云南省玉溪市食品药品检验所 云南玉溪 653100
摘要：控制好菌种的培养、传代和保存方法就控制好菌种的质量。
关键词：菌种；培养；传代；保存
微生物具有生命活力，随着菌种培养和保存时间的延长或菌种的多次转接传代，菌种本身所具有的优良的遗传性状可能得到延续，也可能发生变异。因此，在保存过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，菌种保存方法都是根据这三个因素而设计的。控制好菌种的培养、传代和保存方法就控制好菌种的质量。故应选用合适的培养基，控制菌种培养的条件，使其优良性状得到延续；控制传代次数从而防止菌种的退化；控制保存的条件，使细胞处于休眠状态，采用合适的保存方法，以延长菌种保存的时间。
1.实验准备
1.1仪器设备
BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）、DW-86L486型海尔超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）、BCD-215DF型海尔冰箱（青岛海尔股份有限公司）、HRLM-80型海尔立式蒸汽灭菌器（青岛海尔特种电器有限公司）、YQX-Ⅱ型厌氧培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）、SPX-150型生化培养箱（扬州慧科电子有限公司）。
1.2菌种
短小芽孢杆菌[CMCC（B）63202]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、藤黄微球菌[CMCC（B）28001]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门氏菌[CMCC（B）50094]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、生孢梭菌[CMCC（B）64941]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、志贺氏菌[CMCC（B）51572]、乙型溶血性链球菌[CMCC（B）32210]、单核细胞增生李斯特菌[CMCC（B）54002]、小肠结肠炎耶耳森氏菌[CMCC（B）52204]、蜡样芽胞杆菌[CMCC（B）63303]、阪崎肠杆菌ATCC 29544、副溶血性弧菌ATCC 17802、产气荚膜梭菌ATCC 13124、粪链球菌ATCC 29212大肠埃希氏菌O157 CICC 10907，均为冻干质控菌种。
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1.3培养基
脑心浸液（批号：140211）、、营养琼脂培养基（批号：131210）、血平板（批号：F0789Y广东环凯微生物科技有限公司）、胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂（批号：140402）、疱肉牛肉粒肉汤（批号：140722）、蛋白胨水（批号：140820）、沙氏液体培养基（批号：140702）、马铃薯葡萄糖琼脂（批号：140310）以上培养基为北京陆桥技术有限责任公司生产。
2.菌种的培养、传代和保存
菌种的复苏和传代在生物安全柜及无菌条件下操作。打开菌种西林瓶胶塞，加入0.3ml液体培养基后，用无菌滴管反复吹吸溶解为悬液，移至斜面、平板或液体培养基后，连同剩余菌悬液的西林瓶一起培养。次日观察菌种的生长情况，如未生长，应继续培养24小时，或取培养之后的菌悬液再次接种培养基，培养24小时.复苏后的菌种在传1-2代后使用，使用代数不超过5代，5代后应销毁。
2.1 方法一
用无菌吸管往金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、大肠埃希氏菌O157、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶耳森氏菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、藤黄微球菌、蜡样芽胞杆菌、乙型副伤寒沙门氏菌西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于营养琼脂斜面上划线，36℃培养24-48小时。斜面放于4℃冰箱保存，每个月转接一次，代数以此类推。
2.2 方法二
用无菌吸管往铜绿假单胞菌西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于营养琼脂斜面上划线，36℃培养24-48小时。斜面放于25℃保存，每个月转接一次，代数以此类推。传代时，铜绿假单胞菌的绿色若变淡或无绿色，可用溴化十六烷基三甲铵琼脂替换营养琼脂。
2.3方法三
用无菌吸管往粪链球菌、乙型溶血性链球菌西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于血平板后涂布，36℃培养24-48小时。血平板用封口膜密封，放于4℃冰箱保存，每半个月转接一次，代数以此类推。
2.4方法四
用无菌吸管往单核细胞增生李斯特菌西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂斜面上，36℃培养24-48小时。斜面放于4℃冰箱保存，每个月转接一次，代数以此类推。
2.5方法五
用无菌吸管往生孢梭菌、产气荚膜梭菌西林瓶冻干菌粉中加入脑心浸液培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于疱肉牛肉粒肉汤加液体石蜡1cm，36℃培养48-72小时。肉汤放于4℃冰箱保存，每半个月转接一次，代数以此类推。
2.6方法六
用无菌吸管往副溶血性弧菌西林瓶冻干菌粉中加入3％氯化钠碱性蛋白胨水，充分悬浮后放置于36℃下复苏8-12小时。取适量的菌悬液于3％氯化钠营养琼脂斜面上，36℃培养24-48小时。斜面放于25℃保存，每个月转接一次，代数以此类推。
2.7方法七
用无菌吸管往白色念珠菌、黑曲霉西林瓶冻干菌粉中加入沙氏液体培养基，充分悬浮后取适量的菌悬液于马铃薯葡萄糖琼脂斜面，25℃培养2-5天。斜面放于4℃保存，每两个月转接一次，代数以此类推。
3.菌种的长时间保存
菌种使用代数不超过5代。为降低成本，减少传代，能多次使用菌种，可将2代以后的新鲜纯菌种接种到菌种保存管内，置-72℃超低温冰箱进行保存。需要时，将菌种保存管内的玻璃珠取出，在专属的固体培养基上滚动，培养基置合适的条件培养。每1菌种保存管可进行25次菌种的复苏。该方法给菌种的使用带来了方便、高效、快捷，能长时间多次地保存菌种。
参考文献：
[1] 吴茂红，吴时耕.菌种的保存方法介绍[J].江西医学检验.2004（06）.
[2] 王娅，金志雄，裴德翠，冯桂香.几种简易的菌种保存方法[J].青岛医药卫生.2009（06）.
[3] 王美惠，郑剑玲.介绍一种菌种保存的简易方法[J].卫生职业教育.2010（01）.
论文作者:刘庭琨1,普茺蔚2
论文发表刊物:《健康世界》2016年第15期
论文发表时间:2016/9/5
标签：菌种论文; 培养基论文; 西林论文; 斜面论文; 琼脂论文; 方法论文; 代数论文; 《健康世界》2016年第15期论文;