm有机玻璃材料制成，用橡皮筋使之与斜面导板部分相连(图1)，能有效的防止大鼠因前爪抓挠引起的矫治器脱落及对其面部组织的伤害。
图1 SD大鼠下颌前伸模型
1.3 主要试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS、10%分离胶、4％浓缩胶、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl溶液、2X(5X)SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X立春红染液、封闭剂、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、Anti-NF-kBp65 antibody-N-terminal、Pierce BCA蛋白定量试剂盒、电泳仪(Bio-Rad)、凝胶分析成像系统(Bio-Rad)。
1.4翼外肌组织制备
2%戊巴比妥钠经腹腔注射于实验组大鼠体内，待其麻醉后采取颈椎脱臼法致其死亡，侧放于手术台上。沿下颌支及下颌体后缘切开皮肤，翻开皮肤暴露术野。眼科剪剪断附着在下颌骨体内侧的肌肉，眼科镊轻向外牵拉下颌骨髁突部，可见到起于翼骨外侧面的凹内和腭骨的翼外肌，翼外肌呈水平反向向后外止于下颌骨髁突。剪取SD大鼠一侧的翼外肌组织。术中取材尽量迅速，同时避免刺破血管减少血红蛋白对样本的污染。将组织切割成约25mg的小块，置于EP管内。EP管标记后立即置于冰盒。
1.5 翼外肌组细胞核蛋白提取及浓度测定
1)按实验要求将组织从动物体内取出，用预冷的生理盐水冲洗后，取约100mg组织块放入EP管打进预冷的含有1‰PMSF的生理盐水，用剪刀尽量减碎, 研磨至没有块状形态后离心，弃去上清导入生理盐水继续操作以求组织碎裂并清洗干净共3遍。2)向EP管中放入300μl裂解液，冰上放置孵育30min。3)超声裂解细胞；工作时间设置为45s，pulse的on、off均设置为4s，Amplifier设置为30%。4)低温离心机，4°C下，20000rpm，30min。离心结束后取上清分装至新的EP管内。5)BCA 法蛋白浓度测定：采用Pierce BCA蛋白定量试剂盒推荐的实验步骤进行全细胞裂解产物微量蛋白定量测定，计算各组蛋自浓度。根据预实验结果, 细胞裂解产物解冻后稀释4倍，作为待测样品。按照蛋白定量试剂盒说明, 配制工作液与标准液。将25ul标准液或待测样品与500ul工作液混匀，37°C 水浴30min,而后在分光光度仪上测波长562nm时的光密度值,得到标准曲线及细胞裂解产物的蛋自浓度。
6)调整各组蛋白浓度,将各样本细胞裂解产物与5×上样缓冲液按4:1 的比例混匀,95°C水浴煮沸5分钟，-20°C保存待用。每个样本终浓度为2ug/ul。
图2 标准蛋白曲线
2.1 WesternBlotting 检测 NF-κB p65蛋白的表达
l)根据欲分离的蛋白质分子量大小选择适合的凝胶浓度。本研究所使用的分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为4%;2)待胶凝固后将标准10孔加样梳取出,移至电泳槽内加入电泳缓冲液,每泳道加样25ul(即 50ug蛋白质);3)SDS-PAGE 电泳(变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳),把电泳装置与电源连接好, 将电压调至80V电泳约15-20min,待溴酚蓝迁移出浓缩胶位置再换用100V, 80min后关闭电源。电泳完毕后按 5×8cm面积切胶;4)用眼科剪剪去 PVDF 膜的左上角作为标记,甲醇处理3秒后放入双蒸水中水化3分钟;5)小心剥下凝胶,将其与 PVDF 膜于电转缓冲液中平衡30min,3mm滤纸(6张)在电转缓冲液中浸泡5分钟;由电极正极到负极依次以滤纸(3张)-PVDF膜-凝胶-滤纸(3张)的顺序移入电转仪内,排除所有气泡;
6)Wealtec半干电转仪4°C 10V电压下电转 60min,将蛋白质转移到PVDF(polyvinylideneoifluoride)膜上;7)将PVDF膜浸没在丽春红染色液中,摇动5-10分钟;取出PVDF 膜,用蒸馏水漂洗2-3 次,待出现清晰条带,记录结果;用蒸馏水漂洗2-3次,每次3-5分钟,去除丽春红,进行后续的WB检测;8)将膜封入加有兔抗鼠 NF-kB p65x的多克隆抗体(用含5% BSA 的 TBST 作为 一抗稀释液稀释磷酸化抗体,一抗工作浓度为 1:800)的塑料袋中,4°C过夜;9)TBST漂洗 10min×3 次,将膜封入加有二抗:辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊 抗兔 IgG(二抗封闭缓冲液稀释二抗至工作浓度 1:10000)的杂交袋，37°C恒温杂交lh;10)TBST漂洗10min×4次,最后用不含Tween-20的TBS 漂洗10min;11)沥干PVDF膜,按化学发光试剂盒说明配制发光底物,其A液和B液按1:1比例混匀后,均匀地涂在膜上,处理 5-8min;12)弃去多余的发光试剂,用新杂交袋封PVDF膜,在暗盒中曝光3min 后取出PVDF膜。放在显影液中显影,待出现目的图像后,冲洗X光片，将X光片放在固定液中固定5-6min,重新泡在水中,取出晾干。13)同法洗脱后杂交p65检测。
2.2 图像分析
运用Bio-Rad凝胶扫描及图像分析系统对同次电泳所得p65条带及内参 β-actin进行灰度分析。测定每个条带的灰度值,将各组条带的灰度值与其相 应的β-actin(β肌动蛋白)条带灰度值相比,测量三次取其平均值。数据用直 方图描绘出(表3-1), 3.结果显示p65在成肌细胞核内的表达变化量。
4.讨论
本实验的研究结果显示:功能矫形力作用于翼外肌组织的最初阶段其p65表达明显上调,但随应力作用时间的延长其表达呈现递减趋势。同时,在功能矫形力作用下SD大鼠成肌细胞的NF-κB信号转导通路被激活。但随着应力作用时间的延长,其NF-κB p65的表达活性减弱。[5-8]
参考文献
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作者基本信息：
王梦佳（1986.02-）女，河北保定人，学历：硕士研究生。主要研究方向：生物力学。邮箱：rain_da@126.com。
论文作者:王梦佳1,达雨2,袁晓3
论文发表刊物:《医师在线》2016年3月第5期
论文发表时间:2016/6/16
标签：缓冲液论文; 大鼠论文; 浓度论文; 蛋白论文; 细胞论文; 下颌论文; 电泳论文; 《医师在线》2016年3月第5期论文;