乔传玲[1]2001年在《表达禽流感病毒HA-NA、HA-NP及NP基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究》文中研究指明禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的禽类的感染和/或疾病综合征，广泛流行于世界上许多国家和地区，给养禽业造成了巨大的经济损失。高致病力禽流感（HPAI）多以突然发病和高死亡率为主要特征，常常导致感染鸡群的全群覆没，被国际兽疫局列为A类烈性传染病。近几年来，在我国的一些地区也相继出现了AI的流行，并于1996年，从广东鹅体内分离到对鸡具有高致病力的H5N1亚型AIV每株，这对于我国的养禽业无疑是个极其危险的信号。一年后，97’香港禽流感直接传播给人并致人死亡事件的发生，更加突出了AIV的公共卫生学意义。 为进一步阐明我国所分离的AIV毒株与香港流感毒株之间的关系，本研究对AIVA/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）[GD3/96］的神经氨酸酶（NA）基因进行了RT-PCR扩增、克隆与测序。结果所得到的NA基因cDNA包含完整的开放阅读框，全长为1410bp，共编码469个氨基酸；通过与香港分离毒株A/Hongkong/156/97（H5N1）、A/Chicken/HongKong/220/97（H5N1）、及A/Teal/Hongkong/W312/97（H6N1）和国内另一株鹅体分离株A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）[GD1/96］进行序列分析，结果发现它们之间核苷酸序列的同源性分别为89.1％、89.1％、88.4％和99.0％，氨基酸序列的同源性分别为90.8％、90.8％、89.8％和99.2％，与香港流感毒株相比，GD3/96 NA的茎部没有19个氨基酸残基的缺失。以上结果表明香港流感毒株的NA基因不是由我国大陆的AIV毒株直接进化而来的。 AIV最大的特点是亚型众多、抗原变异频繁，因而研制一种能够防制所有亚型的AI疫苗是极为困难的。本研究为克服当前疫苗在不同HA亚型之间交叉保护力低的弱点，拟针对AIV的另外两种结构蛋白NP和NA构建重组禽痘病毒（rFPV）或者将它们与AIV的主要保护性抗原HA在rFPV中实现共表达，以期研制一种具有更高交叉保护力的重组病毒疫苗。 将AIV GD1/96的核蛋白（NP）基因和大肠杆菌β-半乳糖苷酶（LacZ）基因串联插入到FPV载体中，构建能单独表达NP蛋白的rFPV转移载体；同时又分别将GD3/96 NA基因和GD1/96 NP基因克隆到含有GD3/96 HA基因的重组转移载体中，构建含有HA-NA、HA-NP两种基因的转移载体。利用脂质体介导的方法将转移载体转染由亲本禽痘病毒S-FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞。依据标记基因LacZ在细胞中是否表达，蓝白斑法筛选重组病毒，经数轮蚀斑纯化，PCR鉴定及Western-blot分析，结果证明所获得的重组病毒rFPV-NP、rFPV-HA-NP、rFPV-HA-NA遗传性状稳定，并能够对其重组的单个或两个外源基因进行高效表达，且在培养细胞中的表达产物具有与AIV蛋白相似的生物学特性及免疫学活性。 将重组病毒rFPV-HA-NA、rFPV-HA-NP、rFPV-NP和rFPV-HA分别经翅下刺种途径免疫8周龄SPF鸡，同时设S-FPV-017免疫组和空白组对照。免疫后4周，分别用HPAIVGD1/96（H5N1）和KP（H7N1）进行致死剂量的攻击。通过检测血清学抗体和外周血液中乔传玲 裹达内沉＠清骂HA．NA．HA川P及NP g因重姐禽伍病霉的沟巨及耳免疫过力的研穴 中日农业科学院CD3”、CD4”、CDS”及y8TCR”四种亚类T淋巴细胞的含量以及攻毒后鸡群消化道排毒、发病和死亡情况来综合评价重组病毒的免疫效力。结果rFPV免疫后，所有鸡均被诱导产生了高水平的＊抗体和NP一、NA－特异性ELISA抗体：：FPV－HA－NA与其它免疫组相比，诱导产生＊抗体的时间提前了一周。T淋巴细胞的检测结果表明rFPV免疫能有效激发机体的细胞免疫应答，使免疫活性T细胞活化增殖，各类T细胞的百分比例均有所升高，并且显着降低了因病毒攻击所导致的T淋巴细胞比例的下降幅度；而所有的对照鸡在攻毒后，各类T淋巴细胞的百分比例均大幅度降低。rFPV－HA－NA、rFPV－HA－NP和rFPV－HA免疫组对HSNI病毒的攻击均获得了100％的保护，它们对HWI毒株攻击的保护率分别为100％、40％和0，而rFPV－NP免疫组对两种亚型病毒的攻击分别获得了40％和30％的保护：S－FPV－0门免疫组和空白对照组在攻毒后全部发病并死亡。重组病毒FFPV－HA－NA、rFPV．HA．N－I，和rFPV．HA免疫组用HSNI病毒攻击后，在鸡的泄殖腔中都没有检出病毒的存在，而rFPV－NP、S－FPV－0门免疫组和空白对照组均分离到了病毒的存在；当用H7NI病毒进行攻击后，rFPV－HA－NA、rFPV－HA－NP、rFPV－NP和rFPV－HA免疫组病毒分离阳性率依次为10O、250、33．3O、100o，而S－FPV－017免疫组和空白对照组均为100O阳性。以上结果表明rFPV在鸡体内都能够稳定复制和高效表达外源蛋白，井能够诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫应答反应：表达产物中NA和＊A是最具有免疫原性的，二者的共表达能够使免疫鸡完全抵抗HSNI和H7NI亚型HPAIV的致死性攻击。 最后对rFPV－HANA的兔疫日龄、兔疫产生时间、免疫持续期及最小免疫剂量进行了测定，结果大约含！0个PFU的重组病毒即能够诱导机体产生 100％抵抗强毒攻击的保护力：免疫接种1日龄叩r鸡，4周后能完全抵抗＊队IV的致死性攻击：两周和叁?
左青山[2]2007年在《共表达禽流感病毒HA5和HA9基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究》文中进行了进一步梳理本试验构建了禽流感HA5和HA9基因共表达禽痘病毒转移载体,经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化,获得了遗传形状稳定的HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)的DNA进行PCR扩增,获得1.7k6的携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞,分别用H5亚型和H9亚型AIV多克隆血清作一抗,碱性磷酸酶标记的鸡IgG为二抗进行Western blot检测,结果表明重组痘病毒能在体外的CEF细胞表达HA糖蛋白。用该重组病毒进行鸡翅刺种免疫60日龄SPF鸡,免疫3周后,每只鸡用50XLD H5亚型HPAIV攻毒,H5免疫组无一发病和死,攻毒保护率100%;H9组用50XLD H9亚型LPAIV攻毒,攻毒保护率20%;对照组全部发病并在攻毒后3-9天相继死亡,发病率和死亡率均为100%。H5抗体效价检测结果表明重组病毒免疫组鸡在免疫后7大即可检测到高效价的HI5抗体,抗体效价在免疫后14天达到高峰,随后在较高水平上缓慢下降,攻毒对抗体效价及其变化没有影响;而H9抗体检测效价较低,平均1.2Log2。通过本试验研究,获得了遗传性状稳定,表达AIV HA5和HA9基因重组禽痘病毒,SPF鸡免疫和攻毒试验结果表明,重组病毒疫苗能全面诱导机体的细胞免疫和体夜免疫反应,对H5强毒攻击产生强的免疫保护,为进一步开展疫苗研究奠定科学的理论和实验基础。
贾永清[3]2000年在《表达禽流感病毒HA基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究》文中研究指明本研究利用RT-PCR方法扩增到一条1.7kb的A/Goose/Guangdong/3/96（H5N1）（GD3）DNA片段，经酶切分析后平端克隆到pUC18中进行了序列测定和分析。结果表明所扩增到的HA基因cDNA全长1731，包含了HA基因完整的开放阅读框架，共编码568个氨基酸，其中信号肽16个氨基酸，HA1 330个氨基酸，HA2 222个氨基酸，并含有起始密码子和终止密码子。GD3与GD1、HK156和HK258核苷酸同源率分别为99.4%、98.6%和98.3%，其受体结合位点和裂解位点的核苷酸与氨基酸组成完全一致。酶切位点的氨基酸序列为一P-Q-R-E-R-R-R-K-K-R-G-L-P-，共有连续5个碱性氨基酸插入。 本试验以LacZ作为报告基因构建了AIV HA基因禽痘病毒转移载体。经转染、蓝斑克隆、筛选和纯化，获得了遗传形状稳定的AIV HA基因重组禽痘病毒。提取感染重组病毒的CEF细胞的DNA进行PCR，扩增出1.7kb的HA基因片段，证明所获得的重组病毒携带有外源目的基因片段。收集纯化的重组病毒CEF细胞培养物无上清液的细胞，用H5亚型AIV多克隆血清作一抗，碱性磷酸酶标记的兔抗鸡IgG为二抗进行Dot-ELISA检测，结果表明重组病毒能在体外的CEF细胞培养中表达HA糖蛋白。Western-blot检测结果证实HA基因表达产物为44kDa（HA1）和23kDa（HA2）的两条带，这两条带都具有与多克隆抗体结合的能力；未发现没有裂解的HAO的存在。 用该重组病毒鸡翅刺种免疫60日龄SPF鸡，免疫3周后，每只鸡用50×LD_50的GD1株HPAIV攻毒，免疫组无一发病和死亡，攻毒保护率100％。而对照组鸡只全部发病并在攻毒后3～9天相继死亡，发病率和死亡率均为100％。HI抗体效价检测结果表明重组病毒免疫组鸡在免疫后7天即可检测到高效价的HI抗体，抗体效价在免疫后14天达到高峰，随后在较高水平上缓慢下降，攻毒试验对抗体效价及其变化没有影响。灭活苗免疫组鸡在免疫后14天方可检测到HI抗体，抗体效价于免疫后第五周达到高峰。对照组鸡免疫和攻毒前后无HI抗体检出。叁组免疫组鸡不同组织器官病毒分离结果全为阴性，而所有对照组鸡都分离到病毒，且肺脏病毒分离率最高（83.9％），脾脏最低（12.9％）。T淋巴细胞亚类检测结果表明：重组病毒免疫后激发了机体的细胞免疫应答，使免疫活性T淋巴细胞活化，攻毒后，免疫鸡CD4~+、CD8~+T细胞和TCR1~+T细胞的数量增高或不变，而对照组鸡CD4~+、CD8~+T细胞和TCR1~+T细胞的数量急剧下降。 总之，通过本试验研究，已经成功地获得了遗传性状稳定，目的基因表达效率高的AIV HA基因重组禽痘病毒，SPF鸡免疫和攻毒试验结果表明，该重组病毒疫苗能全面诱导机体的细胞免疫和体液免疫反应，对强毒攻击产生坚强的免疫保护。本论文基本完成了该基因工程新型疫苗的实验室研究工作，为进一步开展疫苗中试和投入现地使用奠定科学的理论和实验基础，也为我国高致病力禽流感的防制提供了物质储备。
参考文献：
[1]. 表达禽流感病毒HA-NA、HA-NP及NP基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D]. 乔传玲. 中国农业科学院. 2001
[2]. 共表达禽流感病毒HA5和HA9基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D]. 左青山. 新疆农业大学. 2007
[3]. 表达禽流感病毒HA基因重组禽痘病毒的构建及其免疫效力的研究[D]. 贾永清. 东北农业大学. 2000