泸州市人民医院 神内科 646000
摘要：目的 观察慢阻肺中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在骨骼肌蛋白分解代谢中的作用及其机制。 方法 随机选取30只健康小鼠，将其按双盲法平均分为对比组、实验组，每组15只小鼠，以单纯熏香烟法建立慢阻肺模型，后取小鼠伸趾长肌，将其分别置于有或无TNF-α的孵育液中，并采用实时定量PCR、Western blot检测泛素蛋白、mRNA水平。 结果 实验组泛素mRNA、蛋白水平明显高于对比组，P<0.05。结论 TNF-α对慢阻肺骨骼肌蛋白分解有促进效果。
关键词：骨骼肌；慢阻肺；蛋白分解；TNF-α
慢阻肺为临床常见呼吸系统疾病，该病会造成患者出现营养不良情况，进而影响机体呼吸肌结构、功能，使呼吸肌储备能力下降，出现通气功能障碍，造成患者呼吸系统局部防御能力降低，引发肺部感染，从而使呼吸衰竭加重，形成恶性循环。有研究表明疾病造成患者营养不良与骨骼肌消耗、萎缩有关，但临床对机体内骨骼肌蛋白因疾病造成大量分解代谢的机制尚未明确[1]。本次通过对小鼠骨骼肌泛素蛋白表达进行观察，来分析骨骼肌蛋白大量分解的原因。
1资料与方法
1．1一般资料
1.1.1实验试剂：羊抗小鼠 Ig G抗体（ICLLab），Kreb-Hesenleit孵育液，内容物为氯化钙 2.5mmol/L、葡萄糖 10 mmol/L、碳酸氢钠 25.3 mmol/L、氯化钠 118 mmol/L、硫酸镁 1.16 mmol/L、氯化钾 4.6 mmol/L、磷酸二氢钾 1.16mmol/L，重组小鼠TNF-α因子、抗泛素抗体(Sigma)，实时定量 PCR试剂盒 (Takara)，引物由赛百盛生物工程技术公司合成。
1.1.2实验物：合格健康实验小鼠30只（实验动物中心提供），将其按双盲法平均分为对比组、实验组，每组15只小鼠。
1.2方法
1.2.1模型建立：将30只小鼠每天放于10支香烟前，被动吸烟半小时以上，每周6次，连续让小鼠吸烟3个月，使其致慢阻肺，以小鼠出现淋巴细胞、浆细胞等炎症细胞浸润，气管黏膜下腺体增生肥大 以及肺泡管、支气管 、肺泡囊扩大，有小叶中央性肺气肿，提示慢阻肺建模成功。
1.2.2骨骼肌孵育：将建立慢阻肺模型的小鼠麻醉后，在无菌环境下分离伸趾长肌，将其放于有孵育液的烧瓶内并固定，在37℃恒温水浴中孵育30分钟，将肌肉表面残血清除，使其适应有氧环境。同时将对比组肌肉放于液氮中冷冻保存，将研究组肌肉转入含有10μg/LTNF-α因子、新鲜氧气的孵育液中孵育3小时，后放于液氮中冷冻保存。
1.2.3泛素蛋白水平检测：按试剂盒说明书提取骨骼肌蛋白，蛋白浓度以BCA法测定，取样品蛋白80 μg，在100℃下加热5分钟，以聚丙烯酰胺行凝胶电泳，湿转至 PVDF膜，以TBST溶液在室温环境下封闭 1小时。加入小鼠抗泛素抗体，在4℃恒温下过夜，以TBST洗膜后加入二抗辣根过氧化酶标记，室温孵育 2 小时，以TBST洗使用化学发光法显影 ，胶片图像采用凝胶成像分析系统分析，泛素蛋白相对表达量为泛素β-actin灰度值的比值。
1.2.4泛素mRNA水平检测：按照说明书步骤提取细胞总 RNA，RNA 浓度与纯度以核酸蛋白定量检测仪进行测定，同时参照 逆转录 PCR 试剂盒说明书进行逆转录反应实验。
1.3观察指标
观察两组小鼠骨骼肌泛素蛋白、mRNA水平表达情况。
1.4统计学分析
采用SPSS15.0对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（ ±S）表示，采用t检验，计数资料以％表示，采用卡方检验，所有统计学分析结果，以P<0.05为显著性标准。
2结果
2.1两组泛素蛋白水平表达情况 在相对分子质量8500处，可观察到明显蛋白表达条带，两组灰度分析结果显示实验组泛素蛋白表达明显高于对比组，P<0.05，具体见下图。
3讨论
近几年有研究表明慢阻肺患者常伴有营养不良症状，主要表现为骨骼肌消耗、萎缩，而骨骼肌细胞含有多种蛋白，在各种生理、生化过程中起着重要作用，若骨骼肌蛋白大量降解，会造成患者体质下降，进而对肺部造成损害，使患者病情若恶化[2]。因此了解慢阻肺骨骼肌蛋白分解情况，对临床疾病治疗有重要意义，本次临床通过小鼠建立疾病模型，观察对骨骼肌蛋白分解有有效的因子。
骨骼肌总体蛋白随内分泌、营养供给、酶活性变化而表现为不同程度降解，其中泛素 -蛋白酶体水平能在全身营养状态改变之前升高，是临床判断肌肉消耗的信号，同时其在细胞凋亡、DNA修复 、信号传递、蛋白质降解等过程中发挥重要作用[3]。近几年有学者研究发现TNF-α在骨骼肌蛋白分解中起着重要作用，其对患者骨骼肌重量有减轻效果，临床认为在慢阻肺疾病发作时肺气体交换容量减少，易产生低氧血症、引发组织、器官缺氧，从而使细胞因子释放大量释放，其中以TNF-α增加增高更为明显[4]。本次研究结果显示实验组泛素mRNA、蛋白水平明显高于对比组，P<0.05，结果提示TNF-α可能为骨骼肌蛋白高代谢的介导因素之一，通过激活泛素 -蛋白酶体，致使患者体质量降低、骨骼肌萎缩。
综上所述，TNF-α对慢阻肺骨骼肌蛋白分解有促进效果，临床在对疾病治疗时要及时阻断各种细胞因子、炎性介质释放。
参考文献：
[1]张悦,罗勇,徐卫国等.肿瘤坏死因子-α在慢阻肺大鼠骨骼肌蛋白分解代谢中的作用及其机制[J].上海交通大学学报（医学版）,2008,28(9):1126-1129.
[2]林桦,孙圣华,高健等.吲哚美辛对慢性阻塞性肺疾病大鼠肿瘤坏死因子α和骨骼肌蛋白质分解代谢的影响[J].中华内科杂志,2010,49(9):776-780.
[3]刘备战,孙圣华,林桦等.吲哚美辛对COPD营养不良模型大鼠呼吸肌蛋白质分解代谢的影响[J].中国现代医学杂志,2010,(18):2752-2755,2759.
[4]张悦,徐卫国,罗勇等.肿瘤坏死因子α对COPD大鼠骨骼肌蛋白酶体C2亚基表达的影响[J].中国呼吸与危重监护杂志,2009,8(5):436-440.
论文作者:袁云华
论文发表刊物:《健康世界》2017年第7期
论文发表时间:2017/6/21
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