杨晓玲1 曹成建2 王磊2 杨安宁3 杨程2 王艳华2 徐华1 姜怡邓1,3(通讯作者)
(1宁夏医科大学基础医学院 宁夏银川 750004)
(2宁夏医科大学检验学院 宁夏银川 750004)
(3宁夏医科大学心脑血管疾病基础研究重点实验室 宁夏银川 750004)
【摘要】目的 构建OX40L真核表达质粒并转染血管平滑肌细胞(VSMCs)，探讨其对VSMCs增殖的影响。方法 通过目的基因克隆，构建p-OX40L质粒并转染VSMCs。实验分3组：重组质粒 (p-OX40L) 转染组、空质粒转染组(pcDNA3.1(+)) 和空白对照组。将p-OX40L用脂质体2000转染入VSMCs，提取细胞的总RNA和蛋白检测OX40L的mRNA和蛋白表达，并用MTT法检测OX40L对VSMCs增殖的影响。结果 经PCR、双酶切和DNA序列分析证实OX40L正确插入pcDNA3.1(+)中，将p-OX40L转染VSMCs后，OX40L的mRNA、蛋白表达均高于空质粒组和空白对照组(P<0.01)，同时对VSMCs的细胞抑制率明显高于空质粒组和空白对照组。结论 成功构建OX40L真核表达质粒，该质粒可抑制VSMCs的增殖。
【关键词】OX40L 血管平滑肌细胞 增殖
【中图分类号】R73-3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）35-0091-03
AS是一个多因素的复杂病变，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs) 的增殖和向内膜下移行是影响AS发生发展的重要环节。OX40L是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)超家族成员，参与了免疫、炎症等过程，是AS的相关基因[1]。但OX40L是否通过影响VSMCs增殖参与AS的过程，目前尚不清楚。
本研究通过培养原代VSMCs，构建OX40L的真核表达载体，观察OX40L对VSMCs增殖作用，为进一步研究OX40L在AS中的作用提供基础。
1 材料方法
1.1 质粒、细胞及试剂
大肠杆菌E.coli DH5a、pcDNA3.1(+)质粒及THP-1细胞由本室保存。DNA聚合酶是Takara 公司产品，EcoRⅠ、HindⅢ内切酶购自Famentas公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自宝信生物，OX40L单克隆抗体为博奥森公司产品，其余试剂为国产分析纯。
1.2 人OX40L基因编码区的PCR扩增
提取THP-1细胞总RNA并逆转录成cDNA。根据GenBank 中报告的人OX40L CDS(登录号：NM_003326)，用Primer 5 软件设计引物。上游：5’- CCCAAGCTTATGTGCGTGGGGGCTCGGCG-3’，下游：5’- CGGAATTCTCAGATCTTGGCCAGGGTG-3’，在上下游5’端引入EcoRⅠ、HindⅢ限制性内切酶位点。以cDNA为模板，扩增OX40L基因。
1.3 p-OX40L的构建与鉴定
按照Omega 质粒提取说明书提取和纯化pcDNA3.1(+)空质粒，将pcDNA3.1(+)和OX40L基因分别用EcoRⅠ和HindⅢ内切酶进行双酶切，胶回收后按连接试剂盒说明书16℃连接4h，转化E.col i DH5a，经氨苄抗性筛选后挑取阳性重组子摇菌并提取质粒，进行PCR、双酶切和DNA 序列分析。
1.4 原代VSMCs培养
取剖宫产术后胎儿脐静脉（来自宁夏医科大学总医院妇产科），用D-Hank’s液冲洗后剥离外膜及结缔组织，纵向剪开血管，棉签轻轻拭去内膜。将血管条剪成1mm×1mm小块，均匀贴于培养甁底，置37?C、5%CO2孵箱用差速贴壁法行原代培养。约7-10天后，细胞从组织块边缘长出，待细胞达80%融合，用α-actin免疫组织化学鉴定，实验用3-6 代细胞。
1.5 p-OX40L转染入VSMCs
VSMCs消化离心后按1×104个/cm3密度接种到6孔板继续培养24h，当细胞生长至60%-70% 融合后换无血清培养液，按照LipoFec tamine2000说明书转染。分为空白对照组、空质粒转染组和p-OX40L转染组，无血清培养基培养6小时后，终止转染，继续培养24h，收集细胞并提取RNA和总蛋白，用real-time PCR和Western blot的方法检测各组细胞OX40L的mRNA和蛋白表达。
1.6 OX40L对VSMCs增殖的影响
取对数生长期的细胞，按1×104细胞/孔接种至96孔板中，用含10%FBS的DMEM 培养12 h。按1.5的方法将p-OX40L转染细胞，对照组转染等剂量的pcDNA3.1(+)空载体，PBS 作为阴性空白对照。转染48 h 后，每孔加入10μl MTT溶液，4 h后弃上清液，每孔加入DMSO 100μl，震荡3min，检测570 nm吸光值。
2 结果
2.1 目的基因的检测
细胞提取的总RNA经逆转录成cDNA后，PCR 获取的目的基因琼脂糖凝胶电泳显示，在约560bp处可见特异性条带(图1)，大小与预测一致。
图1 OX40L的PCR扩增
1, DNA Marker; 2, OX40L的PCR产物
2.2 p-OX40L的鉴定
筛选的p-OX40L PCR后，在560 bp 处有特异性扩增条带(图2)，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切该p-OX40L，分别在5900bp和560bp处有特异性酶切条带，分别与pcDNA3.1载体和目的基因OX40L大小相符，p-OX40L用HindⅢ单酶切后可见到一条约6460bp 左右的片段，大小与融合质粒的分子量一致，表明目的基因插入到表达载体中；将p-OX40L的PCR产物进行DNA序列分析，结果与GenBank 收录的OX40L CDS序列完全一致。
讨论
OX40L是由成熟的树突状细胞、巨噬细胞及VSMCs等表达的跨膜糖蛋白，属于TNF家族成员。研究显示[2, 3]，OX40/OX40L共刺激信号能够刺激巨噬细胞和树突状细胞分泌炎症因子，加剧AS的过程；低密度脂蛋白受体缺陷的AS小鼠模型中，阻断OX40L的作用可使斑块面积明显减少，OX40L基因多态性与中国汉族人群急性冠脉综合征有关，表明OX40L既是免疫、炎症的调控基因，又是AS的相关基因[4]。敲除编码OX40L基因的小鼠能显著减少高脂饮食诱导的AS；高/过表达OX40L的小鼠则易感动脉硬化性疾病，提示干预OX40L的表达可能会减轻AS的发生发展[5]，为此，本实验构建了p-OX40L真核质粒，经PCR、限制性双酶切和DNA序列分析均证实p-OX40L构建成功，为进一步研究OX40L的功能奠定基础。
VSMCs增殖是AS发生的一个关键环节，ApoE(-/-)小鼠斑块病变部位的巨噬细胞、平滑肌细胞中均有OX40L表达[4]，但OX40L是否通过影响VSMCs增殖影响AS的进程，目前尚不清楚。我们将构建成功的p-OX40L质粒转染入VSMCs，发现p-OX40L组OX40L的mRNA和蛋白表达显著高于空质粒组和空白对照组，表明我们成功将OX40L转染入VSMCs。为了证实OX40L对VSMCs增殖的作用，我们用MTT法检测了各组细胞的增殖率，结果显示pcDNA3.1(+)-OX40L质粒转染细胞后，细胞的增殖明显受到抑制，表明OX40L能够抑制VSMCs的增殖，预示着OX40L可能是AS治疗的一个新靶点，但OX40L抑制VSMCs增殖的机制尚不清楚，需进一步研究证实。
参考文献
[1] Yan, J., et al., Upregulation of OX40-OX40 ligand system on T lymphocytes in patients with acute coronary syndromes. J Cardiovasc Pharmacol, 2009. 54(5): 451-5.
[2] Shi, J.Z., et al., OX40 ligand levels and high-sensitivity C-reactive protein levels in blood from local coronary plaque and the femoral artery in patients with acute coronary syndrome or stable angina. J Int Med Res, 2011. 39(4): 1275-83.
[3] Foks, A.C., et al., Interruption of the OX40-OX40 ligand pathway in LDL receptor-deficient mice causes regression of atherosclerosis. J Immunol, 2013. 191(9): 4573-80.
[4] Smeets, E., S. Meiler, and E. Lutgens, Lymphocytic tumor necrosis factor receptor superfamily co-stimulatory molecules in the pathogenesis of atherosclerosis. Curr Opin Lipidol, 2013. 24(6): 518-24.
[5] Wang, X., et al., Positional identification of TNFSF4, encoding OX40 ligand, as a gene that influences atherosclerosis susceptibility. Nat Genet, 2005. 37(4): 365-72.
基金项目：宁夏自然科学基金（NZ12185）；宁夏医科大学校级课题（XM2012012）
论文作者:杨晓玲1,曹成建2,王磊2,杨安宁3,杨程2,王艳
论文发表刊物:《医药前沿》2013年第35期供稿
论文发表时间:2014-3-6
标签：质粒论文; 转染论文; 细胞论文; 基因论文; 目的论文; 宁夏论文; 平滑肌论文; 《医药前沿》2013年第35期供稿论文;