（1临沂市人民医院检验科 山东 临沂 276034）（2临沂市中心血站 山东 临沂 276034）
【摘要】目的:探讨多技术联合检测用于结核病及耐多药结核病快速诊断的临床价值。方法:以改良罗氏培养法为对照，应用离心涂片荧光染色法、GEN-XPERT对我院2015.12-2017.01间722例临床诊断结核病（包括20例NTM感染病例）患者进行实验室快速诊断；以比例法药敏试验为对照，应用GEN-XPERT与线性探针GenoType MTBDRplu相结合对272例菌阳结核病人进行利福平和异烟肼的耐药检测，计算快速法对耐多药结核病的检出率。结果:以改良罗氏培养法为金标准，离心涂片荧光染色法与GEN-XPERT结合的快速法的敏感度为95.1%，特异度为99.8%；以传统比例法药敏实验为金标准，快速法对MDR结核病检出率为73.1%。结论:以离心涂片荧光染色镜检、GEN-XPERT、GenoType MTBDRplu为组合的多技术联合检测对快速诊断结核病及耐药结核病的敏感性好、特异性高，结果报告时间缩短为12天。具有快速准确的诊断价值。
【关键词】荧光染色；GEN-XPERT；线性探针；罗氏培养法；比例法药敏实验。
【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）02-0072-02
Unite tuberculosis detection techniques to diagnosis of TB and MDR – TB Qi Chaoqun,Yin Zuomei.
【Abstract】Objective To?explore?the?clinical?value?of Combined detection?of?multiple?technologies?for?the?rapid?diagnosis?of?tuberculosis(TB)?and?MDR–TB. Methods According to Compare with Jensen law, unite the Centrifuging the liquored sputa and fluorescence staining, GEN-XPERT to detect the tuberculosis of 722 patients(between December 2015 and January 2017) ( including NTM infections of 20 cases ), Compare with proportion method test of drug sensitivity, use linear probe GenoType MTBDRplu and GEN-XPER to detect the mutant gene, calculating the rate of MDR–TB, At the same time analysis of resistance genes, for TB infection or provide valid according to the source of the outbreak. Result With Jensen as the gold standard, The sensitivity of this method was 95.1%, specificity was 99.8%, with the conventional proportion method test of drug sensitivity as the gold standard, The method of MDR tuberculosis detection rate was 73.1%.Conclusion This method of Combined detection of multiple technologies for the diagnosis of TB and MDR-TB has high sensitivity and specificity. The TAT time is to 1-2 days. Has fast and precise diagnostic value.
【Key words】Fluorescent staining; GEN-XPERT; Line probe; GenoTypeMTBDRplu; Jensen law; The proportion method test of drug sensitivity
结核病作为一种传染病，它的流行要具备三个条件：传染源，传播途径，易感人群。我国早在1982年就已经实施出生的婴幼儿接种卡介苗来保护结核菌易感人群，然而，随着人们生活水平的提高，糖尿病的发病率，艾滋病等的发病率呈逐年上升的趋势，严重降低了人群对结核菌的抵抗力；结核病的传播途径为呼吸道飞沫传播，随着社会的发展，交通的便捷，人流物流都在加快，传播途径也不容易阻断；因此，控制传染源已经完全成为控制结核病的有效手段。2016年，全国有95万人患结核病，死亡1600人之多[1]；耐药结核病，尤其是耐多药结核病（MDR-TB）更是结核病控制的重大威胁。本研究采用多技术联合的方法同时进行检测，分析方法的敏感性、特异性及检出率，以期用于结核病及耐多药结核病的快速诊断。
1.材料与方法
1.1 标本来源
722例临床诊断结核病（包括20例NTM感染病例）患者的标本采自2015年12月-2017年1月，临沂市人民医院及兰山区第三人民医院住院及门诊病人。包括痰标本688份，支气管肺泡灌洗液5份，肺外标本29份（包括尿液、胸腹水、胃液、脓液、脑脊液等）。各种标本的留取方法参见《结核病实验室检验规程》[2]。
1.2 患者的诊断
通过回顾查阅患者的病案资料，722例（包括20例NTM感染病例）都符合2002年卫生部制定的临床诊断标准《临床诊疗指南结核病分册》，临床表现有长期低热、盗汗、反复咳嗽、咳痰、消瘦、食欲不振、精神乏力等，经抗结核治疗有效。
1.3 方法
1.3.1标本前处理 前处理采用碱处理法，标本转移至离心管，根据标本性状加入1～2倍量NALC-NAOH，震荡至均匀的状态，然后静置消化15分钟，用GENEXPERT TB/RIF的专用吸管吸取2ml加入CARTRIDGE反应盒内，尽快放入GENEXPERT TB/RIF反应仪启动反应，剩余的离心管里加入已经灭菌的PH 6.8的PBS缓冲液至45ml处，颠倒混匀，放入低温离心机（8℃）以3000转/分，离心15分钟，取出，弃去上清液，于沉淀中加入1ml左右PBS液，震荡混匀，静置15分钟，期间给罗氏培养管，玻片编号，然后轻轻打开标本处理管，吸取约0.3ml接种3支罗氏培养管，其中1支放29℃培养，2支放36℃培养，培养阳性的菌株接种传统比例法药敏培养基。然后吸取约0.05ml涂抹于载玻片，制成1×2cm面积的薄膜，进行荧光染色后镜检；涂片或者GENEXPERT TB/RIF任一阳性标本吸取0.005ml加入线性探针DNA提取管，用于GenoType MTBDRplu的实验，扩增程序用标本扩增程序。
1.3.2结核菌检测 痰涂片荧光染色，罗氏培养法，传统比例法药敏实验、XPERT MTB/RIF、GenoTypeMTBDRplu检测步骤皆参照《结核病实验室检验规程》进行。
1.3.3实验结果的判定与报告 若涂片阳性，GENEXPERT TB/RIF阴性，多为NTM感染，报抗酸杆菌阳性，备注：可能为NTM；若涂片阳性，GENEXPERT TB/RIF阳性，报MTB阳性，RIF resistance检出，报利福平耐药（R），RIF resistance未检出，则报利福平敏感（S），RIF resistance不确定，则报利福平耐药结果无法判读；若涂片阴性，GENEXPERT TB/RIF阳性，报告MTB阳性，报告方式同上；GenoType MTBDRplu实验中，若结核分枝杆菌复合群鉴定条带(TUB带)阴性，表示所试细菌不属于结核分枝杆菌复合群，不能用本实验系统判读药敏结果，报告NTM，无药敏结果；若TUB阳性，则按实验要求分别判断对利福平和异烟肼的耐药情况并给出报告。
1.3.4耐多药结核病的快速诊断 若GenoTypeMTBDRplu实验异烟肼耐药，GENEXPERT TB/RIF或GenoType MTBDRplu任一实验利福平耐药，则判为MDR患者。
2.结果
见表1、表2、表3。
以比例法药敏实验为金标准，GENEXPERT TB/RIF 检出对利福平耐药的敏感度为78.8%，特异度为99.6%；GenoType MTBDRplu法检出对利福平的敏感度为75.8%，特异度为99.5%，对异烟肼的敏感度为80%，特异度99.1%。MDR检出率为73.1%，48h内即可对结核病及耐多药结核病作出实验室诊断报告。相比比例法药敏要等7～8周，联合检测技术显示了较大的时间优势。
3.讨论
WHO2014年版《耐药结核病规划管理指南伙伴手册》对药敏试验有所更新，指出药敏试验包括了表型药敏试验（即传统药敏试验）和基因型药敏试验。笔者认真思考和总结了表型药敏试验和基因型药敏试验的区别，表型药敏试验对耐药的定义为：耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药[3]，换句话说，100条结核菌里有1条以上耐药，即对该药耐药，我们做药敏试验磨菌时取的菌量较多，取到那1%的几率要大，而我们的目的菌就是这1%。在基因型药敏试验中，检测的基因突变是对所取标本中所含有的多数菌的DNA扩增产物的分析，而那1%所占比例太小，以至于不能检出，或者就干脆没有取到那1%，它所代表的是较多数细菌的基因突变情况。所以，本实验也印证了表型药敏试验对MDR的检出率比基因型药敏试验要高的道理。李强等[4]的研究也发现了这一现象。
本研究采用的参照体系罗氏培养法分枝杆菌培养、及比例法药敏试验，在快速诊断方面采用离心浓缩涂片荧光染色＋XPERT MTB/RIF+GenoType MTBDRplu的联合检测，通过形态学和分子生物学技术对结核分枝杆菌进行鉴别，显著提高了结核病和耐药结核病人的检出率，解决了涂片荧光染色只能检出抗酸杆菌，无法区分结核或非结核分枝杆菌的问题，XPERT MTB/RIF的检测靶标为DNA，能检出涂片阴性的MTB，把NTM给排除掉，而且能够比较精确地反映菌量的多少，与GenoType MTBDRplu结合检测是否对利福平、异烟肼耐药，各种方法之间优势互补，互相印证，有效避免了假阳性和假阴性的出现，以及标本中非结核分枝杆菌对结果的干扰，满足临床对结核病和耐多药结核病快速诊断的需求。但相对于传统药敏方法，线性探针GenoType MTBDRplu试剂盒成本较高，对实验室环境及技术人员要求也高，很多基层单位无力承担建设基因实验室的费用，广泛推广难度大，是它的不足之处。
【参考文献】
[1]卫生计生部结核病控制中心官网.
[2]赵雁林,逄宇.结核病实验室检验规程，人民卫生出版社,2015年6月,P:5-10.
[3]赵雁林，逄宇.结核病实验室检验规程，人民卫生出版社,2015年6月,P:62.
[4] Li Qiang,Dong Haiyan,Pang Yu,etal,Multicenter Evaluation of the Molecular Line Probe Assay for Multidrug Resistant Mycobacterium Tuberculosis Detection in China[J].Biomed Environ,2015,28(6):464-467.
论文作者:戚超群1,尹作梅2
论文发表刊物:《医药前沿》2018年1月第2期
论文发表时间:2018/2/27
标签：结核病论文; 涂片论文; 检出论文; 利福平论文; 标本论文; 阳性论文; 杆菌论文; 《医药前沿》2018年1月第2期论文;