吕桂善[1]2003年在《乳源抗高血压生物活性肽在大肠杆菌中表达的研究》文中研究表明课题背景： 高血压是一种慢性的心脑血管疾病，是冠心病，脑卒中等心脑血管疾病的主要危险因素。据统计，全世界每年因高血压引起的心脑血管疾病的死亡人数超过1200万，高血压病已成为人类健康的第一杀手，成为全球性的重大的公共卫生问题。目前，世界卫生组织(WHO)批准用于治疗高血压病的一线药物主要有利尿剂、β受体阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、钙通道阻滞剂(CaA)、α受体阻断剂、血管紧张素(Ang)受体拮抗剂等六大类。 研究表明，肾素-血管紧张素系统(RAS)在机体的血压调节过程中起着十分重要的作用。在该系统中，ACE酶是血压调节过程中一个关键的酶，它可以将无活性的血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)水解生成具有血管收缩作用的血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)，从而导致血管收缩，机体的血压升高。ACEI可抑制ACE酶的活性，从而抑制了AngⅠ向AngⅡ的转化，使机体血压维持恒定。因此，ACEI在治疗高血压病中的应用也越来越广泛。但是使用药物治疗都有一定的副作用，所以，寻找安全的、天然的、食物来源的ACEI物质来治疗高血压引起了广大科学家们极大的关注。 有研究报道，在牛乳酪蛋白的胰蛋白酶水解物中分离到了一些在体外具有ACE酶抑制活性、经动物实验(体内实验)证明具有降低血压作用的抗高血压生物活性肽。这一研究结果引起了科学家们的极大兴趣，极大地促进了乳源抗高血压小肽的研究。然而，到目前为止，所有的乳源抗高血压小肽都是通过蛋白酶对乳蛋白质的水解获得的，还没有通过基因工程技术来表达抗高血压小肽的研究报道。 研究目的： 本课题的研究目的是研究乳源抗高血压生物活性肽CEI_(12)在大肠杆菌中的表达情况，探讨采用基因工程技术大量生产乳源抗高血压生物活性肽CEI_(12)的可能性。 方案设计： 本研究根据文献已经公开发表的、在体内外实验中证明具有降血压作用和ACE酶抑制活性的、来源于牛乳酪蛋白的一段被称为CEI_(12)的多肽氨基酸序列(Phe-Phe-Val-Ala-Pro-Phe-Pro-Glu-Val-Phe-Gly-Lys)及遗传密码，人工合成了一段双链DNA分子(5’CGCGGATCCCGCTTCTTTGTGGCGCCGTTCCCGGAAGTTTTCGGCAAAGGATCCAGA 3’)，经酶切后与融合表达载体pQE16连接，转化到大肠杆菌E．Coli JM109、E．ColiBL21和E．Coli DH5α中。从转化的平板中筛选出阳性重组子，进行不同IPTG浓度和不同诱导时间的表达研究，并利用SDS-PAGE电泳和Western blotting蛋白质印迹技术对外源基因CEI_(12)在大肠杆菌E．Coli．JM109、E．Coli．BL21和E．Coli．DH5α中的表达情况进行检测分析。最后对重组菌的生长条件、生长曲线、发酵条件和表达产物的体外生物学活性进行了研究。 东北农业大学工学博士学位论文一研究结果： 外源基因CEllZ在大肠杆菌E．C。h．JM109和E．C。h．BLZI中获得了一定量的表达，而在大肠杆菌 E．COlt．DHS Q中没有表达。在大肠杆菌 E．C。h．JM109中的表达量约为 500Pgh培养液，在大肠杆菌ECOliBLZI中的表达量约为1二t培养液。 经用不同的IPTG浓度对重组大肠杆菌E．C。h．JM109和E．C。h．BLZI进行诱导表达发现，不同的IPTG浓度诱导对外源基因CEllZ的表达量影响不大，不同的诱导时间对外源基因CEll。的表达水平也无明显影响。经对重组大肠杆菌E．C。h．BLZI进行长时间的诱导表达发现，当诱导时间为 12小时时，外源基因 CEI；。的表达量最大，但与第 6小时的表达量差异不大。 不同的碳源对重组菌PQE16＋JM109的生长影响较大，但所试验的各种碳源，其增菌作用都比不上酵母粉对重组菌 PQE16＋JM109的增殖效果好；有机氮源对重组菌pQE16＋JM109的生长促进作用明显比无机氮源好，在有机氮源中，大豆蛋白陈对重组菌nQE16＋JM109的增值效果最好，可代替胰蛋白陈使用；除 pnoz外，不同的培养基洲对重组菌 pQE16＋JM109 的生长的影响不大。综合以上叁方面的结果，重组菌PQE16＋JM109的最佳的培养条件是 LB培养基，pH72。 重组菌（＋QE16＋JM109和 pQE16＋BLZI）的生长曲线表明，重组菌在开始的几个小时内生长速度明显低于对应的空白菌ECOli．JM109和E．C。h．BLZI，但后期的生长速度明显高于空白菌，总的说来，重组菌的生物量更大些。 不同的碳源对重组菌PQE16＋JM109生长曲线的几个阶段和发展趋势没有明显的影响，但对其生物量有较大的影响，除酵母粉外，山梨醇也是一种可行的碳源；除硫酸按外，不同的氮源对重组菌pQE16＋JM109生长曲线的几个阶段和发展趋势及生物量没有明显的影响，大豆蛋白陈是重组菌PQE16＋JM109的良好氮源，是比较理想的胰蛋白豚的代替品：不同出的培养基对重组菌的m60M109生长曲线的几个阶段、发展趋势基本没有影响，生物量相差也不大，说明培养基的 pH对重组菌 pQE16＋JM109的生长影响不大。通过调整LB培养基中酵母粉和胰蛋白陈的浓度，发现酵母粉浓度为15％，胰蛋白陈浓度为1％时重组菌PQE16＋JM109的生长情况比较好。 两重组菌（pQE16＋JM109和pQE16＋BLZI）的生长曲线的对比说明，其生长曲线及发展趋势基
叶巍, 吕桂善, 付小燕, 霍贵成[2]2006年在《乳源抗高血压活性肽CEI_(12)在大肠杆菌中的表达》文中研究说明目的在大肠杆菌中表达乳源抗高血压活性肽CEI12。方法将人工合成血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)的DNA序列CEI12连接到表达载体pQE16上,转化到JM109中,筛选出重组子,在E.coliBL21中表达,用Westernblot检测表达结果,并且比较了不同温度的表达水平。结果乳源抗血压活性肽CEI12在E.coliBL21中的表达量约为1·2mg/L培养液,在25℃诱导的表达量高于37℃的表达量。结论已成功在大肠杆菌BL21中表达了乳源抗高血压活性肽CEI12。
李名远, 韩建春, 李杰[3]2010年在《乳源抗高血压七肽串联基因的合成及表达》文中研究指明分析了抗高血压肽结构和功能之间的关系,人工合成具有较高活性的抗高血压肽基因序列,并进一步串联为11拷贝抗高血压肽,克隆至表达载体pET-32b(+)上并转化宿主菌BL21。重组菌经诱导培养、细胞破碎,表达蛋白经胰蛋白酶酶解,测定酶解产物抑制ACE酶活性。表达蛋白的胰蛋白酶酶解产物抑制ACE酶活性达到77.23%。成功合成了串联的11拷贝抗高血压七肽基因,并实现了其在大肠杆菌中的高效表达,表达蛋白的胰蛋白酶酶解产物具有抗高血压肽活性。
参考文献：
[1]. 乳源抗高血压生物活性肽在大肠杆菌中表达的研究[D]. 吕桂善. 东北农业大学. 2003
[2]. 乳源抗高血压活性肽CEI_(12)在大肠杆菌中的表达[J]. 叶巍, 吕桂善, 付小燕, 霍贵成. 中国生物制品学杂志. 2006
[3]. 乳源抗高血压七肽串联基因的合成及表达[J]. 李名远, 韩建春, 李杰. 中国乳品工业. 2010