曾茜茜1 饶瑞瑛1 施晓峰2 柳景青3 程东庆1(通讯作者)
（1浙江中医药大学医学技术学院 浙江 杭州 310053）
（2浙江中医药大学生命科学学院 浙江 杭州 310053）
（3浙江大学建筑工程学院 浙江 杭州 310058）
【摘要】 目的：对志贺氏菌显色培养基上的假阳性菌进行鉴定，为进一步鉴别志贺氏菌并改良显色培养基提供数据。方法：将本实验室前期分离自自来水管网生物膜的52株志贺氏菌显色培养基上假阳性菌，通过生化方法进行进一步鉴定。结果：经鉴定52株菌均为革兰阴性非志贺氏菌，分别为9个属：假单胞菌属（48.08%）、埃希氏菌属（17.31%）、枸橼酸杆菌属（13.46%）、不动杆菌属（7.69%）、普罗菲登斯菌属（3.85%）、弧菌属（3.85%）、肠杆氏菌属（1.92%）、变形杆菌属（1.92%）、寡养单胞菌属（1.92%）。结论：有多种菌可能干扰显色培养基对自来水管网生物膜样本中志贺菌的分离鉴定，假单胞菌属的干扰性最大，需针对这些假阳性菌与志贺氏菌的生理生化特性改良志贺氏菌显色培养基。
【关键词】 假阳性菌；检测；改良
【中图分类号】R37 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）16-0258-02
志贺氏菌(Shigella)俗称痢疾杆菌 ,是引起人细菌性痢疾的肠道病原菌, 只需少量就可以发病,对人类生命安全和社会稳定有较大影响[1]。随着微生物实验技术的发展, 志贺菌的检测鉴定技术也不断完善, 大致可以分为如下几类方法:培养与生化鉴定, 免疫学鉴定, 毒素检测以及分子生物学检测[2]。这几种检测方法都各有利弊。大量的文献报道表明显色法具有相对较高的敏感性和特异性,操作简便、快速, 可大大节省人力和物力，因此目前显色培养基法被广泛应用于大量样品的初筛[3-6]。我们实验室开展自来水管网生物膜微生物的调查研究，用志贺氏菌显色培养基分离志贺菌时发现，一些菌落为白色或无色的可疑菌，与志贺氏菌诊断血清不能发生凝集。本研究对这些假阳性菌进行进一步鉴定与分析，旨在揭示实验干扰菌的本质，为改进实验工艺提高分离率奠定基础。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1菌株 实验室保存的志贺氏菌显色培养基上白色或无色的可疑菌，但诊断血清凝集阴性的菌。
1.1.2主要仪器 全自动微生物生化鉴定仪(VITEK 2 COMPACT；生物梅里埃公司）；生化培养箱（SHP-250型；上海森信实验仪器有限公司）；高压蒸汽灭菌（YXQ-LS-100SII型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；电热恒温鼓风干燥箱（DGG-9240A型，上海森信实验仪器有限公司）。
1.1.3主要试剂 营养琼脂培养基（杭州微生物试剂有限公司）；志贺氏菌显色培养基、细菌微量生化鉴定管（青岛海博生物技术有限公司）；其他常用试剂均购自华东医药有限公司器材化剂分公司。
1.2 方法
52株菌经营养琼脂活化后，革兰染色。若革兰染色为阳性球菌，做细菌微量生化鉴定，鉴定方法参照伯杰细菌鉴定手册第八版。若为革兰阴性杆菌，做氧化酶和O/F实验，将氧化酶阴性、O/F结果为发酵型的细菌做肠杆菌科生化编码鉴定；氧化酶阳性、O/F结果为发酵型的做弧菌科生化编码鉴定；氧化酶阳性、O/F结果为氧化型的做非发酵生化编码鉴定。微量生化鉴定方法难以鉴定的菌株，做自动化鉴定。
2.结果
2.1 菌落形态与革兰染色
志贺氏菌显色培养基上志贺氏菌显白色或无色，图1所示，有些宋内氏志贺氏菌有蓝色中心；大肠杆菌和大肠菌群显绿色或黄色；沙门氏菌显黄色或无色并有黑色中心；其它细菌显蓝绿色或黄色。变形杆菌和铜绿假单胞菌基本不生长。
3.讨论
志贺氏菌是引起人类肠道疾病常见的病原菌，在我国感染性腹泻病原菌中高居首位。为了能够有效地预防、治疗和控制水或食源性传染病，对水或食品中的志贺氏菌的建立快速、有效地检测和鉴定方法显得尤为重要[7]。
显色培养基因为将微生物的分离与鉴定合二为一，具有省时省力、操作简便、敏感性和特异性都较高的优点,特别是能与常规检测方法较好地接轨而越来越受到国内外的关注[8]。我们选用的志贺氏菌显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，其利用志贺氏菌属生化反应不活跃的特性，使非目标菌与志贺氏菌显现不同颜色来对志贺菌属进行分离和初步鉴别。培养基中混合显色剂对应不同细菌的酶发生特异性反应，水解底物，释放显色基团；特殊营养物质提供细菌生长所需物质；琼脂是培养基的凝固剂。显色培养基上，志贺氏菌显白色或无色，有些宋内氏志贺氏菌有蓝色中心。因大肠杆菌和大肠菌群在培养基上显绿色或黄色；沙门氏菌显黄色或无色并有黑色中心；其他细菌显蓝绿色或黄色；变形杆菌和铜绿假单胞菌基本不生长，可排除非目标菌对志贺氏菌的干扰。
基于志贺氏菌显色培养基上也可能存在无色透明菌但不是志贺氏菌这一情况，本实验对28个水样中分离到52株在志贺氏菌显色培养基上观察为可疑菌，但未发生志贺氏菌血清凝集反应的菌，怀疑其为假阳性菌，对其进行检测。结果显示52株菌均为革兰阴性菌，属于9个菌属，且48.08%属于假单胞菌属，为铜绿假单胞菌和施氏假单胞菌。而埃希氏菌属和枸橼酸杆菌属对志贺氏菌也存在一定的干扰性，在52株菌中分别占17.31%和13.46%。不动杆菌属，弧菌属，肠杆氏菌属，变形杆菌属，寡养单胞菌属影响较小。综上表明在志贺氏菌显色培养基上也存在假阳性的情况，其中假单胞菌属对志贺氏菌的干扰性最强。
我们从上述实验结果可见，志贺氏菌显色培养基也具有一定缺点，某些杂菌也具有和志贺氏菌同样的酶，从而出现个别的假阳性现象,如假单胞菌属在志贺氏菌显色培养基上的菌落形态与志贺氏菌相似，在样品初筛中易把其与志贺氏菌混淆，从而影响志贺氏菌的检出率。若要对此显色培养基进行改良，可通过在培养基成分中添加1%盐酸四甲基对苯二胺（氧化酶试剂），使假单胞菌属菌落呈紫色，而志贺氏菌属不显色，排除假单胞菌属对志贺氏菌的干扰。也可增加其他有效成分排除其他干扰菌，提高志贺氏菌的检测效率。
【参考文献】
[1]游勇来，陈文.动物源性食品中志贺氏菌的分离与鉴定[J]．检验检疫学刊，2010,20（5）：35-37.
[2]董杰．志贺菌检测技术研究进展[J]．中国预防医学杂志，2007，8（4）：504-506.
[3]许柯，劳华均，孙萍等．不同种鉴定平板对福氏志贺氏菌检测效果的比较[J].食品工业，2013,34（2）：191-193．
[4]卢勉飞，吴清平，刘云林等．特异性酶反应在食源性致病菌检测中的应用[J]．中国卫生检验杂志，2005,，15(3):354-356.
[5]吴清平，周艳红，蔡芷荷．卫生微生物特异性显色培养基的研究与应用[J]．中国卫生检验杂志，2005，15(1):124-126.
[6]杨兰，许学斌，姚宗蓓等．CHROMagar显色培养基分离沙门菌的初步应用和评估[J]．检验医学，2005，20(1):52-54.
[7]林晓丽，赖卫华，张莉莉.志贺氏菌检测方法的最新研究进展[J].食品科学，2009,30(15):271-275.
[8]胡杨峰,何艳玲,刘沛.自主研制志贺氏菌显色培养基的应用效果评价[J]．中国国境卫生检疫杂志,2012，35(01):68-26．
基金项目：水体污染控制与治理国家科技重大专项资助项目(2012ZX07403-003)
论文作者:曾茜茜1,饶瑞瑛1,施晓峰2,柳景青3,程东庆1(通
论文发表刊物:《医药前沿》2016年6月第16期
论文发表时间:2016/6/23
标签：培养基论文; 显色论文; 鉴定论文; 生化论文; 胞菌论文; 氧化酶论文; 细菌论文; 《医药前沿》2016年6月第16期论文;