（1广东医科大学基础医学院 广东 东莞 523808）
（2广东医科大学第二临床医学院 广东 东莞 523808）
（3东莞常安医院心血管内科 广东 东莞 523000）
【摘要】目的：研究脑心通（naoxintong，NXT）对THP-1细胞活力的提高作用及其作用特点。方法：用乙醇和DMSO萃取NXT有效成分，CCK8法检测不同溶剂、不同作用时间和不同终浓度的NXT对体外培养的THP-1细胞活力的影响。结果：NXT的DMSO浸取液可显著提高THP-1的细胞活力至115.84%±3.22%，优于乙醇提取液（P=0.023）；DMSO浸取液的最佳作用终浓度为1/1000，优于其他浓度（P＜0.05），在1～4h内效果优于其他时间（P＜0.01），有效作用时间窗接近8h。结论：NXT能显著提高THP-1细胞活力，NXT DMSO浸取液的最佳作用终浓度1/1000，最佳作用时间1～4h小时。
【关键词】脑心通；THP-1；动脉粥样硬化；细胞活力
【中图分类号】R696.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2019）12-0055-02
Study on the enhancement of THP-1 cell activity by Naoxintong, a traditional compound Chinese medicine
Deng Ziliang1,Chen Qiongxiang1,Guo Hongsheng1,Zheng Caiting1,Li Wanyi1,Zhou Yaxian3,Liang Yanjun3,Wang Sen1, Wang Yan2,3(Corresponding author).
1 Basic Medical College of Guangdong Medical University,Dongguan,Guangdong 523808,China;
2 No.2 Clinical Medical College of Guangdong Medical University, Dongguan,Guangdong 523808,China;
3 Department of Cardiovascular, Chang'an Hospital of Dongguan, Dongguan,Guangdong 523000,China
【Abstract】Objective To research the effect of NXT on THP-1 cell activity.Methods Ethanol and DMSO were used to extract the active components of NXT,and detect the effects of NXT with different solvents, different action time and different final concentration on the activity of THP-1 cells cultured in vitro by CCK8.Results The DMSO extract of NXT significantly increased the cell activity of THP-1 to 115.84%±3.22% (P=0.023), which was superior to the Ethanol extract The optimal final concentration of DMSO extract was 1/1000 (P＜0.05), the effect was significant within 1～4h (P＜0.01),and the effective time window was close to 8h.Conclusion NXT could significantly improve the activity of THP-1 cells.The optimal final concentration of NXT DMSO extract was 1/1000, and the optimal action time was 1～4h.
【Key words】Naoxintong;THP-1;Atherosclerosis;Cell viability
在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发生中，炎症反应及单核/巨噬细胞分泌的大量炎症因子发挥重要作用[1]。巨噬细胞吞噬胆固醇后，转化为泡沫细胞，导致溶酶体破坏，并释放炎症因子，进一步诱导炎症细胞浸润和活化，加剧AS的发生。中药制剂脑心通（naoxintong，NXT）广泛应用于心、脑血管疾病和缺血性疾病，具有抗凝、抗炎、抗氧化、保护内皮、改善微循环、稳定斑块等作用[2]，还可增强机体细胞免疫力及清除自由基[3]，在AS的防治中具有较好的应用前景。人急性单核细胞白血病THP-1细胞在白血病、AS等疾病研究中均有应用，本课题组就NXT对THP-1细胞活力的影响及其作用特点展开实验研究，为进一步研究脑心通防治AS，开发传统中药NXT的新用途提供实验基础。
1.资料与方法
1.1 材料与仪器
THP-1细胞由广东医科大学生化教研室张志珍教授赠送；RPMI1640培养基（美国Gibco 公司，11875）、胎牛血清（美国Gibco公司，10270）；脑心通（陕西步长制药有限公司）； CCK8（日本同仁化学研究所，LH646）；DMSO（D8370），离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，TGL-16 L400）、Thermofisher 160i二氧化碳培养箱、BIO-RAD iMark酶标仪、宁波舜宇XD30倒置荧光显微镜、超净工作台、广州诺尔路生物科技有限公司MX-RD-E混匀器。
1.2 方法
1.2.1 THP-1细胞的培养 THP-1细胞培养于37℃、5% CO2 培养箱中培养，培养基为含10%胎牛血清的RPMI 1640。每 2～3d传代1次，选用对数生长期的细胞用于后续实验。
1.2.2脑心通药物稀释液的制备 将脑心通胶囊中的粉末称重，按照0.1g/ml的质量体积比加入DMSO或无水乙醇（EtOH），室温下于混匀器摇动浸取12h。2500rpm离心20min，取其上清为原液，分装-20℃保存。用无血清培养基倍比稀释成工作浓度（确保使用终浓度中的DMSO不超过1/1000）。
1.2.3 CCK8法检测细胞活力 收集处于对数生长期的THP-1细胞，以每孔2×l04个细胞接种于96孔板。各组设3复孔，按如下实验设计处理后，于细胞培养箱中孵育后，每孔加入10μl CCK8试剂，37℃避光反应2～3h后，450nm波长（参比630nm）检测每孔的吸光度值，根据公式计算细胞活力。
细胞活力=[（A实验孔-A空白孔）/（A对照孔-A空白孔）]×100%。
1.2.4不同溶剂对细胞活力影响实验 设空白组：只含培养基无细胞和药物、DMSO对照组（Negative）：1/1000（终浓度，下同）的DMSO、DMSO实验组（NXT）：1/1000的NXT-DMSO浸取液、EtOH对照组（Negative）：1/1000EtOH和EtOH实验组(NXT)：1/1000的NXT-EtOH浸取液，细胞培养箱中孵育3h后检测。不同稀释度的NXT对细胞活力影响实验 设DMSO对照组（0）：DMSO 1/1000，实验组：NXT浸取液作用细胞的稀释度分别为1/100，1/1000和1/10000，细胞培养箱中孵育3h后检测。
NXT不同作用时间对细胞活力影响实验 设DMSO对照组（0）：DMSO 1/1000，实验组：NXT浸取液作用细胞的稀释度为1/1000，分别作用1h、4h、8h和12h后检测。
1.3 统计学方法
计量资料以平均值±标准差表示，两组组间差异用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 NXT的不同溶剂浸取液的作用效果
CCK8法检测终浓度为1/1000的NXT浸取液对细胞活力的影响，结果显示(Fig 1）：与溶剂对照（Negative）组比较，NXT-DMSO浸取液可显著提高细胞活性至115.84%±3.22%（P=0.023）,而NXT-EtOH 浸取液对细胞活力的提高没有显著效果。
2.2 NXT提高THP-1细胞活力的剂量效应
将不同的终浓度的NXT-DMSO浸取液作用于细胞3小时后，可观察到(Fig 2）：和溶剂组（0组）相比较，1/10000稀释的NXT对细胞活力的提高作用有限，终浓度1/1000的药物提高细胞活力的效果最佳（P＜0.05）；继续增加药物浓度，可观察到细胞活性迅速降低，1/100稀释的药物组的细胞活力仅为48.19%±7.29%（P＜0.001）。
2.3 NXT提高THP-1细胞活力的时间效应
将终浓度为1/1000的NXT-DMSO浸取液作用细胞不同时间后，CCK8法检测细胞活力结果(Fig 3）：和溶剂组（0）相比较，NXT作用1h即可有效提高THP-1细胞活力（P＜0.01），作用4h效果最佳（P＜0.001），药效可持续到接近8h（P=0.058）。
Fig 3 NXT做用不同时间对THP-1细胞活力的提高作用比较（NXT组与对照（0）组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，n=3）
3.讨论
AS是一种由多因素共同作用引起的全身性疾病，动脉脂质沉积、平滑肌细胞和基质纤维化等因素促进动脉粥样斑块的形成。单核细胞受到CCR2/ MCP-1等多种趋化因子募集迁移，黏附到活化的血管内皮细胞，浸润到内膜下层，可转变成巨噬细胞。同时垂体前叶及外周单核巨噬细胞分泌的巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）在AS发生中也起到重要作用[4]。MIF可抑制巨噬细胞的游走，同时促进其局部浸润、活化及分泌炎症因子促进AS发生。巨噬细胞吞噬胆固醇等脂质后，转变成泡沫细胞，进一步促进AS斑块的形成[5]。
脑心通是“脑心同治”理论的代表性现代中药方剂，由黄芪66g，赤芍27g，丹参27g，当归27g，川芎27g，桃仁27g，红花13g，醋乳香13g，醋没药13g，鸡血藤20g，牛膝27g，桂枝20g，桑枝27g，地龙27g，全蝎13g，水蛭27g共16味中药组成[6]。临床上，脑心通具有益气活血、化瘀通络的作用，主要用于治疗冠心病、心绞痛、脑卒中等心脑血管疾病。近年随着国家对大力推进中医药继承与创新，脑心通的二次开发取得明显进展：其在治疗糖尿病慢性并发症、原发性高血压、高血脂、动脉粥样硬化以及腰椎间盘突出等症等方面都有较好的效果[7]。
本结果显示，脑心通可提高单核细胞系THP-1细胞的活力，对细胞有一定的保护作用，与刘倩等人的研究结果一致[8]。脑心通中的黄芪多糖能抑制THP-1细胞分泌TNF-α，减缓巨噬-泡沫细胞的形成[9]；川芎有扩张血管、抑制炎症反应的作用[10]；丹参有降脂、抗炎等多种作用[11]。这提示我们脑心通可能通过抑制炎症因子分泌，减轻炎症反应，进而对单核细胞的活力有一定的保护作用，这也与脑心通通过抗炎来减缓动脉粥样硬化的机制相一致。今后，我们将就脑心通的抗炎效应在AS发生中的作用展开深入研究。
我们进一步发现，脑心通在1h就能基本达到最佳药效，有效作用时间接近8h，显示出较其有效成分吸收迅速，有效时间窗较宽。结果表明，1/100稀释的脑心通浸取液对细胞活性表现出较强的抑制效果，这提示高浓度的脑心通对细胞有一定的毒副作用，与李伟霞等论文[7]显示脑心通可引起一定的恶心、呕吐等不良反应相一致。
综上所述，结果显示出脑心通对单核细胞系的保护作用及其作用规律，为进一步研究提供了基础。也提示，尽管传统方药脑心通已经在临床尚广泛应用，其药理机制、作用机理及新的用途尚需更深入的研究。
【参考文献】
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基金资助：步长制药上市产品科研课题（Wangyan2017-2020）；广东医科大学科研基金面上培育项目（M2017033，M2016028）；广东医科大学大学生创新创业训练计划项目（GDMU2018093）。
论文作者:邓子亮1,陈琼香1,郭洪胜1,郑采婷1,李婉怡1,
论文发表刊物:《医药前沿》2019年12期
论文发表时间:2019/6/14
标签：细胞论文; 作用论文; 活力论文; 浓度论文; 炎症论文; 步长论文; 广东论文; 《医药前沿》2019年12期论文;