郑毅[1]2016年在《“接骨丹”对兔骨折愈合过程的促进作用效应实验研究》文中研究表明目的骨折是临床上多发疾病和常见疾病,主要包括骨小梁中断和皮质骨断裂,骨折不愈合或延迟愈合是骨折治疗中比较棘手的问题,骨折愈合过程是一个极其复杂的组织学、生物学、内分泌学、生物力学修复过程。骨折愈合影响因素众多,包括全身因素和局部因素、医源性因素、骨生长因子、微量元素、生物力学因素。据不完全统计,大概有5%-10%的骨折患者会因为各种原因发生不愈合、延迟愈合等不良后果。因此如何促进骨折愈合、缩短骨折愈合周期、恢复骨的正常功能和结构一直是医学界研究的焦点和热点。虽然说加快骨折愈合的方法有很多,但是有一些治疗办法的效果并不显著,祖国医学治疗骨折折历史悠久,历经了几千年的临床实践检验,其简单方便、安全有效、毒副作用低、成本低廉等特点一直被医生和患者所认可。本课题在祖国医学理论指导下,开展“接骨丹”对骨折愈合过程的促进作用效应研究,希望能对中医药促进骨折愈合提供进一步的试验依据。方法新西兰大白兔20只,年龄10-12个月,体重2.5±0.25Kg,身长约25-30cm,四肢无畸形,活动自如,生命体征平稳,饮食正常,无传染病,动物喂养于标准动物房,适应性喂养1周开始实验。用显微外科骨刀在股骨颈中部凿断,形成股骨颈骨折,克氏针固定,术后8天拆线,以生命体征稳定、正常进食、无感染、内固定无明显移位、脱落为造模成功。随机分为2组,每组10只,A组为对照组,只做复位固定;B组为实验组,在复位固定基础上采用中药方剂“接骨丹”治疗。术后4、8、12w拍摄双髋关节正位X线片和进行核素骨显像检查,双髋关节正位取X线片,以99mTc-亚甲基二磷酸(99mTc-MDP)为示踪剂,SPECT及配套系统骨同位素显像;双侧股骨头的血液灌注的情况以头干比的比值(股骨头和同侧股骨干的99mTc-MDP浓集值相比)比较;血液流变学检测全血黏度、血浆黏度、血沉、红细胞压积;全自动生化分析仪检测血钙和血磷、血清碱性磷酸酶;ELISA实验检测骨形态发生蛋白、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子;生物力学试验检测骨痂最大载荷、挠度和刚度,Westemblot法检测骨骼中胶原蛋白含量,运用图象分析系统进行检测,并对数据进行统计分析。结果1.X线结果观察:术后4周股骨颈骨折线模糊不清楚,实验组骨痂逐步形成,对照组有骨膜反应,骨痂阴影密度实验组比对照组高;术后8周骨实验组骨折线基本消失,有外骨痂桥接骨折断端,面积逐渐缩小,髓腔未完全再通,对照组可见骨痂形成,髓腔未通,骨痂生长面积和骨痂阴影密度比较,实验组优于对照组;术后12周骨折基本愈合,实验组骨痂生长速度比较快,骨折线完全消失,髓腔完全再通;对照组可见到比较模糊的骨折线,有明显骨痂形成,面积缩小,髓腔未通。实验组骨折愈合质量评分第4周、8周、12周均明显优于对照组,有显著统计学意义(P<0.01),结果认定实验组较对照组骨折愈合较快。2.骨折部位灰度值比较:实验组与对照组比较,骨折部位灰度值4W、8W、12周实验组高于对照组,差异有显著性统计学意义(P<0.01)。3.骨同位素显像结果:实验组与对照组比较,股骨头处核素浓集明显,头干比值比较大,4W、8W差异有统计学意义(P<0.05),12W差异无统计学意义(P>0.05),4W、8W、12W头干比值随时间推移出现下降势。4.血液流变学测定结果:实验组与对照组比较,全血黏度、血浆黏度、血沉、红细胞压积降低明显,差异有统计学意义(P<0.05)。5.接骨丹对生化指标影响:血清钙离子浓度4W、8W、12周实验组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);血清磷离子浓度实验组与对照组血清磷离子浓度随时间推移逐渐上升,8周趋于稳定,4W、8W、12周实验组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);血清钙磷乘积比较4W、8W、12周钙磷乘积实验组高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01);血清碱性磷酸酶活性4W、8W、12周血清碱性磷酸酶活性高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。6.接骨丹对骨生长因子影响:4W、8W、12W实验组BMP2高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01);4W、8W实验组IGF高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01),12W两组无显著性差异(P>0.05);4W、8W实验组TGF-β1高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01),12W两组无显著性差异(P>0.05);4W、8W实验组PDGF高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01),12W两组无显著性差异(P>0.05);4W、8W实验组b FGF高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01),12W两组无显著性差异(P>0.05)。7.接骨丹对生物力学影响:最大载荷、挠度、刚度12W实验组高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01)。8.接骨丹对Ⅰ型胶原蛋白的影响:Ⅰ型胶原蛋白4W时实验组高于对照组,差异有显著统计学意义(P<0.01),8W实验组与对照组Ⅰ型胶原蛋白表达较少,两组差异无统计学意义(P>0.05),12W两组无表达。结论1.接骨丹能明显改善骨折端微循环,增加局部血供,可以降低血液粘稠度,使局部血液循环尽早恢复,同时通过改善血液流变学的性质,使血液浓粘、凝集的程度减轻,加快血肿内瘀血的吸收,改善血液流变状态,增加局部肢体血流量,以促进骨折愈合。2.接骨丹能够升高血钙和血磷,使钙磷乘积高峰显著升高,促进钙盐沉积,提高骨折愈合中血清碱性磷酸酶的活性,增强体内成骨活动,促进骨折愈合。3.接骨丹可以调节外周血中骨生长因子的合成、分泌,促进骨形态发生蛋白、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子的表达,通过影响骨生长因子促进骨折愈合。4.接骨丹能够提升骨痂最大载荷、挠度和刚度,促进骨生物力学性能的恢复,生物力学性能的增强可能与骨骼中胶原蛋白含量的增加有关。
曲露露[2]2016年在《骨生长因子在纯钛种植体周围促进骨修复的作用》文中研究表明研究目的:本实验目的是研究骨生长因子中的血小板衍生性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)对种植体周围骨组织修复的作用及其相互作用对促骨修复的影响。研究方法:1用Masson染色方法研究PDGF-BB和IGF-Ⅰ促进种植体周围骨修复的作用:采用兔子24只,按种植体周围局部注射药物的不同随机分成4组,0.9%Na Cl对照组、PDGF-BB组、IGF-Ⅰ组、PDGF-BB+IGF-Ⅰ组。分别在3、7、10天处死动物,取出植入体及其周围软组织,然后进行Masson染色观察种植体周围纤维化修复情况。2用HE染色方法研究PDGF-BB和BMP-2促进种植体周围骨修复的作用:采用兔子24只,按种植体周围局部注射药物的不同随机分成4组,0.9%Na Cl对照组、PDGF-BB组、BMP-2组、PDGF-BB+BMP-2组。分别在3、7、10天处死动物,取出植入体及其周围软组织,然后进行HE染色观察种植体周围组织形态学变化。研究结果:1大体观察结果显示:家兔术后3天,活动较少,饮食明显减少,喜欢静卧,手术区域肿胀,未见出血,术肢无法伸展。第4天之后,各组家兔活动饮食慢慢恢复,行走自如,术区肿胀慢慢消退,未见明显的炎症坏死。3天,7天,10天组家兔术区,种植体无一例脱落,种植体与周围组织连接紧密,术区肿胀随着时间逐渐消退。2用Masson染色研究PDGF-BB和IGF-Ⅰ促进种植体周围骨修复的作用结果显示:PDGF-BB组出现较多的胶原纤维,肉芽组织中可见增生的成纤维细胞。IGF-Ⅰ组肌肉组织间可见大片的肉芽组织纤维修复。PDGF-BB+IGF-Ⅰ组胶原纤维增生明显,纤维修复出现较早,肉芽组织中明显的成纤维细胞,种植体周围肌肉组织间纤维修复明显,愈合效果相比Na Cl组和单因子组要好。3用HE染色研究PDGF-BB和BMP-2促进种植体周围骨修复的作用结果显示:PDGF-BB组可见较轻的炎症反应,钙盐沉积面积由大变小;BMP-2组可见较重的炎症反应,钙盐沉积较轻。PDGF-BB+BMP-2组炎症反应最轻且随时间逐渐变更弱,类骨质形成,钙盐稳定沉积。Na Cl对照组显示组织坏死,炎症反应严重。结论:1 PDGF-BB和IGF-Ⅰ对种植体周围骨修复都有促进作用,单独应用没有联合应用效果好。2 PDGF-BB和BMP-2均可加速种植体周围骨修复的进程,但BMP-2的意义较小,单独应用没有联合应用效果好。
崔猛[3]2000年在《血小板衍生生长因子在骨修复早期中的作用及相关作用机制的实验研究》文中进行了进一步梳理目的：将重组人血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factorAB，PDGF-AB）注入大鼠桡骨骨缺损模型，同体双侧对照，运用X线照片，组织学切片HE染色，免疫组织化学染色，分子原位杂交方法，从组织形态和细胞分子水平综合观察和分析PDGF对骨折愈合期间软骨骨痂发生、生长的刺激作用及其刺激信号的传导机制，试图为探讨PDGF在骨愈合中的作用及作用机制提供新的理论依据。方法：WAISTER大鼠30只，造成双侧上肢平均约3mm的桡骨骨缺损模型。将重组因子PDGF-AB分别于术后第1、3、5、7天分四次注入大鼠右侧桡骨骨缺损区内，左侧骨缺损区内注入0.9％生理盐水作为对照。分别于术后第1周、2周、4周摄双侧尺挠骨X线正位片，摄片后用骨密度仪测定和比较两组骨缺损区新生骨痂组织的骨矿物质密度，然后取骨痂组织，做成5份切片，分别进行HE染色、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）免疫组化、C-FOS免疫组化、C-JUN免疫组化和C-FOS原位杂交观察并对阳性结果作定量分析。结果：X线片和组织学观察显示：PDGF组样本骨缺损区内的新生软骨骨痂在生长的时间和数量上均优于生理盐水组，两组骨密度值结果比较：PDGF组样本中新生骨痂的骨密度值高于生理盐水组（P值小于0.05-0.01）。免疫组织化学观察见PCNA蛋白、C-FOS蛋白、C-JUN蛋白在软骨骨痂形成与转归中的表达规律有比较一致的相似性，且PDGF能刺激间充质细胞、软骨细胞合成这三种蛋白。术后1周，三种蛋白在PDGF组中间充质细胞内的表达均高于它们在生理盐水组中间充质细胞内的表达o值均小于0刀1人术后2周，三种蛋白在PDGF组中非肥大软骨细胞内的表达均高于它们在生理盐水组中非肥大软骨细胞内的表达o值小于0刀5－0刀1）。原位杂交观察见C－FOS基因在PDGF组中非肥大软骨细胞内的表达强于其在同期生理盐水组中非肥大软骨细胞内的表达。结论：PD＊F能刺激动物体内间充质细胞和软骨细胞的增殖，加速软骨骨俪的形成，促进骨愈合。PDGF能诱导这两种细胞表达C－FOS与C－JUN，它或许能通过C－FOS／C－JUN蛋白来传递其生长作用信号，从而实现其刺激间充质细胞和软骨细胞增殖的目的。
马维[4]2003年在《富含血小板血浆对兔尺骨骨折愈合的实验研究》文中研究指明骨折是临床的常见病和多发病，对骨折愈合机理的研究一直是骨科界的热门课题，人们试图采用各种办法揭示其中的奥秘，探索其内在的关系，进而应用于临床，降低骨折的不愈合率，减少患者的痛苦。在骨折愈合的研究中，从宏观到微观，从分子生物学到生物力学，从生长因子到组织工程学，涉及的领域众多。骨的形成与生长是一个又分子、细胞以及生化代谢变化所组成的复杂过程。骨可沿两种途径发生，即膜化骨和软骨化骨。虽然光学显微镜水平上已经能够观察到这两种途径间的差别，但是骨的最终形成则是上述两种途径共同出现在同一组织上。当成骨细胞在胶原的支架内形成已钙化的类骨质基质时为膜内化骨，它发生在骨的骨膜表面，次过程始于原始间充质细胞的细胞分化。当成骨细胞在软骨支架表面形成类骨质时为软骨内化骨，它发生生长板和骨折处，在胚胎初期和胎儿发育期间，生长板发生在间充质细胞的软骨团块中。随着对骨分化过程的揭示，及分子生物学的研究方法的引入，将有助于深入了解和探讨骨折修复的机制。骨的修复与生长受多种生长因子的调控，有多种细胞因子可以促进骨的修复。富含血小板的血浆对骨折愈合的影响，已成为近来研究的热点。由于血小板中含有大量的各种生长因子，它们在骨折愈合过程中起着或多或少的作用，它们既可以相互协同又可以相互促进。在这些因子中，最重要的是血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor PDGF）、胰岛素样生长因子（insulin -like growth factor IGF）、骨形成蛋白（bone morphogenitic protein BMP）等,其中PDGF是局部最早出现的生长因子，它促进未分化的细胞的分裂和增殖。至今为止，有关富含血小板血浆对骨折愈合的影响已有报道，但是在四肢骨骨折修复过程的报道知之甚少。而且通过PDGF、IGF、BMP研究富含血小板血浆对骨折的的修复作用还未见报道。因此我们采用原位杂交、<WP=5>免疫组化及生物力学方法，阐明富含血小板的血浆对骨折愈合的影响。第一部分：富含血小板的血浆中的PDGF在骨折愈合中的表达目的：通过研究PDGF在骨折愈合过程中的表达，探讨富含血小板的血浆对骨折修复的影响，为富含血小板的血浆在临床中的应用提供理论上的依据。方法：建立兔尺骨的动物模型，将成年新西兰兔24只，雌雄不限，体重在2.5~3.0kg，随机分成空白组、血清组、富含血小板血浆组及植骨+富含血小板血浆组。取兔的自体血6毫升，通过低速及高速离心，取浓缩的血小板血浆0.5毫升。模型组用4%戊巴比妥钠0.5 ml/kg，腹腔注射麻醉。沿肌间隙游离尺骨切开骨间膜及骨膜，截断尺骨后用4孔钢板及螺钉行内固定，将高速离心制成的血小板浓缩液，在无菌条件下用明胶海绵吸附血小板浓缩液，将其放置于骨折旁，使其缓慢释放，植骨动物模型，可在手术时将血小板浓缩液直接注入在植骨上，植骨均采用兔右侧自体髂骨。分别在第2、4、8周时处死兔，对其骨折端进行各种检测。应用原位杂交、免疫组化，对实验标本进行分析，了解PDGF在骨折修复过程中的表达。结果：①肉眼观察发现，在空白组和血清组的动物模型中，以纤维连接为主，在骨折周围有大量的肉芽组织，骨痂成分很少。而在富含血小板血浆及植骨+血小板组则以骨性连接为主，周围有少许的肉芽组织。②采用原位杂交研究发现PDGF在富含血小板血浆组的表达最为强，其次是植骨+血小板组，而在空白组和血清组中，PDGF的表达较少。③在免疫组化的染色中，富含血小板血浆中的PDGF表达明显高于其他组，空白的着色最少。结论：富含血小板的血浆中，含有大量的各种因子，它们对骨折的修复起着不同的作用，由于血小板中含有大量的PDGF，它在骨折修复中通过促进成骨细胞的分裂、增殖而发挥了重要作用，PDGF在富含血小板血浆组和植骨+血小板组的表达明显高于其他组，因而富含血小板血浆在临床中有广阔的应用前景。第二部分：兔尺骨骨折愈合过程中富含血小板血浆中的IGF-1基因表 达目的：研究富含血小板血浆中的IGF-1在骨折愈合中的表达，探讨富含血小板的血浆对骨折愈合的影响为其在临床中的应用做好理论基础。方法：建立同样的兔尺骨骨折的动物模型，随机分为空白组、血清组、<WP=6>血小板组和植骨+血小板组，采用同第一部分的方法，提取富含血小板血浆，留置于兔的尺骨骨折处，分别在2、4、8周处死兔，方 法是应用原位杂交、免疫组化及图象分析系统探讨对骨折愈合的影响。结果：①大体肉眼观察，在空白组和血清组的骨折周围仅有的骨骼组织，而大量包绕的是纤维结缔组织和肉芽组织。在富含血小板血浆及植骨+血小板组的骨折周围以骨性组织为主，同时也拌有少许的结缔组织。②在免疫组化和原位杂交的实验中，发现IGF在富含血小板血浆及植骨+血小板组的表达明显增多，染色颗粒多于空白组。结论：由于富含血小板的血浆中含有IGF-1，而IGF对成骨细胞的分裂增殖有明显的刺激作用，在骨折的愈合过程中发挥着重要的作用。在含有IGF-1较多的富含血小板血浆组，其骨折的愈合和细胞着色颗粒明显高于对照组。第三部分：富含血小板的血浆中的BMP在骨折愈合中的表达目的：研究富含血小板的血浆中
钟达[5]2008年在《强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料的制备及在体内成骨的研究》文中研究指明创伤、骨肿瘤手术切除造成的骨缺损,使得现有的骨替代材料已经无法满足临床需求。骨组织工程当今研究的重点,是一种开发能够修复、维持和改善损伤骨组织功能可被机体吸收的生物替代物来解决大段骨缺损的方法。人们逐步认识到构建以支架材料为骨架,复合干细胞,辅以生长因子的细胞繁殖三角模式是组织工程较理想的选择。本课题根据骨组织工程的基本原理,设计将富血小板血浆与强化磷酸三钙复合后加入凝血酶形成复合材料,构建新型强化磷酸三钙-胶原-多种生长因子(PRP)复合支架,随后选择和培养犬骨髓间充质干细胞并将种子细胞与支架相复合,植入比格犬体内观察其成骨情况,为构建理想的初步组织工程骨工程化产品,为建立骨组织工程的大型动物模型及进一步满足治疗骨缺损的临床需要提供理论基础。第一章犬骨髓间充质干细胞的提取、分离、纯化与增殖目的研究探讨犬骨髓间充质干细胞的分离、培养方法,以及生长增殖特性,并将其作为骨组织工程种子细胞的实验基础。方法无菌技术抽取比格犬骨髓,密度梯度离心法获取细胞。加入含胎牛血清体积分数为0.1的低糖DMEM培养基中进行原代培养;待细胞生长至80～90%融合时,1∶3传代培养。倒置显微镜观察细胞形态。MTT法测定3、5、10代细胞生长曲线。流式细胞仪检测第5代细胞的表面抗原分子。结果原代培养后24小时看见微少贴壁细胞,初起为小圆形,48小时后可见短梭形、梭形和多角形贴壁细胞,有初起克隆集落形成,并可见细胞分裂相;3天后可见梭形类成纤维细胞明显增多,5天左右进入对数生长期,8～10天单层细胞融合接近90%,呈漩涡样生长。1∶3传代的细胞2小时左右即可见细胞贴壁,一般10小时左右完成贴壁,生长增快,多数为类成纤维细胞,圆形细胞逐渐减少,6～7天细胞即可单层融合,传3代以后细胞形态均一,呈长梭形,接近融合状态时可呈漩涡样生长。10代以后细胞则逐渐有宽大梭形样变,增殖逐渐减缓,偶有细胞飘零。流式细胞仪检测传5代细胞有96%表达CD44,95%表达CD29,而只有5%表达CD34。生长曲线显示传3、5代骨髓间充质干细胞均有较强的增殖能力,其中传3代细胞更为明显,而传10代细胞的增殖能力较前有所减弱。结论犬骨髓间充质干分离提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,能够长期培养,符合组织工程种子细胞的基本条件。第二章富血小板血浆凝胶对犬骨髓间充质干细胞增殖及体外诱导分化的影响目的探讨比格犬骨髓间充质干细胞在特定培养基条件下的定向成骨分化能力。观察并分析富血小板血浆凝胶对比格犬骨髓间充质干细胞的增殖效应,分析最佳的浓度配比,以及富血小板血浆凝胶在比格犬骨髓间充质干细胞定向成骨分化中的作用。方法(1)如前述方法,分离培养比格犬骨髓间充质干细胞。(2)抽取27只比格犬后肢静脉血,两步离心法制备富血小板血浆,人工计数血小板后将富血小板血浆按1∶1的比例与含100u/ml牛凝血酶的10%氯化钙溶液激活剂混合反应形成凝胶。(3)MTT法测定不同浓度的富血小板血浆凝胶对传3代的比格犬骨髓间充质干细胞的增殖效应并选出最佳效应组。(4)将第3代比格犬骨髓间充质干细胞分为四组,分别加入含胎牛血清体积分数为0.1的低糖DMEM为Ⅰ组;含胎牛血清体积分数为0.1、地塞米松10~(-7)mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸50mg/L的高糖DMEM为Ⅱ组;含富血小板血浆凝胶最佳体积分数的低糖DMEM为Ⅲ组;含富血小板血浆凝胶最佳体积分数、地塞米松10~(-7)mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸50mg/L的高糖DMEM为Ⅳ组。倒置显微镜、HE染色观察各组细胞形态变化。碱性磷酸酶检测试剂盒检测各组细胞内碱性磷酸酶含量。茜素红S标记钙结节形成情况。免疫细胞化学染色检测各组骨钙素的表达。RT-PCR检测各组骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果(1)人工血小板计数结果为静脉血中血小板为143.5士33.1×10~9/L,富血小板血浆为1239±174.07×10~9/L,为全血的8.6倍。(2)MTT法显示加入各种浓度富血小板血浆凝胶均可在早期促进比格犬骨髓间充质干细胞的增值。随着时间延长,各组表现不一。高浓度组增殖效果逐渐降低,而低浓度组表现优秀,而以6.25%组表现最佳。(3)倒置显微镜及HE染色观察Ⅱ、Ⅳ组细胞由梭型渐变为三角形、多角形、圆形,有自发聚集倾向,与Ⅰ、Ⅲ组有明显区别。Ⅲ组细胞增殖较Ⅰ组更快。各组碱性磷酸酶含量均随时间的延长而逐渐增高,各组比较而言,Ⅳ组活性最高,而Ⅰ、Ⅱ之间无显著性差异,成骨诱导14天,Ⅱ、Ⅳ组可见钙结节产生,茜素红S染色呈红色。成骨诱导14天后,骨钙素蛋白免疫细胞化学染色显示Ⅱ、Ⅳ组呈阳性。诱导后7,14天后RT-PCR鉴定各组骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA的表达,各组均分别在185bp、292bp及145bp有单一的目的条带,诱导后7,14天时间点Ⅱ、Ⅳ组组骨钙素、碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原mRNA的表达水平均强于Ⅰ、Ⅲ组;Ⅰ与Ⅲ组之间无显著性差异,而Ⅳ组各表达水平均强于Ⅱ组。结论富血小板血浆可显著促进骨髓间充质干细胞增殖,其增殖强度与富血小板血浆浓度相关,过高浓度可抑制骨髓间充质干细胞增殖。犬骨髓间充质干细胞在体外成骨诱导培养下可定向成骨分化,并能够稳定表达成骨细胞特异性表型,具有成骨能力。富血小板血浆能显著增强诱导剂诱导成骨效果,但单独使用不能使骨髓间充质干细胞定向成骨分化。第三章强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料的制备及组织相容性研究并构建体外组织工程骨目的研究强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架的制备方法,分析该支架的生物相容性及生物力学性能。探讨强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架作为骨髓间充质干细胞载体的可能性。方法(1)如前述方法制备富血小板血浆备用。(2)将强化磷酸三钙柱状支架用毛笔刷掉表面粉末,生理盐水反复冲洗,烘干后高温消毒备用。(3)万用材料测试机测定其力学性能。(4)将准备好的强化磷酸三钙材料浸泡于富血小板血浆中,然后按1∶1的比例与含100u/ml牛凝血酶的10%氯化钙溶液激活剂混合反应形成强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架。将材料取出,去除表面多余的凝胶后备用。(5)如前述方法分离培养比格犬骨髓间充质干细胞,取传3代细胞接种于备好的单纯强化磷酸三钙和强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架上。(6)于接种后4、8、12、24h取样测定第三代骨髓间充质干细胞在强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架上黏附率。(7)分别于2、4、8天取样采用MTT法测细胞增殖率,并计算材料细胞毒性(8)2周后取材行扫描电镜观察细胞在材料表面的生长增殖以及基质分泌情况。结果(1)强化磷酸三钙为多孔结构,表面粗糙,呈白色,无异味,质地较韧。复合富血小板血浆凝胶后,可见空隙内充满凝胶。(2)垂直压缩力学实验显示强化磷酸三钙的平均最大载荷为942.49N,平均极限强度为13.634MPa。(3)细胞4、8、12、24h黏附率分别为52±2%、81±1%、92±2%及98±1%。(4)2、4、8天测定细胞相对增殖率RGR均大于1.0,评级为0级。(5)诱导组2周后扫描电镜观察,见细胞在强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架表面分布较单纯强化磷酸三钙支架密集,并可见在强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架空隙细胞延伸,基质分泌旺盛,甚至连接成片;未诱导组基质分泌较少。结论强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料可作为骨组织工程中骨髓间充质干细胞的细胞载体,无毒,生物相容性良好,兼具骨传导性和骨诱导性,基本满足骨组织工程的需要。第四章犬骨髓间充质干细胞复合强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料体内构建组织工程骨的实验研究目的探讨了骨髓间充质干细胞复合强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料体外定向成骨诱导后植入比格犬胫骨上段骨缺损中构建组织工程骨并修复体内骨缺损能力。方法(1)如第三章所述方法,比格犬骨髓间充质干细胞复合单纯强化磷酸三钙支架材料及强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架体外培养或诱导3周。(2)分别将细胞复合单纯强化磷酸三钙支架材料复合物、髂骨组及细胞复合强化磷酸三钙/富血小板血浆凝胶复合支架材料复合物随机植入左、右胫骨平台下方圆洞形缺损处。观察植入物的表面变化、骨痂形成、骨缺损修复情况及周围组织反应。(3)术后4、8、12周行X线片检查,观察X线片变化情况。(4)术后4、8、12周取材行HE染色及骨钙素蛋白免疫组织化学染色观察表达情况。(5)RT-PCR检测体内各组在4、8、12周时OCN、ALP、CollA1的mRNA的表达情况。(6)术后12周取各组胫骨上段,去除附属组织,于INSTRON8032万用测试仪上做垂直压缩实验比较各组力学性能。结果(1)各组材料复合体植入比格犬胫骨骨缺损后,伤口生长良好,没有全身和局部的炎症和毒性反应,伤口一期愈合。植入材料均未见明显炎症及排斥反应。(2)术后4、8、12周摄X线片结果显示髂骨组及强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合材料组12周时基本达到骨质愈合,而单纯强化磷酸三钙材料组仍未见材料吸收、骨性愈合情况,材料-骨质界面清晰,材料周缘出现负影。(3)术后4、8、12周取材行HE染色及骨钙素蛋白免疫组织化学染色可见各组均可观察到新生软骨成骨情况,强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合材料组表达较强化磷酸三钙材料组更强(4)各组在4、8、12周各组均可见OCN、ALP和CollA1的mRNA表达条带出现。比较4、8、12周各组目的条带和内参灰度值,8、12周时Ⅱ组和Ⅲ组各项表达强于Ⅰ组,Ⅱ组和Ⅲ组之间无明显区别。(5)比较各组力学性能显示强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合材料组与髂骨组相比无明显区别,但较单纯强化磷酸三钙强度更好。结论强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合支架材料是一种理想的骨组织工程支架材料,在组织相容性、降解速度、力学性能及成骨效果等方面均令人满意。犬骨髓间充质干细胞复合强化磷酸三钙/自体富血小板血浆凝胶复合支架材料经体外诱导后具有在比格犬体内构建组织工程骨的能力。
童九辉[6]2017年在《联合应用bFGF、PDGF对大鼠胫骨骨折愈合的影响》文中研究说明目的:研究局部联合应用外源性碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)对大鼠胫骨骨折愈合过程的影响作用,为临床早期治疗骨折延迟愈合或不愈合提供实验参考。方法:清洁级成熟雄性SD大鼠48只,随机分成4组:A组(b FGF)、B组(PDGF)、C组(b FGF+PDGF)、D组(空白对照组)。每组各12只。各组实验动物按无菌操作要求建立左胫骨中段骨折模型并应用1mm克氏针行髓内内固定治疗。A组、B组及C组大鼠均于术后第3天,在骨折断端周围经皮注射药物,1次/d,连续7天,各组给药方式如下:A组(100ng b FGF+0.3ml生理盐水);B组(100ng PDGF+0.3ml生理盐水);C组(100ng b FGF+100ng PDGF+0.3ml生理盐水)。D组则于骨折断端周围经皮注射等量生理盐水,给药时间及次数均同于其他组。各组分别于术后2周及4周随机抽选6只大鼠行股动脉取血并处死,X线照片观察骨折愈合情况,取骨折局部大体标本部分骨痂进行研磨、离心处理,留取上清液,并采用ELISA法测定骨痂标本中ALP的含量。另取部分骨痂脱钙后进行HE染色组织学观察,并测定骨痂中骨小梁成骨指数IOB及平均骨小梁宽度。采用蛋白质芯片技术测定2周及4周时大鼠血清中VEGF、BMP-2及IGF-1的含量。结果:1术后2周及4周,大体标本表明:A组、B组及C组在新生质硬组织大小、硬度方面及骨痂成熟程度、稳定性方面大于D组,C组则明显优于其他各组。2术后2周X线示:C组大鼠骨折处局部骨折线模糊,骨折间隙较其他组小,断端可见片状模糊高密度影;A组和B组大鼠骨折处局部骨折线可见,较D组稍模糊,其断端可见条索状低密度影。术后4周X线示:C组大鼠骨折线消失,可见梭行外生骨痂影,形成骨桥并桥接骨折两端;A组和B组大鼠骨折线基本消失,骨折断端变钝,可见高密度外骨痂形成并连接骨折两端;D组大鼠骨折线仍清楚可见,骨折断端间隙较2周时缩小。3组织学观察发现:术后2周时,C组切片有软骨骨痂和纤维骨痂形成,其中软骨痂较明显,软骨细胞增生活跃,新生骨小梁及血管较其他组明显;A组和B组也见纤维骨痂和软骨骨痂形成,其纤维骨痂相对明显;D组则以纤维骨痂为主。术后4周时,C组大鼠骨小梁基本成熟,可见较多成熟板层骨,髓腔内出现大量骨髓细胞;A组和B组大鼠可见明显的条索状软骨钙化,骨小梁增多,可见部分成熟板层骨形成,髓腔内可见部分骨髓细胞;D组纤维骨痂较2周时减少,软骨骨痂增多,成骨细胞增生活跃。骨痂分析:术后2周及4周时,C组骨痂内骨小梁成骨指数明显高于其他各组且有统计学意义(P<0.05),A组及B组高于对照组D组,但小于C组,差异显著存在且有统计学意义(P<0.05)。4 ELISA法测定骨痂中ALP的含量示:C组大鼠患肢骨痂内ALP的含量于术后2周及4周时在各组中均为最高,且比较差异具有统计学意义(P<0.05);术后2周时A组及B组高于D组并小于C组,且差异存在统计学意义(P<0.05)。术后4周时A组、B组及D组各组间无统计学差异(P>0.05)。5血清生化指标结果示:术后2周时,A、B、C三组大鼠血清中VEGF的含量均高于对照组D组,且差异具有统计学意义(P<0.05);C组最高,其次为B>A>D组。术后4周时:C组血清中VEGF的含量仍为四组中最高(P<0.05),余三组间无明显统计学差异(P>0.05)。术后2周时C组大鼠血清BMP-2的含量高于其他组(P<0.05),B组大鼠血清BMP-2的含量高于A组和D组(P<0.05)。术后4周时各组间无统计学差异。术后2周时,大鼠血清中IGF-1的含量为C组>B组>A组>D组,(P<0.05)。术后4周时A、B及D组小于C组(P<0.05),但A、B、D三组间无明显统计差异。结论:1局部单独注射外源性碱性成纤维细胞生长因子或血小板衍生生长因子可以促进大鼠胫骨骨折愈合,且联合注射优于单独注射。2局部联合注射外源性碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子可以增加血清中VEGF、BMP-2、IGF-1及骨痂中ALP的表达,这可能是其促进大鼠胫骨骨折愈合的一种途径。3外源性碱性成纤维细胞生长因子和血小板衍生生长因子对增强大鼠血清中VEGF、IGF-1的表达有协同作用。
邓墨渊[7]2012年在《力生长因子E肽在临界骨缺损修复中的作用及机制》文中认为肿瘤、创伤、感染等因素所造成的大面积骨缺损修复一直是困扰骨科医生的难题。目前，骨缺损的治疗主要还是依赖传统的骨移植术，但传统方式一般会经历多次手术、存在诸多副作用及因手术失败引起的截肢或丧失骨负重等可能性，因此迫切需要新的替代方法以满足临床治疗需求。生长因子的应用为骨缺损治疗提供了一种可供选择的治疗方式。目前经FDA批准的用于临床骨修复的生长因子主要是BMPs家族蛋白，其中rhBMP-2的活性最强，但在临床运用中rhBMP-2却存在治疗费用较高，有效剂量难以控制易导致异位成骨、过量成骨、新生骨快速吸收等成骨异常现象出现。本文针对rhBMP-2在临床运用中出现的问题，试图寻找到一种替代因子或与rhBMP-2联用能解决其成骨异常问题的因子。力生长因子E肽(C-terminal24-amino acid peptide of mechano growth factor, MGF24E)是近年来引起广泛关注的一个功能活性多肽，是受损组织表达的一种IGF-I选择性剪接变体，实验已证明它能保护受损组织及细胞，促进损伤修复。基于本课题组对MGF24E的前期研究成果，本研究从影像学、组织学以及生物力学等多方面证实了力生长因子E肽(MGF24E)以及MGF24E+rhBMP-2联合用药在临界骨缺损修复中的积极作用，同时在细胞学水平、基因水平以及蛋白质水平探讨了损伤修复机制。研究的主要内容和所取得的结果如下：1.在制备了1mm左右间隙的SD大鼠桡骨开放性骨折模型的基础上，利用前期制备的MGF/MGF24E兔抗人多抗，采用Western blot技术检测和分析大鼠骨折修复组织中MGF蛋白的表达情况。结果显示截骨损伤组织中MGF蛋白表达在术后1天即上升到较高值，术后第3天达到最高值，随后表达量虽有下降但仍维持较高表达。2.从影像学和组织学的观察及分析角度，综合评价外源MGF24E注射修复兔桡骨节段性骨折的效果。①高剂量MGF24E修复兔桡骨5mm节段性骨折的临床愈合时间，较MGF24E低剂量组和阴性对照组提早2周；MGF24E高剂量组重建骨组织为髓腔贯通的管状骨，其修复情况明显好于MGF24E低剂量组和阴性对照组；②高剂量MGF24E能显著促进骨折重建组织的血管新生，组织学评分结果显示高剂量组样本新生血管数为阴性对照组的2倍以上。3.采用2%FBS血清饥饿细胞模型，以PBS为阴性对照、100ng/mL VEGF165为阳性对照，考察MGF24E对人静脉内皮EA.hy926细胞增殖、迁移和体外管腔形成的影响；以PBS为阴性对照，10%FBS正常培养条件为阳性对照，考察10ng/mLMGF24E对人静脉内皮EA.hy926细胞VEGF和Ang-I的mRNA及蛋白表达的影响；同时还研究了MAPK/ERK通路在MGF24E影响血管内皮细胞体外血管化细胞行为及其分子机制中的作用。①10ng/mL MGF24E促细胞增殖能力等效于100ng/mLVEGF165，MGF24E促细胞增殖是通过增加S期细胞数目和促进细胞DNA合成的方式完成，并完全依赖MAPK/ERK信号通路；②MGF24E促细胞迁移、管腔形成的能力明显强于PBS阴性对照，但弱于VEGF165，并发现MAPK/ERK通路部分参与了MGF24E促细胞迁移、管腔形成等事件；③MGF24E能逆转血清饥饿引起的正常生长细胞VEGF和Ang-I表达下调的趋势，其上调量高于正常培养组的表达量，并发现MAPK/ERK通路部分参与了MGF24E上调VEGF和Ang-I表达的整个过程。4.采用7%FBS血清饥饿细胞模型，以PBS为阴性对照、100ng/mLVEGF165+50ng/mL rhBMP-2的联合用药为阳性对照，25ng/mL MGF24E、50ng/mLrhBMP-2单给药为联合用药组的增效参照，考察25ng/mL MGF24E+50ng/mLrhBMP-2联合用药对原代成骨细胞增殖、迁移、分化早期指标ALP活性以及矿化钙分泌量表达的影响，并研究其分子机制。①MGF24E促细胞增殖能力强于rhBMP-2和PBS，相对于MGF24E或rhBMP-2单独给药，MGF24E+rhBMP-2联合用药对促进细胞DNA合成、迁移和分化矿化有协同增效作用；阳性对照除对促进细胞迁移有协同增效作用外，在其他成骨相关细胞生理行为上均表现为拮抗抑制作用；②MGF24E+rhBMP-2联合用药在细胞分化矿化事件上的协同增效作用主要涉及调控成骨信号通路的转录因子Runx2基因和骨基质形成的OPN基因表达上调。5.以可吸收明胶海绵(Absorbable Gelatin Sponge, AGS)作为载体，采用低温负压物理吸附法制备4种不同给药方案的复合生长因子支架，并对复合支架的形貌结构、孔隙率、生长因子的体外释放以及支架细胞相容性等性能进行评价。①扫描电镜结果显示，生长因子成球状分布于复合AGS支架内部，支架孔径和孔隙率能满足成骨细胞长入；②体外释放结果显示，不同复合支架中生长因子的体外释放均发生突释现象，其中MGF24E释放最快，rhBMP-2释放最慢，生长因子的释放规律可满足机体对MGF24E需求以及临床上rhBMP-2的一次性高浓度给药方式；③复合支架中成骨细胞活性实验结果显示，各组复合支架表现出细胞相容性差异，联合用药组和MGF24E组支架的细胞相容性优于rhBMP-2组和阴性对照支架。6.建立了兔桡骨15mm节段性临界骨缺损模型，以PBS为阴性对照、80μgrhBMP-2为阳性对照，从影像学、组织学和生物力学三方面考察200μg MGF24E和200μg MGF24E+80μg rhBMP-2联合用药对临界骨缺损修复的作用；依据成骨相关蛋白OPN和新生血管标记蛋白CD31的表达规律分析MGF24E和MGF24E+rhBMP-2联合用药的临界骨缺损修复机制。①影像学结果显示，联合用药修复临界骨缺损的骨皮质桥接愈合时间为12周，骨痂桥接的临床愈合时间为4周，早于rhBMP-2组；rhBMP-2组样本愈合经历了过度成骨，新生骨快速吸收（尺桡骨融合现象）的过程，联合用药完全逆转了rhBMP-2骨修复异常的趋势；术后12周MGF24E组虽只有50%样本达到骨皮质愈合标准，但远多于阴性对照组；各组4-12周骨改建时期影像学修复情况符合时间的线性函数关系；②组织学结果显示，术后初期联合用药组和MGF24E组支架的组织相容性优于rhBMP-2组和阴性对照支架；组织学分析显示联合用药组愈合情况最好，优于rhBMP-2组和MGF24E组，表现出联合用药的协同增效作用；各组组织学愈合情况满足时间的对数函数关系；③生物力学试验结果显示，虽然各用药组缺损区重建组织骨质连续，但其力学性能仍低于正常桡骨组织；各用药组样本刚度依次为：联合用药组> rhBMP-2组> MGF24E组，样本弯曲强度刚度依次为：联合用药组>MGF24E组> rhBMP-2，组联合用药组在力学性能上表现出协同增效作用；④修复机制研究结果显示，用药组骨缺损愈合方式为软骨内成骨；MGF24E组能提早启动骨基质合成和血运恢复，因此含有MGF24E的联合用药组样本新骨形成量多于rhBMP-2组，但MGF24E的这种促进作用主要体现在术后初期，随着rhBMP-2组样本血运的逐渐恢复，联合用药组和rhBMP-2组间新骨形成差异逐渐减小。综上所述，MGF24E既能显著地促血管新生，又能在一定程度上促进体内成骨，因此MGF24E+rhBMP-2联合用药能使临界骨缺损提早愈合，其修复质量也优于rhBMP-2或MGF24E单给药，表现出协同增效作用，并且联合用药能解决rhBMP-2成骨异常问题，为后续骨缺损修复的研究奠定了基础。
李殿奇[8]2016年在《PDGF-BB调节成、破骨细胞的作用机制及促进骨愈合的实验研究》文中认为研究背景：随着社会经济和交通运输的发展,骨折的发生率逐渐增高,因颌面部的位置暴露,骨骼框架内以腔隙为主,是外伤后骨折的好发部位。影响骨折愈合的因素有很多,包括骨折类型、骨折部位、局部血液供应、患者年龄和健康状况以及医源性因素等。虽然大多数骨折在解剖复位及固定治疗后可以良好愈合,但仍然有约5%至10%左右的患者骨折发生延迟愈合或骨不连。颌面部骨折以及骨缺损会直接影响患者的功能和外形的美观,颌面部骨是面部外形的基础,受损后会影响患者的咀嚼和发音等功能,严重影响生活质量。引起骨缺损的主要病因包括：创伤、肿瘤及术后、感染和某些与骨组织相关的先天性疾病等。许多体外及动物实验研究发现,PDGF(血小板源性生长因子)通过血小板释放等方式在创伤区域出现较早,促进成骨相关细胞的迁移和募集以及细胞的增殖：在体内实验中发现PDGF-BB可以通过促进血管形成、促进糖尿病动物模型中的骨折愈合以及细胞的迁移,并且可以用于治疗骨质疏松症。然而,PDGF-BB对破骨细胞形成的作用还没有明确的结论。骨愈合是一个复杂的、包含多个阶段的过程,创伤后许多生长因子和细胞因子通过血液扩散或细胞分泌等方式聚集于骨折区域。不同的细胞因子分别在不同阶段的参与并促进骨折的愈合。目前临床及实验中修复骨缺损的方法,主要包括骨组织的自体移植、同种异体移植、异种骨移植和人工材料植入,以及口腔颌面部常用的牙槽骨的引导骨再生技术、牵张成骨、赝复体修复和组织工程技术等。骨组织工程技术作为一种有效手段被广泛应用于骨缺损的研究与治疗中。研究目的：通过研究PDGF-BB在体外细胞实验中对间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞等细胞的生物学功能的调节作用,及调控成骨细胞-破骨细胞共培养体系中细胞生物学功能的作用及其机理。研究与探讨PDGF-BB在体外对间充质细胞和成骨细胞增殖、分化和矿化等作用的调节作用,对RAW264.7细胞系及BMMs(骨髓单核巨噬细胞)形成破骨细胞的作用及机制,以及在成骨细胞-破骨细胞共培养条件下PDGF-BB调节成、破骨细胞间的相互作用及机制；构建大鼠下颌骨骨折愈合模型,研究PDGF-BB在体内实验中调节破骨细胞形成的作用,并探讨PDGF-BB在大鼠下颌骨骨折愈合过程中的生物学作用及机制；以期发现PDGF-BB对骨折愈合的调节作用并探讨其机制;构建缓释PDGF-BB的生物学支架材料,研究材料的缓释性能和生物相容性,及促进大鼠颅骨缺损愈合的作用,为指导临床中应用组织工程方法治疗骨缺损提供实验和理论依据。材料与方法：1、通过体外分离培养原代小鼠骨髓间充质细胞、原代成骨细胞、原代单核细胞以及RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞系)等细胞,来研究PDGF-BB对于骨髓间充质细胞、成骨细胞和破骨细胞的生物学作用。(1)取小鼠髓腔骨髓基质细胞,进行原代骨髓间充质细胞培养,研究PDGF-BB对于细胞多向诱导分化、细胞增殖和相关基因表达的影响；(2)采用骨组织块法,培养原代成骨细胞,研究PDGF-BB对于细胞成骨分化、增殖和成骨分化相关基因表达的作用；(3)培养原代单核细胞及RAW264.7细胞系,研究PDGF-BB调节破骨细胞形成和破骨细胞前体细胞趋化性的作用及其机制,实验中使用PDGFR-β抑制剂(AG-1295)、JAK2抑制剂(AG490)以及STAT3抑制剂(S3i-201)等来阻断相关信号通路,进一步探讨和分析在体外实验中对破骨细胞形成的影响；(4)构建成骨-破骨共培养体系,研究PDGF-BB在成骨-破骨间的相互关系及其机制。2、构建较为完善的下颌骨骨折模型,然后利用该模型通过组织学及影像学检查等方法,研究PDGF-BB对于下颌骨骨折愈合的作用。(1)通过体外测量与评估下颌骨形态及骨质,设计并制作不同类型的下颌骨骨折模型,通过组织学、影像学方法评估下颌骨骨折模型的情况,选择其中模拟骨折愈合过程最优的模型,用于进一步的实验研究；(2)利用构建下颌骨骨折模型,术后1、2、3周等时间点进行TRAP染色,研究PDGF-BB在动物实验中对破骨细胞形成的调节作用；(3)结合下颌骨骨折模型,设计对照组及局部应用PDGF-BB的实验组,术后于不同的时间点取材,通过组织学及影像学检测,研究PDGF-BB对骨折愈合的影响。3、设计并制作壳聚糖复合介孔硅纳米材料的复合支架,研究负载rhPDGF-BB(重组人血小板源性生长因子)的壳聚糖-介孔硅复合支架材料修复大鼠颅骨缺损的能力。(1)将壳聚糖和介孔硅两种材料混合,采用冷冻干燥法将材料制作成型并负载PDGF-BB蛋白,构建不同配比的壳聚糖和SBA-15复合材料,使用扫描电子显微镜观察支架材料的表面微结构；(2)并通过体外实验研究材料的细胞毒性、生物相容性：通过CCK-8细胞活性测定和矿化诱导后的茜素红染色评价PDGF-BB对骨髓基质细胞增殖和成骨分化的作用；并研究复合支架的体外缓慢释放PDGF-BB蛋白的能力；(3)构建大鼠临界颅骨缺损模型,在骨缺损中植入不同分组的材料,术后使用半定量X线检查、显微CT和组织学等方法检测大鼠颅骨缺损模型中的新骨形成,评估复合支架材料促进骨缺损愈合的能力。结果：1、PDGF-BB能促进骨髓基质细胞的增殖,以及部分成骨细胞分化相关基因转录水平增加,促进了骨髓基质细胞的成骨分化与矿化形成能力；在成骨诱导后期使用PDGF-BB对于间充质细胞矿化无明显的促进作用,前期给予PDGF-BB与诱导过程中全程加入PDGF-BB无明显区别：PDGF-BB能促进小鼠原代成骨细胞中碱性磷酸酶、骨钙蛋白、骨钙素、Runx2核转录因子、骨形态形成蛋白等与成骨相关的基因转录水平的增高,与血管生成和细胞迁移能力相关的金属基质蛋白酶-9基因的转录水平也明显增加。同时,P13K抑制剂LY294002能抑制甚至下调这些基因的转录水平；2、PDGF-BB能促进破骨细胞形成,同时这种促进作用能够被JAK2抑制剂AG490、PDGF-Rβ抑制剂AG-1295以及STAT3抑制剂S31-201所降低；PDGF-BB在体外细胞实验中能促进破骨细胞形成,而AG490和AG1295抑制这种作用。PDGF-BB促进了RAW264.7细胞中ERK1/2,Akt和STAT3的磷酸化。AG490能抑制PDGF-BB诱导的STAT3磷酸化；PDGF-BB上调了破骨细胞生成相关信号分子NFATc1、DC-STAMP和BCL-2的表达,AG-1295、AG490和S3I-201能降低该促进作用；PDGF-BB增强RAW264.7细胞迁移作用,通过促进破骨细胞前体细胞趋化增强破骨细胞形成,PDGF-BB促进MMP-9蛋白的表达,PDGFR-β抑制剂和JAK2抑制剂能抑制PDGF-BB促进细胞迁移的作用；3、在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中,PDGF-BB对破骨细胞形成的促进能力较直接作用于破骨细胞的条件下有所下降,其可能的机制是PDGF-BB促进成骨细胞合成并分泌一氧化氮,从而抑制破骨细胞的形成。PDGF-BB促进成骨细胞形成一氧化氮的作用,能够被JAK2抑制剂AG490、PDGF-Rβ抑制剂AG-1295、STAT3抑制剂S31-201以及iNOS抑制剂SMT所逆转；此外PDGF-BB能促进成骨细胞MCP-1的表达,在加入PDGF-Rβ与JAK2/STAT3的抑制剂能够抑制这种促进作用；4、通过测量并评估下颌骨的骨质情况及解剖结构,我们设计了下颌骨下缘入路和构建的下颌骨骨折模型,并通过评估三种不同大鼠下颌骨骨折的术后组织学、影像学表现,以及力学性能,来选择最优的骨折模型,用于之后的实验研究。在骨折模型的评估中我们发现,裂隙组能够比较好的模拟骨折愈合的生物学过程,即血肿形成、血肿机化、纤维骨痂形成和骨性骨痂形成这一过程；而且该模型的可重复性和统一性较好,能够保证实验研究的大样本量和实验数据的可重复性与各组间数据的可比性；此外,结合我们对于正常愈合情况下,骨折愈合在组织学上的表现研究,我们发现该下颌骨骨折模型除了研究骨折愈合过程外,还可以用于研究骨折愈合过程中破骨细胞的形成；5、结合我们构建的下颌骨骨折愈合模型,我们发现PDGF-BB在体内实验中促进破骨细胞的形成。骨折愈合第1周,在对照组中未发现破骨细胞形成,而PDGF-BB组有明显的破骨细胞形成,说明PDGF-BB促进了破骨细胞形成;PDGF-Rβ抑制剂AG-1295.JAK2抑制剂A6490明显抑制了PDGF-BB所促进的破骨细胞形成。在大鼠下颌骨折愈合的第2周,破骨细胞形成量与PDGF-BB组与对照组相比明显增加,AG-1295和AG490组均抑制了破骨细胞形成；将外源性PDGF-BB应用于骨折区域,在组织学与影像学检查中均发现,PDGF-BB促进了骨折的愈合。6、壳聚糖/SBA-15复合支架材料具有理想的促进骨再生的潜质,具有良好的孔隙率与应力学性能,在体外实验中壳聚糖/SBA-15复合支架材料对大鼠骨髓基质细胞无明显的细胞毒性,能有效保证PDGF-BB以持续和稳定的方式释放；在体外细胞实验中,负载rhPDGF-BB的复合支架在具有良好的生物相容性,复合支架材料的缓释浸出液促进大鼠骨髓基质细胞的增殖和成骨分化：在大鼠颅骨缺损模型中,通过对半定量X线和Micro-CT等影像学检查结果和组织学检查结果的评估,表明负载rhPDGF-BB的壳聚糖/SBA-15复合支架材料可以促进大鼠颅骨临界骨缺损中新骨形成,其中CTS/S20组中新骨形成量显着大于其他组。结论：1、PDGF-BB能够促进间充质干细胞的增殖及促进其矿化,促进成骨细胞的增殖与分化；并且能够通过PDGF-Rβ-JAK2-STAT3通路来直接作用并促进破骨细胞的形成；PDGF-BB在成骨细胞-破骨细胞共培养体系中能够通过JAK2-STAT3通路促进成骨细胞分泌一氧化氮等产物,从而间接抑制破骨细胞的形成；PDGF-BB能促进破骨前体细胞的迁移,这可能与PDGF-BB促进MMP-9和MCP-1蛋白的表达有关；2、我们设计的下颌骨骨折模型可以用于研究骨折愈合过程,以及骨折愈合过程中破骨细胞的形成；PDGF-BB能促进体内破骨细胞的形成,这一促进作用与PDGF-Rβ-JAK2-STAT3通路相关;PDGF-BB能促进大鼠下颌骨骨折模型的愈合；3、负载rhPDGF-BB的壳聚糖-介孔硅复合支架具有良好的生物活性和生物相容性,具有良好的促进细胞粘附能力,这一支架作及组织工程方法有望在不断改进后能应用于颅颌面部大面积骨缺损的治疗。
蒋建召[9]2010年在《富血小板血浆复合自体浓缩红骨髓促进骨缺损愈合的实验研究》文中研究指明背景和目的促进骨缺损的愈合一直是骨科学研究的重要课题之一,富血小板血浆是自体全血经过离心得到的血小板浓缩物,其血小板浓度至少为全血中血小板浓度的4倍以上。富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)中含有高浓度的多种生长因子如：血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)、转化生长因子-β1、β2 (transforming growth factor-β1、β2, TGF-β1、β2)、类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、上皮细胞生长因子(epithelial cell growth factor, ECGF)等。一些学者发现富血小板血浆具有相当明确的促进软组织修复和加速骨愈合的能力。红骨髓中富含多种生长因子、骨形态生成蛋白、骨髓基质细胞、骨内膜细胞、诱导性骨祖细胞(Induced Osteoprogenitor Cell, IOPC)和定向性骨祖细胞(Determined Osteoprogenitor Cell, DOPC),是优秀的促进骨愈合的移植组织。本实验以兔桡骨骨缺损为模型,观察富血小板血浆与自体浓缩红骨髓复合对骨缺损修复的影响,从而为临床治疗骨缺损提供新的思路和方法。方法将健康新西兰大白兔72只随机分为A、B、C、D四组(每组18只),建立双侧桡骨骨缺损模型；采用改良Curasan法制作PRP；无菌条件下以16G骨穿针穿刺髂骨,用预先肝素湿化的注射器抽取1ml骨髓,置于离心管中以1000r/min离心10min,抽取底层约0.2ml浓缩红骨髓备用；以抑肽酶溶液溶解纤维蛋白胶(80mg/ml),加入自体PRP或/和RBM,使用时加入催化剂溶液(由1ml10%CaCl2和1000U凝血酶混合而成),约20秒即呈凝胶状。A组植入PRP+RBM+FG,B组植入PRP+FG,C组植入RBM+FG,D组为空白组,不作处理。分别于术后第4、8、12周通过大体观察、X线检查、组织学观察及影像学评分等方法观察骨缺损修复情况。结果术后4周时：A组骨缺损区大量纤维骨痂形成,较B、C组多,D组骨缺损区为纤维组织填充。X线检查显示A组骨缺损处为斑片状阻射阴影形成,B、C组为连续性絮状阻射影,D组骨缺损处呈透光影,断端可见少许絮状阴影。影像学评分A组高于B、C、D组(P<0.05)。术后8周时：A组骨缺损处为连续性骨痂呈膨胀型生长,骨折线消失,B、C组骨缺损处为硬质骨痂填充,D组骨缺损处两断端有少量骨痂形成。X线检查显示A组两断端模糊,骨缺损处为连续性呈膨胀型高密度影,B、C组骨缺损区为连续性高密度阻射影,两断端模糊,D组骨缺损清晰。影像学评分A组高于B、C、D组(P<0.05)。术后12周时：A组骨缺损处骨形态良好,外观类似正常骨,B、C组骨缺损处为硬质骨痂填充,直径大于正常桡骨,D组缺损处为纤维组织填充,两断端硬化。X线检查显示A组骨缺损消失,桡骨骨皮质连续,髓腔贯通,B组骨缺损呈膨胀型连续性高密度阻射影,髓腔部分再通,C组骨缺损处呈均匀一致的高密度影,桡骨两侧骨皮质连续,髓腔部分再通,D组骨缺损处呈清晰的透亮影,两断端硬化。影像学评分A组高于B、C、D组(P<0.05)结论PRP复合RBM以FG为载体植入兔桡骨骨缺损区,具有明显促进骨缺损愈合的作用。
参考文献：
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