1.大庆市疾病预防控制中心微生物科 黑龙江大庆 163001；
2.大庆市疾病预防控制中心信息科 黑龙江大庆 163001
摘要：目的 分析实时荧光PCR技术在沙门菌与志贺菌筛查中的临床应用价值。方法 收集2016年10月～2017年10月于医院门诊就诊患者的520例肛拭子为研究对象，分别采用实时荧光PCR法和传统培养法进行对比检测，分析实时荧光PCR技术的灵敏度、特异度并比较两种方法的检测时间。结果 实时PCR法检测沙门菌、志贺菌的时间均显著少于传统培养法[（2.24±0.53 vs 4.52±0.71）d、（2.31±0.44 vs 4.61±0.65）d]；实时PCR法检测沙门菌、志贺菌的灵敏度均为100%，特异度分别为98.63%和97.24%。结论 实时荧光PCR技术检测沙门菌、志贺菌的时间短，灵敏度、特异度高。
关键词：实时荧光PCR技术；沙门菌；志贺菌
Application of real-time fluorescence PCR in screening of Salmonella and Shigella
Liu Yong qiang1，Xu Hai yan2
（1.Department of Microbiology，Disease Control and Prevention center of Daqing City，Heilongjiang Daqing，163001；
2. Department of Information，Disease Control and Prevention center of Daqing City，Heilongjiang Daqing，163001）
Abstract Objective To analyze value of real-time fluorescence PCR in screening of Salmonella and Shigella. Methods 520 anal swabs in patients in our outpatients of hospital from October 2016 to October 2017 were selected as research object，every specimen screened by real-time PCR method and traditional culture method. The sensitivity and specificity of real-time PCR method were analyzed and measuring time of two methods was compared. Results The time of real time PCR method for detection of Salmonella and Shigella was significantly less than traditional culture method [（2.24±0.53 vs 4.52±0.71）d、（2.31±0.44 vs 4.61±0.65）d]（P＜0.05）. The sensitivity of the detection of Salmonella and Shigella by real time PCR method was 100% and the specificity was 98.63% and 97.24%. Conclusion The time of detection of Salmonella and Shigella by fluorescence PCR technique is short，and the sensitivity and specificity of fluorescence PCR technique are high.
Key words：real time PCR method；Salmonella；Shigella
沙门菌、志贺菌是引起肠道感染和细菌性食物中毒的主要致病微生物[1]。临床上的常规检测方法为传统培养法，由于检测时间长、接种工作量大，不能及时、有效筛查大批量的健康人群，且处置突发公共卫生的时间有限[2]。因此，寻找一种能快速、准确筛查出沙门菌、志贺菌的方法对防治传染病有重要意义。实时荧光PCR技术作为分子水平上的诊断方法，能直接检测出病原体的存在情况，客观反映其在人体内的感染及活动情况，具有较高的灵敏度、特异性[3]。本研究通过与传统培养法检测效果进行对比，探析实时荧光PCR技术在筛查沙门菌、志贺菌中的应用价值。
1 研究对象与方法
1.1 对象
收集2016年10月～2017年10月于医院门诊就诊520例患者的肛拭子为研究对象，每份肛拭子均分别用传统培养法和实时荧光PCR技术进行检测。
1.2 仪器与试剂
qTOWER3G touch荧光定量 PCR仪（德国），11230BBC86 生物安全柜（济南鑫贝西），Thermo全自动细菌鉴定仪（英国），TGL21M台式离心机（长沙湘智），恒温培养箱（上海姚氏），木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养皿（上海博华，批号：20150617），克氏双糖铁琼脂培养皿（青岛海博，批号：20160226），动力-吲哚-尿素酶生化管（上海江莱，批号：20150804），沙门菌显色平板（南京森贝，批号：20160417），兰阴性细菌鉴定卡（上海拓赫，批号：241339140），沙门菌多价诊断血清（山东青岛，批号：20160422），志贺菌多价诊断血清（山东青岛，批号：20160805），沙门菌及志贺菌核酸联合检测试剂盒（山东青岛，批号：P20150701）。标准菌株：由中国医学细菌保藏管理中心提供CMCC 50115 鼠伤寒沙门菌、CMCC51572 福氏志贺菌。
1.3 方法
1.3.1 采样 均取截石位，将肛拭子插入肛门齿状线内3cm处，顺时针旋转3周后，取出肛拭子放入SS 增菌液并混匀，后放置在恒温培养箱增菌，温度为35 ℃，时间约18 h～24 h。
1.3.2 传统培养法 采用3区划线法，将增菌后的菌种接种到木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养皿上，放入35 ℃恒温培养箱中增菌18 h～24 h。取出培养皿，挑出初步怀疑为沙门菌和志贺菌的菌落，并将其接种到克氏双糖铁管、动力-吲哚-尿素酶生化管进行初步鉴定及培养，排出部分非沙门菌、志贺菌后，将剩余纯化培养后的菌落进行G+染色、显色培养皿培养、菌种鉴定和血清学分型。
1.3.3 实时荧光PCR法 各取2滴SS 增菌液增菌后的菌液于1.5ml离心管中，并以13000 r/min转速离心2min，去掉上清后将沉淀洗涤一次，加入50uL核酸抽提液充分摇匀，放置于99 ℃煮沸5min，再以13000r/min转速离心10min，取4uL上清液做PCR反应。采用qTOWER3G touch荧光定量 PCR仪进行扩增，时间、温度依次设置为37℃，2 min→94℃，2 min→93℃，15 s→60℃，60 s，循环40次后进行鉴定。
1.4 评价标准
阳性标本检测后Ct<38，重复测定Ct仍为38~40，则为阴性。检测混合标本为阳性，则进行扩增，将扩增得到的阳性标本同培养法进行对比，若是同一标本则停止培养，如培养法阴性、荧光PCR法阳性对原始标本进行再次培养。检测时间：从标本接收开始，到发出报告为止。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0进行数据分析，计量资料以（）表示，行t检验；计数资料以[n（%）]表示，行χ2检验，P<0.05表示有统计学意义。
2 结果
2.1 两种方法检测时间比较
实时PCR法检测沙门菌的时间（2.24±0.53）d和志贺菌的时间（2.31±0.44）d均显著低于传统培养法（4.52±0.71）d，（4.61±0.65）d。
2.2 实时PCR法检测沙门菌、志贺菌的结果分析
实时PCR法检测沙门菌的灵敏度为100%，特异度为98.63%，检测志贺菌的灵敏度为100%，特异度为97.24%，见表1、2。
表1 实时PCR法检测沙门菌的结果分析
注：灵敏度=[12/（12+0）]×100%=100%；特异度=[494/（14+494）]×100%=97.24%
3 讨论
沙门菌、志贺菌是引起食物中毒的主要致病因素，其分布广泛、血清型多变。据统计，沙门菌约有2000个血清型，其中D群的肠炎沙门菌在引起食物中毒因素中的占比较大；而志贺菌的流行菌群变异较快，约20～30年发生一次菌群的更换[4-5]。目前，传统培养法仍是主要的筛查方式，但其对操作人员、操作环境要求较高，受主观影响较大。而实时荧光PCR法将增菌液在PCR仪上进行自动扩增，避免了后期的细菌分离和生化鉴定等工作，在一定程度上减少了筛查时间及后期杂菌污染的可能性[6]。
本研究结果显示，实时PCR法筛查沙门菌、志贺菌的平均时间显著低于传统培养法，提示实时PCR法在完成标本的快速筛查方面具有一定的优势。此外，实时PCR法检测沙门菌、志贺菌的灵敏度均为100%，特异度分别为98.63%和97.24%，提示实时PCR法在筛查沙门菌、志贺菌方面具有较高的准确性、特异性，与既往报道一致[7]。王琳等[8]发现，大批量人群筛查结果中，实时PCR法的总花费低于传统培养法，提示实时PCR法在大批量检测时可有效降低成本。
综上，实时PCR法筛查沙门菌、志贺菌的时间短、准确率高、特异性强，尤其适用在处理突发卫生公共事件中对大批量标本的筛查。
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论文作者:刘永强1,徐海燕2
论文发表刊物:《中国误诊学杂志》2018年第14期
论文发表时间:2018/8/16
标签：沙门论文; 实时论文; 荧光论文; 批号论文; 筛查论文; 灵敏度论文; 标本论文; 《中国误诊学杂志》2018年第14期论文;