段德义[1]1997年在《DCS细胞肿瘤相关膜蛋白的初步研究》文中指出恶性肿瘤的两个主要特征是其细胞无节制性生长和向其邻近组织侵袭或远隔部位的转移。一百多种肿瘤相关基因参与肿瘤的起源和发展，它们的表达产物多种多样，其中有些位于细胞膜。肿瘤相关细胞膜蛋白单克隆抗体在肿瘤诊断、治疗以及探索肿瘤相关基因等研究领域中有重要意义。 用本室新近建立的小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞系10~7细胞腹腔注射免疫大鼠，取其脾与大鼠骨髓瘤细胞IR983F融合，制备了与小鼠正常组织未见明显交叉反应的单抗983D4，其亚类类为lgG2a，该抗体还与某些小鼠肿瘤MFC，LA795，B22等有交叉反应，其抗原分子量约38kD，28kD。用983D4单抗处理DCS细胞，观察DCS细胞体外生长速度、软琼脂克隆形成、运动能力、水解酶活性，粘附性，侵袭性和和体内转移率等生物学行为，结果发现：983D4能轻度抑制DCS生长和软琼脂克隆形成，但对DCS自身粘附及对FN、LN基质粘附、运动、水解、侵袭转移能力等方面均未发现明显作用，为了进一步认识该抗原的性质，首先构建DCS细胞cDNA表达文库，然后用983D4进行筛选。 用异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提一步法提取DCS细胞总RNA 1.13mg，甲醛变性胶电泳分析其质量。利用oligo-dT纤维素层析柱分离poly(A)mRNA 8.4ug，逆转录酶作用下合成cDNA第一链，E coli DNA polymerase I催化合成cDNA第二链，α~(32)p掺入碱性凝胶电泳分析cDNA 片段大小，分布范围集中于400-3000bp。SephacrylS400离心柱除去小分子量cDNA片段后，双链DNA与E coR1 adaptor相连，磷酸化adaptor，再与EcoRl酶切的脱磷酸化的λgt11 arms相连，E coli extract包装重组DNA即为cDNA表达文库。文库总滴度1.11×10~6pfu，兰斑数10％。在1.5％LB琼脂平板上行文库的铺平板培养，硝酸纤维素滤膜
杨振丽[2]2009年在《VAP-33蛋白在DC及DCS细胞中的表达及功能研究》文中研究表明我们实验室以前建立的小鼠树突状细胞肉瘤(DCS)细胞系,经过不同时期不同方法(形态、免疫组化、表达基因组芯片)的不断验证[李存玺、zhou shixin],确立了其为DC细胞的起源。利用其不同转移能力的克隆找到了在高转移亚系中高表达的一系列基因。其中包含VAP-33。我们还利用DCS细胞制备了兔多抗,经纯化后得到了DCS细胞特异的抗体。90年代我们实验室用自制的DCS多克隆抗体,通过Western Blotting方法鉴定出该抗体针对DCS细胞全蛋白在分子量为32kDa左右处有一特异性条带,并且电镜结果显示该蛋白表达在细胞膜上;本论文进一步提取DCS细胞膜蛋白,利用该抗体进行IP,从沉淀蛋白所跑SDS-PAGE胶上,切取32kDa左右的蛋白条带进行质谱分析,所得肽段蛋白序列输入NCBI Blast,与其序列匹配度最高的为VAP-33。由此,深入开展了VAP-33在DC及DCS细胞中的表达和功能研究,以期明确其在肿瘤侵袭转移中的作用。本论文分为两部分。第一部分中,重点观察VAP-33在DCS细胞及DC细胞中的表达及功能。首先,我们用免疫组化、Western blotting等方法对DC细胞及DCS细胞中VAP-33的表达进行了研究。最初我们提取DCS细胞的膜蛋白采用质谱技术检测到DCS细胞膜蛋白中有VAP-33的表达;又利用免疫组化的方法再次证实DC细胞及DCS细胞表达VAP-33;Western blotting结果显示VAP-33在DCS细胞不同肺转移能力的克隆细胞株(DD1＞DCS＞DG6)中也有表达,并随肺转移能力的不同而不同,在肺高转移的DD1细胞中VAP-33表达最高。其次,为了进一步验证VAP-33在肿瘤侵袭转移及肿瘤细胞体外成瘤能力中的作用,我们通过Tanswell、克隆形成率等方法,研究经VAP-33单抗封闭48h后的DCS细胞在穿膜能力、克隆形成能力方面的变化。Tanswell方法观察到,VAP-33抗体封闭后的穿膜细胞较空白组及同型对照组都少(p＜0.01),说明VAP-33与细胞侵袭转移能力有关系;克隆形成率检测该蛋白与细胞体外成瘤能力没有明显关系(p＞0.05),说明VAP-33与细胞的增殖无关。由于DCS细胞来源于DC细胞,而DC细胞又是重要的抗原递呈细胞,因此,除了上述对VAP-33与肿瘤侵袭转移关系的研究,我们还对大分子抗原刺激后的DCS细胞在形态、功能改变等方面进行了研究,其中特别关注了VAP-33的表达变化。倒置显微镜下观察到随抗原剂量的增加,细胞分支增多变长,细胞更铺展,趋向成熟DC的形态;Western blotting结果显示VAP-33的表达随抗原量的增加及抗原刺激时间的延长而降低;共聚焦显微镜观察到VAP-33在细胞胞浆中的表达更加分散、均匀。我们预期的结果是随抗原量的增加或抗原刺激时间的延长,VAP-33的表达会随之增加或者发生分布上的变化,与实际结果存在偏差。有研究显示,在胞浆中VAP-33与再循环内体(recycling endosomes,REs)的标志分子TfR(transferrinreceptor)有共定位,因此我们认为,DCS细胞在受到抗原刺激时,VAP-33通过再循环内体从核周的质膜不断地循环往复协助处理抗原。由此我们推断在该过程中VAP-33被消耗,或者消耗大于合成的速度,VAP-33有可能参与抗原处理。许多文献中报道了VAP-33参与GLUT-4囊泡转运,因此,我们也对两者在肿瘤细胞中的关系进行了初步探讨。血清饥饿后的DCS细胞经胰岛素刺激后,细胞膜中VAP-33及GLUT-4的分布发生变化。Western blotting检测结果显示两种蛋白量的变化不明显,而共聚焦显微镜结果显示细胞膜上VAP-33和GLUT-4共表达增加。这一结果需进一步利用强迫过表达VAP-33的实验体系进行重复验证。因此我们开展了下一部分的工作。第二部分中,为了更好的研究VAP-33在肿瘤侵袭转移中的作用,我们构建了表达VAP-33 CFP融合蛋白的表达载体。根据Gene Bank中VAP-33的mRNA序列(从起始密码子到终止密码子的前一个密码子,长726bp)设计一对引物,在正反引物的5'端分别加入XhoⅠ、EcoRⅠ酶切位点及保护碱基。通过RT-PCR技术从DCS细胞的cDNA中扩增VAP-33,利用基因重组技术,将VAP-33的目的基因克隆到pECFP-N1载体的XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点之间,构建重组载体,经测序该载体构建成功。为后续实验奠定了基础。
童志霞[3]2018年在《布鲁氏菌主要外膜蛋白对树突状细胞成熟度及抗原递呈的影响》文中认为目的:布鲁氏菌病是目前全世界范围内最常见的人畜共患病之一,严重危害我国畜牧业生产的发展。树突状细胞(DCs)是目前研究认为最有效的专职抗原递呈细胞(APC),在病原菌和宿主免疫的相互作用中发挥重要作用。本研究旨在探讨布鲁氏菌主要外膜蛋白如何调节DCs的成熟度,影响抗原递呈效率以及活化初始T淋巴细胞的能力,进而影响宿主针对布鲁氏菌的先天性免疫和获得性免疫,为合理设计针对布鲁氏菌的疫苗以及更好地理解布鲁氏菌致病机制和宿主的保护性免疫应答机制奠定理论基础。方法:(1)布鲁氏菌主要外膜蛋白刺激小鼠BMDCs,采用流式细胞术分析小鼠BMDCs细胞表面共刺激分子及MHC分子的表达情况,运用ELISA方法检测细胞因子的分泌情况;运用qRT-PCR技术检测TLRs mRNA的转录水平,同种淋巴细胞混合反应(MLRs)测定外膜蛋白刺激对小鼠BMDCs激活同种异体小鼠脾脏T细胞增殖的能力。(2)通过布鲁氏菌外膜蛋白基因缺失株和疫苗株RB51,亲本株2308分别侵染小鼠BMDCs,运用流式细胞仪检测小鼠树突状细胞表面分子和MHC分子的表达情况,ELISA技术检测相关细胞因子的分泌情况,qRT-PCR技术检测布鲁氏菌侵染的BMDCs中TLRs mRNA的转录水平,同种淋巴细胞混合反应(MLRs)测定布鲁氏菌侵染对小鼠BMDCs激活同种异体小鼠脾脏T细胞增殖的能力。(3)通过用布鲁氏菌主要外膜蛋白缺失株及布鲁氏菌亲本株2308、布鲁氏菌疫苗株RB51分别侵染小鼠BMDCs,CFU计数检测胞内生存和复制情况,经过流式细胞仪检测布鲁氏菌外膜蛋白对小鼠BMDCs凋亡的影响。结果:(1)流式细胞术检测结果显示,外膜蛋白(OMP10、OMP19和BP26)刺激后BMDCs表面共刺激分子和MHC分子的表达均显著增加,而OMP25和OMP31刺激BMDCs后显著降低了部分表面分子的表达;ELISA结果显示,外膜蛋白(OMP10、OMP19和BP26)刺激组BMDCs培养上清液中IL-12,IL-6、INF-γ、TNF-α的分泌显著增加,IL-10和IL-4的分泌显著减少,OMP25和OMP31刺激后的结果与之相反。同时,qRT-PCR结果确定,TLRs在各组处理的BMDCs中均有不同程度的表达;MLRs测定结果显示,外膜蛋白(OMP10、OMP19和BP26)刺激BMDCs后促进了同种异体小鼠脾脏T细胞的增殖,而OMP25、OMP31刺激抑制了T细胞的增殖。(2)流式细胞仪检测发现,经外膜蛋白缺失株和疫苗株RB51侵染后BMDCs细胞表面分子表达显著升高,亲本株2308侵染后BMDCs细胞表面分子的表达显著降低;ELISA结果表明,缺失株和疫苗株RB51侵染小鼠BMDCs,相较于对照组IL-12,IL-6、INF-γ、TNF-α的分泌显著增加,IL-10和IL-4的分泌显著减少,亲本株2308侵染后BMDCs细胞因子IL-12,IL-6、INF-γ、TNF-α的分泌量显著减少,IL-10和IL-4的分泌量显著增加;qRT-PCR结果显示,在各组处理的BMDCs中TLRs均有不同程度的变化;MLRs测定结果显示,外膜蛋白缺失株和疫苗株RB51侵染BMDCs后显著增加了同种异体小鼠脾脏T细胞的增殖效率,而亲本株2308侵染的BMDCs抑制了T淋巴细胞的增殖。(3)CFU结果显示,缺失株组侵染的BMDCs中CFU数量在各时间点呈下降趋势,疫苗株RB51组在侵染后6h CFU数量显著上升,随后呈下降趋势,在侵染后48h,有微弱的回升。亲本株2308侵染的BMDCs在侵染后6h CFU数量显著降低,随后呈逐渐上升趋势,感染后48h呈下降趋势。流式细胞仪检测凋亡的结果发现,与PBS组相比,布鲁氏菌侵染的各组BMDCs都出现了凋亡,而且亲本株2308诱导更高水平的细胞凋亡。结论:本课题研究结果表明,布鲁氏菌外膜蛋白(OMP10、OMP19、BP26)和外膜蛋白缺失株及疫苗株可诱导小鼠BMDC成熟及抗原提呈作用,并且诱导较低水平的细胞凋亡,有利于宿主细胞识别抗原,从而清除病原菌。TLRs介导的信号通路参与了布鲁氏菌外膜蛋白诱导的BMDCs的成熟及抗原提呈作用。为合理设计针对布鲁氏菌的疫苗以及更好地理解布鲁氏菌发病机制和宿主体内的保护性免疫应答机制奠定基础。
任亚娜[4]2007年在《树突状细胞分泌的exosomes的生物学特性及抗肿瘤作用的初步研究》文中指出树突状细胞(DCs)分泌的exosomes是来源于内吞途径的小囊泡，表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子和共刺激分子等，能够活化T细胞产生免疫应答，在抗肿瘤免疫治疗中有着诱人的前景。为了建立DCs分泌的exosomes(Dex)的制备方法，分析其生物学特性和在抗肿瘤免疫中的功能，本研究从正常人外周血单个核细胞中诱导未成熟DCs(imDC)并使其负载K562肿瘤细胞的抗原，然后用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导DCs成熟(mDCs)，通过多次超速离心结合膜超滤的方法提取imDCs和mDCs分泌的exosomes。检测exosomes的粒径并通过电子显微镜分析exosomes的形态，Western blot法检测exosomes的表面分子。比较mDCs和imDCs分泌的exosomes引起的针对K562抗原特异性T细胞的增殖、CD69的上调、细胞因子IFN-γ的分泌及对肿瘤细胞杀伤能力。实验结果显示，制备的exosomes为碟状小囊泡，平均粒径为72.3nm，表达CD80、CD86、HLA-DR、FasL、CD54和MFG-E8(milk-fat globule-epidermal growth factor-factorⅧ)。与imDCs相比，mDCs分泌的exosomes的CD80表达较高而MFG-E8的表达较低，并且在体外mDCs分泌的exosomes能够更显著地引起特异性T细胞的增殖和免疫应答。体外在mDC存在的情况下，20μg／ml mDex可有效活化T细胞，T细胞增殖后吸光度值上升到0.5±0.01，激活T细胞的CD69上调并且有(13.40％±5.76)％T细胞扩增，(22.76±2.37)％的T细胞产生细胞因子IFN-γ，在效靶比为10∶1时对肿瘤细胞的杀伤率为(21.3±8.55)％。同时，为了进一步研究exosomes作用的分子机制，为exosomes肿瘤疫苗的改进和应用提供理论基础，我们利用制备好的exosomes研究其在DCs有无或DCs成熟状态不同的情况下，刺激T细胞增殖的能力，并且比较了异源exosomes与同源exosomes功能的差别；通过阻断实验，阻断imDCs分泌的exosomes上一些分子(CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83)后，检测对exosomes免疫学功能的影响；采用共聚焦显微镜检测DCs对exosomes的吞噬作用，流式细胞仪检测阻断了exosomes表面分子对DCs吞噬exosomes作用的影响。结果发现：在无DCs存在或imDCs存在的情况下未成熟DCs分泌的exosomes(imDex)和成熟DCs分泌的exosomes(mDex)均不能有效地激活T细胞；不同促成熟因子(LPS、TNF-α、CpG、CD40L)诱导成熟的DCs分泌exosomes的数量无明显差别而功能上有显著差异；异源Dex在功能方面与同源Dex无差别，两者都是在mDCs辅助下才能刺激T细胞增殖；Dex表面分子CD11a、CD11b、CD11c、CD54、MFG-E8及CD83与其功能有关，阻断这些分子均能不同程度地抑制Dex对T细胞刺激的作用；通过共聚焦显微镜和流式细胞仪检测出CD54在Dex靶向及被DCs吞噬的过程中起很重要的作用。
赵军[5]2009年在《同种脑微血管内皮细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞免疫效应研究》文中研究表明目前,肺癌的发病率和死亡率在世界范围内均居癌症之首。20世纪90年代与70年代相比,我国肺癌的死亡率上升了111.85%。肺癌的治疗仍以手术切除为主,辅以化疗和放疗,但转移和死亡率仍居高不下,这也是肺癌治疗失败的原因,因此,研究新的肺癌治疗方法显得非常必要。随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的不断发展,以免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗受到了人们的高度重视,已经成为继手术、化疗和放疗以后的第四种肿瘤治疗模式,它主要通过调动或增强机体内部固有的抗肿瘤能力来抑制肿瘤生长,可以避免当前肿瘤治疗模式的严重不足之处,展示了良好的临床应用前景。肺癌的靶向治疗是生物治疗的一种模式,目前已有研制成功和上市的肺癌的靶向治疗药物,大多是一些单克隆抗体制剂,包括Iressa、Tarceva、Veenat、Sutent和Sorafenib Nexavar等,基本上也都是靶向肿瘤血管上的特异性蛋白分子。虽然这些药物在一定程度上抑制了肺癌的生长,延长了患者的生存期。但是大量的循证医学研究证实,它们的疗效不尽人意。长期使用单克隆抗体还会出现严重的不良反应,并且价格昂贵,这些都限制了它们的临床使用。以肿瘤血管内皮细胞为靶点的主动免疫治疗维持的时间较长,无需频繁的反复给药;且特异性的体液免疫反应或细胞免疫反应副作用较小,所以诱导抗肿瘤血管的主动免疫效应是一种更有效的治疗方法。肿瘤血管内皮细胞处于活跃增殖状态,其细胞膜上表达多种与细胞增殖相关的特异性蛋白分子,是血管内皮细胞增殖相关抗原,如血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ(Vascular Endothelial GrowthFactor Receptor,VEGFR-Ⅱ)、整合素av(CD51)、组织因子、Endoglin(CD105)等,这些蛋白分子在体内静止期的血管内皮细胞上却不表达。研究表明,利用体外培养的增殖活跃的异种血管内皮细胞制备疫苗,可以成功打破免疫耐受,诱导抗肿瘤血管生成。近来,用异种血管内皮细胞增殖相关蛋白和DNA分子疫苗相关研究较多,以同种蛋白和DNA分子疫苗也有报道,但由于引起的超敏反应、单一靶点的治疗效果的局限性,备受争议,寻找多靶点治疗且副作用少的主动免疫治疗方法势在必行。本研究对来源于微血管的小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3进行体外培养,制备疫苗,免疫小鼠并观察其对肺癌皮下移植瘤、肺转移癌的抗肿瘤效应。另一方面,本研究应用小鼠bEnd.3制备抗原,冲击树突状细胞(Dendritic Cells,DCs),观察其诱导的体内外特异性抗肿瘤血管生成的免疫反应,并初步探索其机制,试图寻找一种新的抗肿瘤血管治疗方法。人脐静脉血管内皮细胞(Human UmbilicalVein Endothelial Cells,HUVEC)来源于大的静脉血管,多项研究报道异种HUVEC有抗肿瘤血管生成的作用,因此,本研究用异种HUVEC和同种小鼠成纤维细胞(NIH3T3)作对照,来观察不同来源的两个血管内皮细胞的抗肿瘤血管生成作用。第一部分同种bEnd.3细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞的免疫效应第一章同种bEnd.3细胞的培养及疫苗制备方法:1.体外常规培养小鼠bEnd.3细胞,从人脐带分离培养HUVEC,体外扩增,通过细胞表面标志vWF、CD31和CD144的细胞免疫组化和RT-PCR方法鉴定两种细胞。2.利用RT-PCR方法检测血管内皮细胞增殖相关抗原VEGFR-Ⅱ和整合素av基因在bEnd.3、HUVEC、NIH3T3、肿瘤细胞LLCs和U14的表达。3.bEnd.3、HUVEC、NIH3T3细胞在体外大量扩增后,用0.025%戊二醛固定制备疫苗,疫苗浓度2.5×10~7/ml。结果:1.成功培养和体外大量扩增了小鼠bEnd.3细胞和人HUVEC细胞,它们均分别高表达vWF、CD31和vWF、CD144等血管内皮细胞标志。2.在mRNA水平,bEnd.3细胞和HUVEC细胞同时表达VEGFR-Ⅱ和整合素av基因,NIH3T3细胞不表达VEGFR-Ⅱ和整合素av基因,肿瘤细胞LLCs和U14均只表达整合素av,不表达VEGFR-Ⅱ。3.用0.025%戊二醛成功制备疫苗。第二章同种bEnd.3疫苗诱导小鼠对Lewis肺癌皮下移植瘤免疫效应检测方法:1.小鼠分预防组和治疗组,治疗组又分为血清治疗组和T淋巴细胞治疗组,疫苗分bEnd.3组、HUVEC组、NIH3T3组和PBS组。预防组直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,5×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞。治疗组用ELISA检测阳性的免疫小鼠的抗血清和脾T淋巴细胞进行治疗,血清治疗组,在荷瘤一周后,肌肉注射50μl/只,隔日注射一次,共6次。T淋巴细胞组,在荷瘤一周后,肿瘤周围注射1×10~7个脾T细胞,隔日注射一次,共6次。2.观察小鼠肿瘤体积,小鼠生存期;HE染色观察瘤体组织变化。CCK法和流式细胞术对免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性的检测。ELISA法、免疫细胞化学法和Western blot法对免疫小鼠抗血清的特异性反应检测。3.不良反应检测在免疫后2周的小鼠腹壁上划“十”字伤口,观察其伤口愈合情况。结果:1.抑制了小鼠肺癌皮下移植瘤的生长和延长了生存期在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤预防组中,bEnd.3组小鼠肿瘤生长速度缓慢,而且在生长3周肿瘤体积明显减小约20mm~3,之后处于相对停滞状态,与对照组有统计学差异(P＜0.05)。中位生存时间bEnd.3组为90天(终止实验),较对照组明显延长(P＜0.01)。瘤体剥离后HE染色发现,bEnd.3组为脂肪和肌肉组织,无癌细胞,而NIH3T3和PBS组均是癌细胞。T细胞治疗组和血清治疗组中,bEnd.3组小鼠肿瘤生长速度减慢,生存时间较NIH3T3和PBS组长(P＜0.05)。但T细胞治疗组较血清治疗组更能延长小鼠生存时间(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤活性流式细胞术检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05),CCK法检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组在效:靶为25:1时脾T淋巴细胞具有较强的杀伤体外增殖的bEnd.3细胞和HUVEC细胞的CTLs杀伤活性(P＜0.05),而对LLCs肺癌细胞却没有杀伤活性。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA结果提示细胞免疫组化结果提示bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组抗血清与体外bEnd.3和HUVEC膜蛋白和细胞有特异性免疫反应,并能对体外增殖的bEnd.3细胞和HUVEC细胞起到抑制作用;Western blot检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组抗血清在220 KD和180 KD处均出现了特异性条带,而HUVEC组在130 KD处有特异性条带,bEnd.3组在130 KD处无特异性条带,两组抗血清与LLCs膜蛋白无特异性反应及条带。4.延迟了伤口愈合bEnd.3组和HUVEC组免疫小鼠的伤口愈合时间较NIH3T3组和PBS组长(P＜0.05),但均能完全愈合。第三章同种bEnd.3疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14肺转移癌的免疫效应检测方法:1.小鼠分预防组和治疗组,疫苗分bEnd.3组、HUVEC组、NIH3T3组和PBS组。预防组直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,5×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,尾静脉注射小鼠U14细胞5×10~6个细胞/只。治疗组先尾静脉注射小鼠U14细胞5×10~6个细胞/只,然后用疫苗治疗小鼠,于第1,3,5,7,9和11天在小鼠腋窝淋巴结周围皮下注射,共6次。2.观察计算小鼠肺表面转移癌结节数;小鼠生存期;HE染色观察转移癌组织变化;CFSE和PI法检测免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性;流式细胞术检测CD3~+CD8~+细胞百分比;ELISA法、免疫细胞化学法和Western blot检测抗血清的特异性反应。结果:1.抑制了小鼠宫颈癌U14肺转移癌的转移和延长了生存期bEnd.3组和HUVEC组左肺癌结节数明显少于NIH3T3组和PBS组(P＜0.05),以预防组更明显;bEnd.3组中位生存时间,预防组可达34天,治疗组26天,而对照组只有19天,预防组生存时间明显延长(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤活性流式细胞术检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05),CFSE和PI法检测bEnd.3组免疫小鼠脾T淋巴细胞具有杀伤体外增殖的bEnd.3细胞CTLs杀伤活性,HUVEC组也有一致的结果;对U14细胞却没有杀伤活性。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA和细胞免疫组化结果提示bEnd.3组和HUVEC组抗血清与体外bEnd.3和HUVEC膜蛋白和细胞有特异性免疫反应,并能对其体外增殖起到抑制作用;U14小鼠抗血清与bEnd.3膜蛋白有特异性反应发生,Western blot检测bEnd.3抗血清在220 KD和180 KD处出现了特异性条带,在130 KD处无特异性条带,在HUVEC组在220 KD和130 KD处均有特异性条带,在180KD处却无特异性条带;二者与U14膜蛋白无特异性条带产生。第二部分同种bEnd.3细胞抗原致敏DCs诱导小鼠对肺癌血管内皮细胞的免疫效应第一章小鼠bEnd.3抗原制备和小鼠骨髓源DCs培养及鉴定方法:1.收集bEnd.3细胞,反复冻融4次制备抗原。2.体外培养小鼠骨髓来源的DCs,并进行形态学和细胞表面CD11a和CD86表达鉴定。3.抗原以100μg/ml浓度负载DCs。结果:1.根据台盼蓝染色检测细胞冻融效果好,抗原定量检测结果显示1×10~7个细胞能够收获398.98±96.36μg抗原。2.成功培养小鼠骨髓来源的DCs,经鉴定培养至第8天成为成熟DCs。第二章负载bEnd.3抗原的DCs对体外增殖的血管内皮细胞的影响方法:1.分别负载bEnd.3、HUVEC和NIH3T3抗原的DCs培养8天成熟后,与小鼠脾T淋巴细胞混合培养3天,诱导CTLs,CCK法观察T淋巴细胞体外增殖情况。2.将CTLs与靶细胞bEnd.3、HUVEC和LLCs混合培养3天,MTT法观察其体外杀伤作用。结果:1.体外促进了小鼠脾T淋巴细胞的增殖CCK法检测负载bEnd.3抗原和HUVEC抗原的DCs在体外能够促进小鼠脾T淋巴细胞的增殖,负载NIH3T3抗原的DCs也可促进小鼠脾T淋巴细胞的增殖(P＜0.05)。2.体外诱导了内皮细胞特异的CTLs杀伤活性MTT法负载bEnd.3抗原和HUVEC抗原的DCs有明显杀伤bEnd.3细胞和HUVEC细胞的作用(P＜0.05),负载NIH3T3抗原的DCs体外诱导的CTLs对bEnd.3细胞和HUVEC细胞无明显杀伤作用。第三章bEnd.3抗原负载的DCs疫苗诱导小鼠对Lewis肺癌皮下移植瘤免疫效应检测方法:1.负载bEnd.3抗原的DCs培养第8天成熟后,收集制备疫苗。疫苗分为bEnd.3DCs组、HUVECDCs组、NIH3T3DCs组、DCs组和PBS组。直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,1×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞。2.观察小鼠瘤体增长速度和生存期;检测免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性和免疫小鼠抗血清的特异性反应。结果:1.抑制了小鼠肺癌皮下移植瘤的生长和延长了生存期负载bEnd.3抗原的DCs培养8天成熟后,制备疫苗,免疫小鼠后,bEnd.3DCs组小鼠肿瘤生长速度缓慢,与NIH3T3DCs组和DCs组比较有统计学差异(P＜0.05)。而NIH3T3DCs组和DCs组肿瘤生长速度又比PBS组慢(P＜0.05)。中位生存时间bEnd.3DCs组为65天,NIH3T3DCs组和DCs组分别为55和57天,较对照组明显延长(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤CCK法检测bEnd.3DCs组免疫小鼠脾T淋巴细胞具有杀伤体外增殖的bEnd.3细胞CTLs杀伤活性,流式细胞检测结果提示bEnd.3DCs组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05)。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA检测荷瘤前后免疫抗血清特异性结果示,荷瘤前后bEnd.3DCs抗血清与bEnd.3的免疫效应无明显差异(P＞0.05),而荷瘤后的小鼠抗血清中,除PBS组,均能与bEnd.3和LLCs膜蛋白发生反应。Western blot检测bEnd.3DCs组抗血清在220 KD和180 KD处也出现了特异性条带,在130 KD处无特异性条带,HUVECDCs组在220 KD、180 KD和130 KD处均有特异性条带,与LLCs膜蛋白无特异性反应及条带。结论1.同种小鼠bEnd.3细胞疫苗和负载小鼠bEnd.3抗原的DCs疫苗可抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤和小鼠宫颈癌U14肺转移癌的生长和转移,延长了小鼠生存期,预防组抑瘤效果优于治疗组。2.抑瘤效应机制是在体内诱导形成靶向增殖血管内皮细胞的CTLs,诱导产生了抗VEGFR-Ⅱ抗体、抗Endoglin抗体和抗整合素av抗体等血管内皮细胞增殖相关抗体,诱导了抗肿瘤血管的细胞和体液免疫反应,抑制肿瘤的生长。3.内皮细胞疫苗能延长伤口愈合时间,但不影响其最终愈合。4.同种bEnd.3疫苗和异种HUVEC疫苗均能诱导抗肿瘤血管的主动免疫反应,二者抑瘤作用无明显差异。5.bEnd.3的两种疫苗形式之间的抑瘤作用有差异,整个血管内皮细胞疫苗较负载血管内皮细胞抗原的DCs疫苗似乎更有优势。
佚名[6]2010年在《肿瘤免疫》文中研究说明免疫系统对肿瘤化疗的系列反应现象刘辉吴晓鑫大连医科大学临床免疫学教研室,大连116044肿瘤的发生发展及其转归与特定的机体免疫状态及免疫应答能力密切相关,而且肿瘤的免疫疗法亦是当前治疗恶性肿瘤最有希望的方法之一。但目前治疗肿瘤化疗方法仍占主要地位,由于各种化疗药物多是细胞毒性物质,因而大多数人推测化疗药物对机体免疫系统一定有不同程度的抑制作用,而对肿瘤患者化疗时机体免疫功能状态的检测并没有系统的实验评估,对化疗病人各阶段的免疫状况亦缺乏较全面的认识。
张光波[7]2005年在《人B7-H3分子的克隆、表达及其生物学功能的初步研究》文中研究说明B7-H3是新近发现的共刺激分子,属B7超家族成员,为I型跨膜球蛋白,分子量约45～66kD,编码361个氨基酸。B7-H3mRNA表达谱相当广泛,表达在除外周血淋巴细胞及骨髓组织外的几乎所有组织上。在生物学功能上,B7-H3可促进T细胞活化增殖和IFN-γ的分泌,增强CTL活性,对TNF-α及IL-8的分泌也有适度促进作用。在肿瘤免疫应答中,B7-H3信号能有效的激发T细胞特别是激发CD8~+T细胞介导的抗肿瘤效应。但随后也有研究表明,B7-H3介导的信号可抑制T细胞的体外增殖,降低IFN-γ的分泌。此外,B7-H3信号在骨质疏松的发生、在移植物排斥反应(allograft rejection)中都具有重要的调节作用。因此,对该信号途径的有效调节将不仅为理解复杂、精细的免疫应答提供新的视角,而且还具有潜在的临床应用前景。本项研究旨在通过研制B7-H3融合蛋白及特异性单克隆抗体,继而从不同水平探讨B7-H3分子在免疫应答的调节作用和涉及的机制。 1.人B7-H3分子的克隆、重组蛋白的表达及其生物学功能的研究 采用RT-PCR的方法,从人的肺组织克隆得到了人B7-H3的cDNA。以此为模板,利用PCR技术,克隆编码人B7-H3胞外段的功能区基因。将测序正确的该基因装入原核表达载体pGEX-5X-3/hB7-H3。然后将该重组载体导入表达宿主菌BL21(DE3),异丙基β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST/hB7-H3融合蛋白。经过GST-Sepharose亲和层析纯化变性复兴后得到的可溶性蛋白,MTT法证明此蛋白对T淋巴细胞的体外增殖具有明显的促进作用。ELISA分析发现,该融合蛋白可明显地提高T细胞对INF-γ和IL-10的分泌。 2.鼠抗人B7-H3单抗的制备、特性分析及B7-H3蛋白表达谱的研究 通过基因克隆,将编码人B7-H3分子的cDNA插入逆转录病毒载体pEGZ-Term。进一步通过脂质体转染技术将重组表达载体与辅助病毒载体共转染包装细胞293T,用其培养上清感染L929细胞,经Zeocin筛选获得稳定表达B7-H3分子的L929转基
张峻岭, 李卫泊, 谢绍建, 李冬斌, 田青[8]2010年在《米托蒽醌通过诱导钙网蛋白的表达抑制黑素瘤的生长》文中指出目的:观察米托蒽醌(mitoxantrone,MIT)对黑素瘤B16细胞钙网蛋白(calreticulin,CRT)表达的影响,探讨高表达CRT的B16细胞膜抗原疫苗的免疫效果及其机制。方法:不同剂量MIT处理B16细胞,免疫荧光法检测B16细胞CRT的表达。以B16细胞建立小鼠荷瘤模型,用不同剂量的MIT治疗荷瘤小鼠,观察MIT对黑素瘤生长及肿瘤组织中CRT表达的影响。制备B16细胞膜蛋白和MIT处理后B16细胞膜蛋白作为疫苗分别免疫小鼠,免疫组化检测小鼠移植瘤组织内免疫细胞的浸润情况,流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏中CD4+、CD8+T细胞比例的变化。结果:MIT可剂量依赖性地上调B16细胞表面CRT的表达,对照组B16细胞表面CRT为(29.40±3.57)%,高剂量MIT处理组为(72.20±2.94)%(P<0.05);MIT促进移植瘤组织中CRT的表达,对照组为(3.21±1.37),高剂量MIT组为(9.17±1.06)(P<0.05)。MIT有效抑制小鼠黑素瘤的生长(P<0.05,P<0.01)。与B16细胞膜蛋白疫苗相比,高表达CRT的MIT-B16细胞膜蛋白疫苗可明显上调小鼠黑素移植瘤组织中的DCs和T细胞的数量,以及脾脏细胞中CD4+、CD8+T细胞的比例(P<0.05)。结论:MIT能够上调CRT在B16细胞表面的表达,高表达CRT的B16细胞膜蛋白疫苗能够提高肿瘤组织中浸润DCs和T细胞的数量,抑制黑素瘤的生长。
王世杰[9]2017年在《呈递HPV16E7抗原的重组细菌外膜囊泡在TC-1肿瘤模型中的治疗性干预》文中研究指明宫颈癌是威胁全球女性健康的第二大恶性肿瘤,在几乎100%的宫颈癌患者中均检测到了人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)的存在。除宫颈癌,HPV还可以引起头颈癌、肛门和生殖道癌等。目前,尽管国际上已有预防性HPV疫苗获批准上市,但是鉴于疫苗的接种覆盖面有限、病毒基因型间交叉保护力有限、以及预防性疫苗对于已经建立的HPV长期感染或肿瘤患者,没有明显的治疗作用,HPV仍然是人类健康的重大威胁。因此,研发治疗性HPV疫苗,针对癌前病变和肿瘤进行免疫治疗,对于控制HPV相关疾病具有广阔的应用前景。然而,目前治疗性HPV疫苗临床研究普遍缺乏显著的治疗效果。研究显示,不能够激发高水平的特异性细胞免疫应答,是肿瘤疫苗设计中存在的显著问题。因此,积极开发新型抗原递送系统,增强抗原向抗原递呈细胞的递送,是提高疫苗激发的肿瘤抗原特异性细胞应答强度,增强肿瘤疫苗临床效力的重要策略。细菌外膜囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)为一种蛋白脂质体纳米颗粒,直径为20-250nm,由革兰氏阴性菌在生长过程中由外膜突起释放到胞外。OMVs具有成为疫苗载体的诸多特点与优势:如可基因重组改造,可进行大蛋白及多蛋白呈递,具多种促进抗原递呈细胞识别的受体,具自佐剂活性,作为一种纳米颗粒可以促进向淋巴结趋化等。此外,B群奈瑟脑膜炎OMVs疫苗的成功临床应用,对于发展OMVs成为有潜力的疫苗载体有着重要提示作用。近年,有研究者尝试将外源蛋白整合到OMVs中,例如将肺炎球菌蛋白PspA成功呈递在沙门氏菌的OMVs以抵御肺炎双球菌的感染,以及我们前期研究中将Omp22蛋白呈递在大肠杆菌E.coli的OMVs上以抵御鲍曼不动杆菌的感染,展示OMVs经基因工程改造,可承载外源大分子抗原蛋白,诱导特异体液免疫应答,有效抵御病原菌的攻击。然而,以大肠杆菌OMVs作为治疗性疫苗载体、激发抗原特异的细胞免疫应答,其技术、免疫特点、肿瘤干预效应等相关的研究尚无报道。本研究旨在探讨重组细菌外膜囊泡作为一种新型治疗性肿瘤疫苗载体的特点与潜力。研究主要包括:1)利用基因工程手段将肿瘤抗原HPV16型E7蛋白呈递在大肠杆菌OMVs上,获得重组OMVs疫苗形式;2)在体外培养的巨噬细胞Raw264.7中,考察重组OMVs将自身成分及模式抗原GFP递送至抗原递呈细胞的能力;在体外诱导培养的骨髓来源树突状细胞(BMDCs)中,探讨了重组OMVs被高效摄取的能力、囊泡结构在摄取过程中的重要性及BMDCs摄取OMVs后的成熟情况;3)在C57BL/6小鼠TC-1移植肿瘤模型中,评价了呈递HPV16 E7抗原的重组OMVs激发特异细胞免疫的能力及对已建立肿瘤的治疗性干预效果。结果表明,经利用ClyA及硫氧还蛋白作为引导序列,可将HPV16E7蛋白呈现于OMVs表面及内腔;OMVs可被Raw264.7及BMDCs有效摄取,且囊泡结构对于摄取效率非常重要;OMVs能够促进BMDCs表面共刺激分子CD80、CD86、CD83、CD40等的高表达及TNFα的分泌,显著促进BMDCs的功能成熟;无需混合传统佐剂,重组OMVs同时诱导了抗原特异的细胞免疫应答和体液免疫应答,且具有偏向于诱导Th1/CTL的免疫特点;重组OMVs治疗性免疫显著抑制了肿瘤的生长;重组OMVs呈递E7较之wtOMVs直接混合E7以及弗氏佐剂混合E7,具有更强的免疫效应。本研究提示,纳米级的大肠杆菌OMVs在肿瘤免疫治疗中可以作为一种潜在的新型疫苗递送载体,有效激发肿瘤抗原特异的细胞免疫应答。研究为新型治疗性肿瘤疫苗突破探讨了崭新的策略。
吴尘轩[10]2008年在《增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究》文中认为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的临床治疗效果较差,研究者不断探索有效的治疗方法以期减少术后复发、延长生存时间、提高总体疗效。随着免疫学等基础研究的不断深入,生物治疗日益显示出良好的应用前景。作为肿瘤生物治疗策略之一的树突状细胞(dendritic cell,DC)疫苗的研究与应用已取得相当大的进展。然而在实际应用中DC疫苗的治疗效果往往不如预期,为此,众多学者尝试多种途经增强DC诱导的肿瘤特异性免疫反应,这其中包括对不同来源DC的比较和选择,联合其他辅助药物如中药、多种细胞因子,以及研制新型亚细胞瘤苗exosome等来调节或替代DC功能。Exosome是肿瘤细胞和DC均能分泌一种膜性微囊结构,其重要特性是携带来源细胞的各种功能蛋白,且理化性质稳定、耐高温、制备时易于质控,已经在黑色素瘤、肺癌等的治疗中取得良好效果,用于抗肝癌的研究尚处于探索阶段。本课题尝试应用多种来源的单核细胞作为前体制备DC疫苗,又分别制备人肝癌细胞株SMMC7721来源(Tumor-derived exosome,Texo)和DC来源的exosome(DC-derived exosome,Dexo),研究其对抗肝癌免疫的诱导及调节效应,并初步探讨了中药单体黄芪甲苷对DC及其相关exosome诱导特异性抗肿瘤免疫的调节作用,为研制更具临床应用前景的用于肝癌的肿瘤疫苗和提高其治疗效果提供更多选择。目的1.应用多种来源的单核细胞,通过简便有效的方法,体外诱导培养获得足够数量及具成熟表型的DC,为DC疫苗的进一步研究及应用打下基础;2.对比分析Texo和Dexo的形态、表型及功能,研究此新型亚细胞瘤苗在抗肝癌免疫中的作用;3.观察中药单体黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,ASI)对于DC及其exosome免疫功能的调节作用,探讨其作为免疫增强剂的可行性。方法1.提取健康人外周血、人脐血及肝癌患者术中失血的单核细胞,用细胞因子组合rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α诱导培养DC,光镜、电镜观察形态,流式细胞仪鉴定其表型;2.离心/超滤/超离法提取SMMC 7721来源exosome(Texo)及SMMC 7721抗原致敏DC来源的exosome(Dexo),电镜观察,Western-blot检测其携带的蛋白;观察二者刺激淋巴细胞增殖情况,ELISA检测淋巴细胞培养上清中IL-2,MTT法检测不同组合激活的效应淋巴细胞对SMMC-7721的细胞毒效应。3.在DC诱导培养过程中加入ASI,光镜及电镜观察细胞形态,流式细胞仪检测DC表型,ELISA法测定培养上清中IL-12和MHCⅡ类分子水平;观察黄芪甲苷对DC刺激淋巴细胞增殖的影响;MTT法测定黄芪甲苷作用下DC及Dexo诱导的CTL对SMMC 7721特异性杀伤效应。结果1.三种来源的单核细胞均可体外诱导培养为具有典型形态和表型的DC;术中失血来源DC表面标志物表达水平稍低,但较未诱导前有显著的提高。2.应用少量细胞培养上清(60～80mL)提取exosome;Dexo和Texo具有相似的形态特征;前者表达CD40、CD80、CD81、CD86、CD54、MHCⅠ、MHCⅡ(HLA-DR);而后者CD40缺乏,CD80、CD86和MHCⅡ(HLA-DR)相对低表达;二者在DC参与下均可显著刺激淋巴细胞增殖及IL-2分泌,且能激发较强的针对SMMC7721的特异性细胞毒作用,效果高于致敏DC组(P＜0.05);Dexo具有刺激淋巴细胞活化增殖的作用,并可诱导具有特异性杀伤活性的CTL,杀伤效率(%)明显高于单纯Texo(30.93±11.1 vs 10.24±7.37,P=0.004),但低于致敏DC组(30.93±11.1%vs 43.76±8.93%;P=0.050)。3.黄芪甲苷作用下DC生长状态及形态特征较常规诱导组无明显差异;各表面标志较常规诱导组均有不同程度上调,其中CD83表达显著上调(73.5%vs 41.3%);DC培养上清IL-12含量(pg/mL)较常规诱导组明显升高(632.65±14.26 vs 442.85±38.96,P=0.000),且该组DC刺激淋巴细胞增殖作用增强;黄芪甲苷可使未成熟DC释放exosome增加,并可促进DC诱导的CTL对SMMC7721的特异性杀伤(%)(59.98±5.23 vs 46.50±2.31,P=0.002),而对Dexo无明显作用。结论1.健康人外周血、脐血和肝癌病人术中失血来源单核细胞均可在体外诱导获得具有典型形态和表型的成熟DC,用于后续肝癌DC疫苗实验研究;肝癌术中失血来源DC成熟度稍低,但有望通过体外诱导培养并添加促成熟因子提高肝癌患者DC成熟标志物的表达,从而提高其免疫功能。2.Dexo作为一种既携带肿瘤抗原又具有抗原提呈作用的亚细胞结构,可诱导淋巴细胞的增殖,诱发特异性杀伤效应,此作用在DC参与下明显增强,Dexo有可能完全或部分替代DC而发挥肿瘤疫苗或天然抗肿瘤佐剂的作用;Texo在体外不能单独诱导初始T淋巴细胞活化增殖,但是在机体内环境中仍然有可能发挥其免疫学功能,诱导有效的抗肝癌免疫反应。3.黄芪甲苷可通过促进DC成熟和抗原提呈功能、增加其功能性细胞因子IL-12的释放,进而增强DC诱导的特异性CTL细胞毒作用,因此有望作为一种天然的免疫增强剂应用于DC介导的抗肝癌治疗。
参考文献：
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[4]. 树突状细胞分泌的exosomes的生物学特性及抗肿瘤作用的初步研究[D]. 任亚娜. 华东师范大学. 2007
[5]. 同种脑微血管内皮细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞免疫效应研究[D]. 赵军. 郑州大学. 2009
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[8]. 米托蒽醌通过诱导钙网蛋白的表达抑制黑素瘤的生长[J]. 张峻岭, 李卫泊, 谢绍建, 李冬斌, 田青. 中国肿瘤生物治疗杂志. 2010
[9]. 呈递HPV16E7抗原的重组细菌外膜囊泡在TC-1肿瘤模型中的治疗性干预[D]. 王世杰. 北京协和医学院. 2017
[10]. 增强树突状细胞及其相关exosome抗肝癌免疫效应的实验研究[D]. 吴尘轩. 天津医科大学. 2008
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