岳阳市一人民医院检验科 湖南岳阳 414000
【摘 要】目的：探讨实时PCR法在烟曲霉荧光探针中的临床应用价值。方法：选取于2017年11月至2018年11月期间来我院进行体检的120例免疫能力低下患者的132份痰样本作为研究对象，同时选取经临床确诊为侵袭性真菌病的35例患者98份血浆标本进行验证。以烟曲霉基因组内特有序列作为靶位，设计引物及探针，并在此基础上建立PCR反应体系，验证痰标本及血浆标本的检测性能。结果：经荧光探针实时PCR法中线性检测范围在102-108copy/mL之间，灵敏度及特异性高，且共检出烟曲霉阳性4例，其他128例标本并未出现扩增，与通用PCR发检测结果具有一致性，差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：实时荧光定量PCR在对烟曲霉诊断中具有较高灵敏度及特异性，且有助于早期诊断。
【关键词】实时PCR法；烟曲霉荧光探针；临床价值
Abstract：Objective：To investigate the clinical application value of real-time PCR in the fluorescent probe of Aspergillus fumigatus. METHODS：A total of 132 sputum samples from 120 patients with low immunity who were admitted to our hospital from November 2017 to November 2018 were selected as subjects. 35 patients with clinically diagnosed invasive fungal diseases were selected. A plasma sample was verified. Primers and probes were designed with specific sequences in the Aspergillus fumigatus genome，and a PCR reaction system was established to verify the detection performance of sputum samples and plasma samples. RESULTS：The linear detection range of fluorescent probe real-time PCR was between 102-108 copy/mL. The sensitivity and specificity were high，and 4 cases were positive for Aspergillus fumigatus. The other 128 specimens did not appear amplified. The results of PCR detection were consistent，and the difference was not statistically significant（P>0.05）. Conclusion：Real-time PCR is highly sensitive and specific in the diagnosis of Aspergillus fumigatus and contributes to early diagnosis.
Key words：real-time PCR；Aspergillus fumigatus fluorescent probe；clinical value
近年来以AIDS、白血病、器官或骨髓移植等免疫缺陷患病率的逐渐增加，使得因曲霉所致的条件性感染发病率呈现逐年上升的趋势。在医院真菌感染中，中性粒细胞减少患者的侵袭性曲霉病已经成为当前仅次于念珠菌病的深部真菌病，且因曲霉病在临床上的症状及体征缺乏特异度及灵敏度，因而传统实验室检查方式难以对曲霉病的实际发病率进行准确估计[1]。同时，由于曲霉病在临床上具有播散速度快等特点，所以尽管对患者予以了有效的抗真菌治疗也难以有效控制病死率的发生。随着近年来分子生物学的发展，侵袭性真菌病而对诊断也逐渐得到应用，为提高该种诊断方式的特异性，建立探针法实时PCR监测方式取得较好临床应用价值[2]。鉴于此，选取于2017年11月-2018年11月期间来我院进行体检的120例免疫能力低下患者的132份痰样本作为研究对象，同时选取经临床确诊为侵袭性真菌病的35例患者98份血浆标本进行验证，通过探针法实时PCR监测方式以验证痰标本及血浆标本的检测性能。现将研究结果报告如下：
1 资料与方法
1.1一般资料
选取于2017年11月-2018年11月期间来我院进行体检的120例免疫能力低下患者的132份痰样本作为研究对象，同时选取经临床确诊为侵袭性真菌病的35例患者98份血浆标本进行验证。
1.2试剂与仪器
溶壁酶、核糖核酸酶A、蛋白酶、酵母基因组DNA抽提试剂盒、ExTaq、PCR荧光定量测定仪、大和基因扩增仪、数码凝胶图像分析系统。
1.3 痰标本处理方式
直接抽提132份痰标本基因组的DNA，同时将配对的痰标本接种至科玛嘉平板上，于37℃的恒温箱内进行1-7d的培养，每日对培养结果进行观察。若出现可疑菌落或者真菌的生长，则采用无菌棉拭子对具有代表性的菌落予以挑取，然后将其转移至含有无菌生理盐水的1.5mL离心管中进行保存[3]。
1.4 实时PCR检测法
提取痰标本基因组DNA并予以PCR扩增，经电泳方式鉴定扩增产物，例如对于靶条带需予以测序分析，并将测序的结果于数据库中进行对比，若并未出现靶条带，则表明结果为阴性。除此之外，对于每份痰标本均需要进行内对照扩增，旨在将假阴性结果予以排除。荧光探针序列为5’FAM-GCA AGG CGA TTT ATC TCA CCA CT-3’TARMA，PCR扩增条件为设置如下：50℃，2min；94℃预变性3min；94℃变性10s，55℃退火延伸45s，上述均共进行40个循环。同时构建含靶片段的PMD19-T质粒重组体，制备梯度浓度标本，对该炎症方式的灵敏度及特异性进行验证[4]。132份痰样本与98份血浆标本DNA均采用烟曲霉实时PCR法进行检测，对其临床应用价值予以初步验证，将其结果与通用PCR法进行比较。然后将检验为阳性的标本送至测序验证，旨在将因抑制物所致的假阴性予以排除，最后将所有标本进入GAPDH予以基因检测。
1.5 统计学分析
本次研究所得数据均经SPSS20.0软件予以统计学计算。计量指标以（%）形式展开，检验；计数指标以（）形式展开，t值检验。P<0.05表明数据比较具有统计学意义。
2 结果
2.1 观察荧光探针实时PCR法检测性能
该检测方式具有良好的PCR扩增曲线，相关系数接近于1，表明具有良好相关性。线性检测范围在102-108copy/mL之间，表明该检测具有较高的灵敏度，且在对非烟曲霉基因DNA进行扩增时，并未出现非特异性扩增，表明具有较好特异性。
2.2 比较通用PCR法与荧光探针实时PCR法真菌检出率
经荧光探针实时PCR法中共检出烟曲霉阳性4例，其他128例标本并未出现扩增，与通用PCR发检测结果具有一致性，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。
表1 通用PCR法与荧光探针实时PCR法真菌检出率比较[n，（%）]
3 讨论
真菌多为条件致病菌，一般情况下对于具有正常免疫力的人群而言并不会致病，但当机体处于免疫力下降时，便会导致侵袭性真菌病的发生。本文建立了针对烟曲霉探针实时PCR检测方法，与传统荧光染料法相比其特异度更高，能够提高临床诊断价值[5]。与通用PCR法相比，实时PCR法具有相同的特异性与敏感度，但实时PCR法定量更为准确，能够对临床区分真菌感染以及定植提供相关依据，确保疾病的及早发现与治疗。除此之外，经实时PCR检测后，扩增完成后在分析结果时无需开盖操作，因而能够显著地降低实验室扩增产物污染的发生，但缺陷在于仅仅只能用于烟曲霉菌的检测[6]。在本次研究中，经荧光探针实时PCR法中线性检测范围在102-108copy/mL之间，灵敏度及特异性高，且共检出烟曲霉阳性4例，其他128例标本并未出现扩增，与通用PCR发检测结果具有一致性，差异无统计学意义（P＞0.05）。说明荧光探针实时PCR法在对于临床痰标本及血浆标本检测中具有较高效果，具有较高灵敏度及特异性，但未来仍需进行大样本对结论进行验证。
综上所述，实时荧光定量PCR在对烟曲霉诊断中具有较高灵敏度及特异性，且有助于早期诊断。值得大量临床推广。
参考文献：
[1]邢志芳，曹国君，赵缜，等.烟曲霉荧光探针实时PCR法的临床应用价值研究[J].国际检验医学杂志，2016，37（24）：3391-3392.
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[3]童建波，杜蕾蕾，曾荣，等.烟曲霉对人急性单核细胞白血病细胞系产生肿瘤坏死因子α、活化信号分子p38丝裂原活化蛋白激酶的影响[J].中华皮肤科杂志，2018，51（9）：653-657.
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[6]童建波，杜蕾蕾，曾荣，等.烟曲霉对人THP-1细胞中IL-6分泌和信号分子IκBɑ活化的影响[J].中国麻风皮肤病杂志，2018，34（5）：261-264.
论文作者:张欣
论文发表刊物:《中国结合医学杂志》2019年3期
论文发表时间:2019/5/15
标签：曲霉论文; 标本论文; 探针论文; 实时论文; 荧光论文; 特异性论文; 灵敏度论文; 《中国结合医学杂志》2019年3期论文;