（1河北省迁安市人民医院神经外科 河北 唐山 064400）
（2河北省迁安市人民医院重症医学科 河北 唐山 064400）
（3河北省迁安市人民医院检验科 河北 唐山 064400）
【摘 要】目的：研究醒脑开窍针法对急性一氧化碳中毒迟发性脑病大鼠模型脑海马区及额叶区神经细胞凋亡的影响。方法：选择取腹腔注射纯CO制备急性一氧化碳中毒的大鼠模型。在建模后用避暗实验测试大鼠学习记忆能力的变化。通过原位细胞凋亡结合阳性细胞记数的方法观察对照组、模型组及醒脑开窍针刺组大鼠海马区脑细胞凋亡情况。结果：①模型组与对照组比较，大鼠学习记忆明显障碍，各醒脑开窍组与模型组比较学习记忆能力明显改善(P<0.01)。②与模型组相比，各电针组海马区及额叶区凋亡细胞数显著降低(P<0.01)。结论：早期予“醒脑开窍针法”通过抑制神经细胞凋亡，保护脑神经元，可能预防急性一氧化碳中毒迟发性脑病的发生。
【关键词】醒脑开窍针法；一氧化碳中毒迟发性脑病；凋亡；
【中图分类号】R749.6+3 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）5-0027-02
1 材料与方法
1.1实验动物和试剂
雄性成年SD大鼠80只，体重240～280g。由河北联合大学实验动物中心提供。韩氏穴位神经刺激仪购自北京冀诺泰科技发展有限公司，ZH-500x大鼠避暗箱避暗穿梭实验箱购自安徽正华生物仪器设备有限公司。Tunel原位凋亡检测试剂盒购自北京鼎国生物技术公司，其余试剂为进口和国产分析纯。
1.2动物模型制备
将实验动物随机分为对照组(n=8)，模型组(n=8)及醒脑开窍针刺组0.5h（A组）、6h（B组）、12h（C组）、24h（D组）(n=8)。参照王耀宏等[2]的方法，本实验采取腹腔注射（peritoneal injection,ip）纯品CO气体制备大鼠染毒模型。采用预实验确定的100ml/kg剂量作为首次注射剂量，连续3次按首次剂量的半量（50ml/kg）做追加注射，间隔为4h，共4次注射CO气体。
1.3避暗实验
穿梭箱由明、暗两室组成，隔板上有一拱型小门(6×8cm)供大鼠出入。暗室底布直径0.3cm，间距1.2cm铜栅，暗室铜栅通以交流电(0.3mA，50Hz)，一旦大鼠进入暗室即遭电击。训练时将大鼠背向洞口放入明室中适应3min，然后通电同时将隔板打开，当大鼠四足全部进入暗室时，暗室底钢栅自动通电，大鼠受电击自动逃回明室，间隔30s后再进行下一轮训练，以此反复，至大鼠放入明箱后5分钟不进暗室为学习完成，造模前10d开始训练，造模后开始正式测试，避暗仪自动记录5 min内小鼠进入暗室的次数，即为错误次数和首次进入暗室的时间（避暗潜伏期）。每日测量3次直至动物被处死，取每日测量错误次数及潜伏期的平均数。
1.4 针刺方法
动物穴位的选取根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱”进行。醒脑开窍针刺组参照史慧妍等[3]文献方法：选取石学敏院士“醒脑开窍”针刺法主穴内关(双)、水沟。操作：先针刺双侧内关穴．直刺捻转提插泻法1min；继刺水沟穴，在鼻中隔下部向上斜刺．施雀啄手法刺激10次。醒脑开窍针刺组留针10min，并连接韩氏穴位神经刺激仪刺激，电针强度3mA，频率2Hz。A组在大鼠成功造模后即刻进行针刺1次，B、C组处死前10min再针刺1次．D组于术后12h及处死前10min再分别针刺1次。
1.5 标本制备
各组大鼠于造模后3d以3％的水合氯醛麻醉后，经心脏灌注生理盐水200ml后，再用10％的多聚甲醛溶液、1％戊二醛的混合液100～200ml灌注固定，整个灌注时间不超过6min。1h后取脑组织，每个标本在大脑额叶及海马区各切取1.0mm×1.0mm×1.0mm组织块,放入10％多聚甲醛溶液中固定4～6h,固定后的组织经脱水、浸蜡、包埋后制成石蜡块。于前囟后方进行连续冠状切片，片厚5μｍ，进行免疫组织化学染色。
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细胞凋亡染色：采用TUNEL细胞凋亡原位检测(BIOTIN标记POD法)，按照试剂盒说明书进行操作。按常规方法将石蜡切片进行脱蜡与水合，PBS漂洗两次，加入蛋白酶K工作液，37℃反应30min，PBS漂洗两次，浸入封闭液中室温封闭10min，PBS漂洗两次，样本周围用吸水纸吸干，每个样本加TdT酶反应液50ul，加盖玻片37℃避光湿润反应60min,PBS漂洗三次，样本周围用吸水纸吸干，滴加Streptavidin。HRP工作液50ul，加盖玻片37℃避光湿润反应30min，PBS漂洗三次，滴加DAB显色工作液50ul，室温显色反应10min，PBS漂洗3次，光学显微镜下观察、拍照。以胞核出现蓝黑色深染颗粒为阳性。
1.6 图像分析
每个脑组织样本选取5张切片进行图像分析。在光学显微镜（Olympus/BX41）下分别选取额叶及海马区域进行照相，每个区域选择4个不同视野（×200），各切片选择视野位置保持一致。将照片输入计算机后，采用ImageJ软件计算出每张照片中的阳性细胞数目。
1.7 统计学分析方法
实验数据建立EXCEL数据库，资料用SPSS17.0来处理。各组数据经过Shapiro-Wilk正态性检验和Bartlett方差齐次检验后，利用单因素方差分析（ANOVA）比较各组之间的差异。实验数据以均数±标准差( ±s)表示，其中两组间均数比较采用LSD法。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 实验结果
2.1 各组大鼠暗箱实验结果：
组别只数潜伏期错误次数
对照组8243.81±29.790.25±0.46
模型组8115.60±23.82 b3.78±1.64b
针刺组A8216.60±38.73bd1.15±0.32bd
针刺组B8208.48±30.93bde1.18±1.33bde
针刺组C8198.80±31.31bde1.35±1.05bde
针刺组D8183.38±26.45bde1.75±1.16bde
注：与对照组相比，aP<0.O5；bP<0.O1；与模型组相比cP<0.O5；dP<0.O1；与针刺组A相比eP<0.O5；fP<0.O1；
2.2额叶及海马区TUNEL染色结果
与对照组相比，模型组可见大量凋亡细胞；与模型组比较，各针刺组可见少量凋亡细胞，其中针刺组A额叶及海马区细胞凋亡细胞数最少。
Number of positive cells of apoptotic cell in cerebral cortex and brain hippocampus( ±s)
组别只数额叶区凋亡细胞数（个）海马区凋亡细胞数（个）
对照组80.61±0.780.60±0.89
模型组812.80±1.48 b10.89±1.84b
针刺组A81.83±0.35bd1.65±1.32bd
针刺组B83.42±1.41bde1.85±1.53bde
针刺组C84.25±1.45bde2.05±1.35bde
针刺组D859.3±6.2bde3.25±1.06bde
注：与对照组相比，aP<0.O5；bP<0.O1；与模型组相比cP<0.O5；dP<0.O1；与针刺组A相比eP<0.O5；fP<0.O1；
3 讨论
本实验采用腹腔间隔注射CO较好地模拟了大鼠急性重度一氧化碳中毒状态，且通过进行避暗实验得出：在造模后，模型组与空白组比较，模型组潜伏期及错误次数明显差于空白组，表明造模后大鼠存在明显的记忆功能明显减退，与临床所见DEACMP患者出现的近期记忆丧失，人格改变，智力迟钝等等临床表现相符合。表明造模建立成功。
参考文献：
[1]张春红,王舒,郑灏泳.针刺对局灶性脑缺血大鼠脑细胞凋亡的影响[J].针刺研究,2001,26(2):102.
[2]王耀宏,赵金垣等.急性一氧化碳中毒迟发性脑病的动物模型制备研究.中国职业医学.2004, 31(1): 5-10.
[3]史慧妍,王光安等.“醒脑开窍"针刺法对脑缺血大鼠脑皮质UCH-L1表达的影响.江苏中医药.2009,41(6): 65-66.
论文作者:张前进1,穆永茂（通讯作者）,李建民1,王,敏2,
论文发表刊物:《河南中医》2015年5月供稿
论文发表时间:2015/10/10
标签：针刺论文; 大鼠论文; 模型论文; 额叶论文; 氧化碳论文; 凋亡论文; 暗室论文; 《河南中医》2015年5月供稿论文;