急性一氧化碳中毒大鼠大脑皮质Bcl-2和p53蛋白表达的探讨

急性一氧化碳中毒大鼠大脑皮质Bcl-2和p53蛋白表达的探讨

刘轶林[1]2012年在《醒脑静注射液对CORM-2诱导神经细胞凋亡的干预作用及机制分析》文中研究指明迄今为止,关于一氧化碳致脑损伤的发病机制已提出多种学说,如:缺血缺氧学说、自由基损伤学说、细胞凋亡学说、血管因素学说、免疫损伤学说等。这些学说从不同的侧面对一氧化碳所致的脑损伤做出了相对合理的解释,但到目前为止,其确切机制仍无定论。近年来,越来越多的研究表明了神经细胞凋亡在一氧化碳所致脑损伤的病理过程中扮演着重要的角色,因此,对一氧化碳所致脑损伤后神经细胞凋亡机制的研究将为今后的临床治疗提供基础理论依据。醒脑静注射液是安宫牛黄丸的精制注射液,其主要成分有麝香、冰片、栀子以及郁金,具有良好的醒脑开窍、清热凉血、解毒止痛疗效,对多种中枢神经系统危重急症均有显着疗效。研究发现,醒脑静注射液能够明显抑制创伤性脑损伤、缺氧、缺血再灌注等多种损伤因素诱导的神经细胞凋亡,因此,我们拟观察醒脑静注射液对一氧化碳释放剂诱导神经细胞凋亡的影响,探讨醒脑静注射液干预外源性一氧化碳释放剂诱导神经细胞凋亡的可能作用机制。1.诱导神经损伤模型的建立及醒脑静脑保护的初步研究本部分实验旨在建立外源性一氧化碳释放剂诱导神经细胞损伤的模型并初步探讨醒脑静注射液对该其的保护作用。研究采用MTT法,首先观察了外源性一氧化碳释放剂诱导神经细胞损伤的适宜浓度,然后在此基础上观察醒脑静注射液对其保护作用。研究发现,外源性一氧化碳释放剂CORM-2诱导损伤4h、8h、12h后,各组细胞存活率并未受到明显的影响,然而当损伤时间延长至24h后,CORM-2各损伤剂量组的细胞存活率与正常对照组相比均有所下降,且随着CORM-2浓度的不断增大,细胞存活率逐渐降低,鉴于MTT法反应的活细胞数量,选择200μmol-L-1CORM-2在进一步的实验中对皮层神经细胞进行诱导损伤;在观察醒脑静注射液对CORM-2诱导损伤神经细胞的影响的过程中发现,不同剂量的醒脑静注射液孵育20h后,与模型组相比,各给药组的细胞存活率均有所升高,醒脑静中剂量组(10mL·L-1)及醒脑静高剂量组(20mL·L-1)与模型组相比,显示出明显的统计学差异(P<0.01)。以上结果提示醒脑静注射液对CORM-2诱导的神经细胞损伤具有一定的保护作用。2. Annexin V-PI双染法对细胞凋亡的测定本部分实验旨在观察CORM-2对神经细胞凋亡率的影响,同时观察不同剂量的醒脑静注射液对CORM-2诱导神经细胞凋亡的干预作用。研究通过AnnexinV-PI双染法对CORM-2诱导损伤神经细胞的早期及中晚期细胞凋亡率进行测定,然后观察醒脑静注射液对CORM-2诱导损伤的早期及中晚期凋亡率的影响。研究结果表明,1OOμmol·L-1,200μmol-L-1,400μmol·L-1及800nmol·L-1CORM-2剂量组均能够诱导体外培养的神经细胞发生凋亡,随着CORM-2浓度的不断增加,神经细胞的总凋亡率也随之升高;给予中剂量的醒脑静注射液(10mL·L-1)及高剂量的醒脑静注射液(20mL·L-1)后,神经细胞的早期凋亡率明显降低,与模型组相比,具有明显的统计学差异(P<0.01),但中高剂量醒脑静注射液对中晚期的神经细胞凋亡作用不明显,与模型组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。研究结果提示,醒脑静注射液能够干预CORM-2诱导的神经细胞凋亡。3. CORM-2诱导神经细胞凋亡及醒脑静注射液对其干预作用的机制分析本部分旨在探讨CORM-2诱导神经细胞凋亡的机制并对醒脑静注射液对其干预作用的机制进行分析。研究采用Western Blot方法观察Caspase依赖性途径在CORM-2诱导神经细胞凋亡的过程中是否发挥作用,同时观察醒脑静注射液是否通过Caspase依赖性途径达到抑制CORM-2诱导神经细胞凋亡的目的。研究结果发现,100μmol·L-l、200μmol·L-1.400μmol·L-1及800μmol·L-1CORM-2剂量组与正常对照组相比,均能够使Caspase依赖性线粒体途径中的关键蛋白caspase-3, caspase-9及Cyt C的表达增加,且随着CORM-2浓度的不断升高,caspase-3, caspase-9及CytC的表达有逐渐上升的趋势,但Caspase依赖性死亡受体途径中的关键蛋白caspase-8以及Caspase依赖性内质网途径中的关键蛋白caspase-12均无表达,提示CORM-2可能通过激活Caspase依赖性线粒体途径诱导神经细胞凋亡;10mL·L-1及20mE-L-1醒脑静注射液使caspase-3, caspase-9及CytC的表达显着减少,且随着剂量的增大,caspase-3, caspase-9与CytC的表达逐渐降低,提示醒脑静注射液可能是通过抑制细胞凋亡的线粒体途径从而干预CORM-2诱导的神经细胞凋亡。综上所述,醒脑静注射液具有一定的神经保护作用,能够抑制CORM-2诱导的神经细胞凋亡,其干预细胞凋亡的作用可能是通过抑制细胞凋亡的Caspase依赖性线粒体途径。

刘郁[2]2003年在《一氧化碳对小鼠中枢神经系统的损害及高压氧的干预作用》文中研究说明目的 一氧化碳(CO)作为一种无色无味的气体,由含碳物质的不完全燃烧所释放,其毒性早已为人们所知。然而,随着生活水平的提高,一氧化碳中毒却没有相应的下降趋势,在许多国家(无论是发展中国家还是发达国家),与中毒相关的死亡50%以上由一氧化碳所引起。CO中毒除有较高的死亡率外,还有较高的致残率。CO对人体重要器官脑和心损害极大,中毒病人经及时治疗仍有高达23-47%发生迟发性神经精神后遗症(delayed neuropsychologic sequelae,DNS)。轻者头痛,失眠,记忆力减退,重者发展成脑病或精神病。由于CO中毒受害者多为青壮年,由此引发的劳动能力丧失,生活质量下降,巨大的医疗花费等又构成严重的社会问题。 鉴于CO中毒严重威胁人民的生命健康,许多学者对其进行了研究。由于损害涉及到脑,许多实验难以在人体上进行,只能采取间接的方法或利用动物。至今CO引起神经精神损害的机制不清。动物研究发现,CO中毒后脑内有脂质过氧化和白细胞粘附增多的情况;大鼠脑内即早基因表达增多;CO阻碍组织对氧的利用,抑制细胞色素C氧化酶活性等。死亡病人解剖发现有脑白质脱髓鞘坏死,脑皮质海绵状坏死以及海马坏死等。国内研究基本都是采病人外周血做一些指标的测定,CO中毒脑损害仍有许多问题需要探讨。 我国也是CO中毒高发区。北方冬季寒冷,门窗紧闭,仍有许多民居用煤取暖。近年因燃气热水器引发的CO中毒也常有发生。1994年中国医科大学第一临床医院急诊科调查显示,急性CO中毒为第二位常见中毒,而死亡人数居第一位。 CO中毒的治疗主要是通过供氧以促进CO从血红蛋白解离,改善组织氧供。高压氧(HBO)治疗始于上世纪60年代末期。HBO用于CO中毒急性期效果已经得到公认。研究认为,HBO可改善线粒体的有氧代谢,抑制脂质过氧化和中性粒细胞粘附于脑血管而引起的损害。但HBO对迟发 性神经精神损害的效果至今仍有争议,HBO的作用机制仍未完全阐明。对 于其他抑制脑损害的治疗途径,目前研究甚少。 本实验利用CO中毒小鼠模型,观察脑内形态学(超微结构厂凋亡,自 由基释放与清除,细胞因子变化等,并设立高压氧治疗组,观察其对上述指 标的影响。为进一步探讨CO中毒脑损害机制的研究提供实验依据;也为 高压氧治疗的理论基础,临床上引人基因治疗,桔抗剂治疗等提供依据。 方 法 1.建立CO中毒小鼠模型 将小鼠放人自制SL染毒瓶中,密闭。瓶内预先放置碱石灰,可吸收呼 吸产生的COp通过导管通人CO气,令小鼠于瓶内吸人浓度为2500- 3000ppm的CO气50-60min至昏迷。每15分钟采样一次50ITil,用快速检 测管测定瓶内CO浓度和氧浓度,使之维持于规定浓度。 2.流式细胞术测定小鼠脑内Bcl-2,Bax,P53的表达以及凋亡细胞数 ①用网搓法制备单细胞悬液 lx 10VInl。一抗分别用 Bcl-2,Bax或 p53 /J’鼠IgG单抗,二抗用FITC山羊抗小鼠均 对细胞悬液进行标记。在 流式细胞仪上以488urn t激光激发,以平均荧光强度代表基因蛋白表达 量。②同法制备单细胞悬液进行PI染色。在流式细胞仪上以488urn t激光 激发,>61O urn滤光镜检测。测定每样本计数*,皿O个细胞,经0…SS七 软件分析细胞数DNA分布图,计算正常二倍体峰前AP峰曲线下面积占整 个分布曲线下面积百分比,即为凋亡细胞所占比例,用百分数表示。 3.透射电镜观察超微结构 取大脑,小脑,海马区组织各约 lmm\ 2.5%戊二醛及 1%OSO。固定, EPON812环氧树脂包埋,LKB-V超薄切片机(500-1000A)切片,切片以 醋酸铀柠檬酸铅双重染色,用H—600透射电镜观察。 4.分光光度法测定血脑屏障通透性 取已注射二%EB生理盐水的小鼠脑匀浆,离心取上清.用分光光度计 在70Inm处测吸光度,根据EB含量一吸光度回归方程计算脑组织EB含 量。 5.ELISA法测定 TNF-a、IL-lp、IL-8和 IL-10 ·2· 取脑组织匀浆,低温离心卜t℃,120009)取上清,采用双抗体夹心ELISA法进行测定。根据标本OD值在各自的标准曲线上查出各种细胞因子含量。 6.分光光度法测定小鼠脑内NO、NOS、MDA、SOD、GSH-Px、CAT 脑组织匀浆离心取上清。用*U—640型分光光度计在546urn(NO人401urn和 421urn(NOS),532urn 〔MDA),550urn(SOD),405urn(CAT),412nm(SH-Px)处,比色测各管吸光度值。 结 果 *CO中毒小鼠脑内h-2,P53人ax表达及细胞凋亡增加,高峰分别为中毒后 lh,3天,7天;急性 CO中毒可使小鼠脑细胞凋亡,发生超微结构改变人O中毒后应用高压氧治疗可以减少细胞凋亡(与中毒组比较有显着差异八HBO抑制脑细胞超微结构的改变;急性CO中毒可使小鼠血脑屏障通透性增高,中毒前15分钟或中毒后30分钟给予L-NAME均可减轻CO中毒对血

参考文献:

[1]. 醒脑静注射液对CORM-2诱导神经细胞凋亡的干预作用及机制分析[D]. 刘轶林. 北京中医药大学. 2012

[2]. 一氧化碳对小鼠中枢神经系统的损害及高压氧的干预作用[D]. 刘郁. 中国医科大学. 2003

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