李松岗[1]2003年在《端粒酶逆转录酶及其相关基因表达与肝细胞癌细胞凋亡、增殖关系的实验研究》文中认为肝细胞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，已上升为第二位肿瘤死亡的原因，恶性程度高，发展迅速，转移较快，无瘤生存期短。虽然经过半个世纪的努力，在肝癌外科治疗上取得很多的成绩，但是传统外科手术加化疗或放疗等方法都有其局限性，根治性切除术后复发率仍居高不下。因此，加强肝癌分子病理机制的研究，探讨肝癌生物治疗的新途径，可能是进一步提高肝癌治疗效果的有效途径。 端粒酶逆转录酶是1997首次在人与鼠基因组中发现的四膜虫P128同源类似物，为一单拷贝基因，定位于5P15.33，是端粒酶活性构成的核心成份之一，将其导入端粒酶阴性表达的细胞株，可有效激活端粒酶，使细胞恢复增殖，是端粒酶激活的限速因素。故对hTERT表达的研究有助于了解端粒酶的作用机制。目前hTERT在肝癌发生、发展中的作用还不明确，有学者认为其是肝癌早期诊断极为可靠的指标，尤其是AFP检测阴性肿瘤组织和较难诊断的小肝癌；但采用原位杂交方法对非肿瘤组织的检测发现hTERT在非肿瘤组织肝细胞中存在着明显阳性表达；出现研究结果差异的原因还不清楚。hTERT与肝细胞癌临床病理特征关系还不确定；有学者认为hTERT表达强度与组织去分化程度之间的负相关决定了端粒酶活性表达与肿瘤分化程度的关系，但其他研究结果并不支持这种观点；与肿瘤大小的关系还存在相反的看法；还未发现与其他临床病理特征之间的关系。这些不确定因素的存在使hTERT在肝癌诊断与治疗领域的运用价值不明确。 浙江大学博士学位论文 C－myc的转录水平反映着组织细胞的增殖状态，研究发现c－myc只有与同样具有bHLH－ZIP结构的 Max构成异二聚体，才可发挥转录活性。hTERT启动区内含有的多个 c－myc结合位点提示c－myc可能是hTERT表达调控因子，这种调控关系已在其他肿瘤的研究中得到证实，然而体外研究发现用药物处理肝癌细胞后，可导致端粒酶与hTERT表达水平明显下降，但c－myC表达没有任何变化，这提示在不同细胞种群中C－ITlyC影响hTERT方式可能存在差异。目前尚无肝细胞癌组织中hTERT与c－myc表达关系的研究报道。 细胞凋亡与增殖之间的动态平衡是机体维持细胞总数稳定、清除异常细胞与维持正常机体功能状态所必须，二者之间平衡失调可直接导致肿瘤发生、发展，端粒酶再次激活与肿瘤凋亡、增殖平衡失调密切相关，体外实验证明：抑制细胞端粒酶活性，可导致端粒长度持续缩短，细胞生长抑制，凋亡增加；端粒酶广泛表达于大多数肿瘤组织中，端粒酶的表达与反映细胞增殖状态的增殖相关抗原＊－67表达具有高度一致性，是反映肿瘤细胞增殖状态的一个很好指标。hTERT是端粒酶激活的关键因素，二者在肿瘤组织中的表达具有高度的一致性：因此，可以推测盯＊RT表达与细胞增殖、凋亡的关系；h＊＊RT与细胞增殖之间的相关性在其他一些肿瘤组织中己得到证实，在肝癌中仅见一篇相关报道，且没有对hTERT表达与hi67增殖指数间关系进行比较分析；还不清楚肝癌hTERT表达与肿瘤组织hi67增殖指数之间的关系：体外抑制h＊＊RT表达的实验说明，抑制h＊＊RT表达可导致一些细胞增殖停 滞，凋亡增加；但在肝细胞癌细胞株的研究并没有发现hTERT表达与细胞凋亡之间的直接 联系。 有基于此，本课题采用RT－PCR、TUNEL与免疫组化的方法，检测了肝细胞癌hTERT、 c－myc表达情况与细胞增殖、凋亡指数，并对其中可能存在的关系进行比较分析，以期为今 后hTERT在临床诊断与治疗的运用提供理论与实验依据。 第一部分：肝细胞癌端粒酶逆转录酶表达以及与临床病理特征的关系 目 的：研究端粒酶逆转录酶（hTERT ）在肝细胞癌以及相应癌旁组织中的表达情 况，并与肿瘤临床病理特征进行比较分析，以探讨hTERT表达在肝癌发生， 发展进程中作用以及可能的临床诊断价值。 2 浙江大学博士学位论文 材料方法：32例肝细胞癌组织以及相应癌旁组织标本取自2000年10月～2001年6月 浙江大学医学院第二附属医院。采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测 hTERT在肝细胞癌组织和相应癌旁组织的表达情况，样本按hTERT表达阳 性和阴性表达分组与年龄、HBSAg、肝硬化、肿瘤大小、包膜、肿瘤癌灶。 癌栓、肿瘤病理分级和临床分期等临床病理指标进行比较分析。 结 果：l、32例肝癌组织样本中，hTERT表达阳性的有27例，占总数84．38．％； 阴性表达有5例，占15．62％，癌旁组织中仅有叁例表达阳性（9．38％）， 而且表达强度明显低于相应肿瘤组织；二者比较有统计意义（P＜0刀5）。 二、肝细胞癌组织hTERT表达与年龄、HBSAg、肝硬化、包膜、肿瘤癌灶、 癌栓、肿瘤病理分级和临床分期等临床病理指标之间无
齐进春[2]2006年在《人端粒酶逆转录酶启动子驱动重组腺病毒治疗人前列腺癌的动物实验研究》文中进行了进一步梳理目的：前列腺癌在欧美国家中发病率很高，死亡率居第二位，仅次于肺癌。我国前列腺癌的发病率也在逐年升高。尽管绝大多数局部浸润和远处转移前列腺痛，初始对雄激素撤除有效，但最终预后不佳，而导致治疗失败。近年来随着分子机制研究的深入，基因疗法为前列腺癌尤其是那些雄激素非依赖性前列腺癌的治疗提供一条新途径。自杀基因治疗足一种有前景的基因治疗方法，常用的为单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus-thymidine kinase，HSV-tk)基因。其机理为基因编码的胸腺嘧啶核苷激酶将无毒的环氧鸟苷(gancyclovir，GCV)磷酸化，干扰肿瘤细胞DNA的合成，从而导致细胞死亡。然而缺乏杀伤肿瘤特异性，是现今许多基因治疗方案所面临的一个共同问题，因此研发出具有肿瘤靶向机制的治疗方法显得非常必要。端粒酶在大多恶性肿瘤细胞中处于激活状态而在正常细胞中却没有活性或者活性很低，是目前所报道最为广谱的肿瘤生物分子标记。人端粒酶逆转录酶(human telomerase transcriptase，hTERT)是维持端粒酶活性所必需的催化亚单位，它的表达调控在转录水平上。利用hTERT启动子来调控病毒携带的目的基因，可使病毒选择性的在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达目的基因。本实验目的是通过腺病毒载体嵌入hTERT启动子介导的HSV-tk基因，重组构建Ad-hTERT-HSV-tk，结合应用GCV，
王伟[3]2009年在《人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTpromoter）介导的ODC、SAMDC反义腺病毒的构建及其靶向抗肿瘤研究》文中研究表明多胺(polyamine)广泛存在于生物体内的各组织细胞中,是重要的代谢调控物质。在肿瘤组织中多胺的含量明显升高。鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多胺生物合成的第一个关键酶,在肿瘤的发生发展过程中起重要作用。1992年Auvinen等首次在Nature上发表论文,认为ODC活性增高能促进细胞转化。S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(SAMDC)是多胺合成的第二个限速酶,可以促进细胞的的恶性转化。文献报道SAMDC较ODC是更为有效的细胞转化的诱导因子。抑制多胺代谢途径成为治疗肿瘤的有效途径。相应的化学抑制剂如二氟甲基鸟氨酸(DFMO)、APA、CGP48664和AMA虽然在体内外的抑癌作用良好,但其严重的毒副作用极大的防碍了临床应用。寻找一种更高效更低副作用的抑制多胺合成途径的方法势在必行。如今,美国已启动600多个基因治疗的临床实验,其中60%是关于癌症治疗的。其中腺病毒介导的基因转染途径在癌症的基因治疗中特别引人关注,因为腺病毒的DNA不能整合到宿主基因组中,也不能感染卵细胞,具有很高的生物安全性。迄今为止,基因治疗的临床实例中近30%采用的是腺病毒载体。国内外研究证明反义核酸技术是比较理想的一种基因治疗方法,构建能转录反义RNA的重组载体在细胞内不断地转录出反义RNA,抵消酶解作用,发挥较持久的治疗效应。基因治疗在当今临床已经产生令人振奋的研究结果,但它的靶向安全性仍然是人们关注的焦点。许多肿瘤组织特异性启动子已被人类所认识,hTERT基因启动子更是备受关注。体外转基因实验中分别采用hTERT启动子与CMV启动子来转染不同的肿瘤细胞系,包括人肺癌细胞系(CH1299和A549),结肠癌细胞系(DLD1和LoVo),人宫颈癌细胞Hela及两种正常细胞系,结果显示:对于肿瘤细胞,hTERT启动子的转基因表达效率较CMV高2-3倍;而就正常细胞来说,CMV转基因的表达比hTERT高500多倍,这充分展示了hTERT启动子在肿瘤细胞中转基因表达的高效性与特异性。此后进行的体内直接转基因实验也证实了这一点。据此,本课题拟将ODC、SAMDC的反义基因分别构建入pAdEasy1系统,由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)启动表达,检测重组病毒对肿瘤细胞的特异抑制作用,为肿瘤疾病的靶向性基因治疗奠定基础。第一部分细胞端粒酶活性检测及外源hTERT启动子活性检测【研究目的】检测本实验中拟使用的五株细胞中端粒酶的活性,并检测端粒酶催化亚基启动子在肿瘤细胞系和正常细胞系中的启动活性,为下一步人端粒酶逆转录酶启动子启动的ODC、SAMDC反义病毒载体的构建奠定基础。【研究方法】(1)体外稳定培养肿瘤细胞系(人肺癌细胞系A549、人肝癌细胞系Bel-7402、HepG2)及正常细胞系(人胚肺成纤维细胞HELF、人肝细胞LO2)。(2)提取各株细胞端粒酶蛋白,利用TRAP法进行端粒酶活性的检测,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果。即将10μlTRAP产物与含溴酚蓝的6×凝胶载样缓冲液2μl混合,在120V的电压下,进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,直至电流使溴酚蓝色带泳出凝胶为止。固定银染显色后,出现4条以上间隔6bp的梯度条带者为端粒酶活性阳性。(3)将带有由人端粒酶逆转录酶启动子(hTERTp)启动的指示基因luc的重组质粒(pGL3-hTERT-luc,由美国肯塔基大学微生物教研室惠赠),转入各株培养细胞。(4)通过双荧光素酶法检测指示基因luc的表达活性,从而反映hTERT启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的启动活性。【实验结果】(1)利用TRAP法进行端粒酶活性的检测,经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示:对于肿瘤细胞系(A549、Bel-7402和HepG2),均具有大于4条以上的阳性带;而对于正常细胞系(HELF和LO2),均未见阳性条带出现。(2)双荧光素酶法检测结果显示,在肿瘤细胞系中,hTERT启动子的比活性分别是:A549细胞为4.5±0.25;Bel-7402细胞为5.1±0.24;HepG2细胞为4.9±0.3。而在正常细胞中,hTERT启动子的比活性分别是:HELF细胞为0.16±0.02;LO2细胞为0.11±0.01。【结论】本实验中拟使用的叁株肿瘤细胞(A549、Bel-7402和HepG2),其端粒酶活性为阳性;而对应的两株正常细胞(HELF和LO2),其端粒酶活性为阴性。荧光素酶活性检测显示:hTERT启动子在肿瘤细胞中具有较强启动活性而在正常细胞中未见有明显活性。第二部分hTERT启动子介导的人ODC、SAMDC反义腺病毒载体的构建【研究目的】分别构建由人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp介导ODC和SAMDC反义RNA表达的腺病毒载体,为在肿瘤细胞中靶向性抑制多胺合成提供新工具和手段。【研究方法】(1)应用PCR方法扩增出ODC mRNA翻译起始位点区120bp的基因片断,和SAMDC mRNA翻译起始位点区205bp的基因片断。PCR扩增产物和带有hTERT启动子的质粒pGL3-hTERT-luc均经XbaI、NcoI双酶切,回收质粒酶切长片段和PCR酶切产物片段。(2)将ODC和SAMDC回收片段分别与pGL3-hTERT-luc酶切长片段(-pGL3-hTERT-)进行连接,分别构成了pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒。(3) KpnI和SalI双酶切pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒,回收短片段(-hTERT-ODC-和-hTERT-SAMDC-)与经KpnI和SalI双酶切的腺病毒穿梭质粒pAdTrack长片段连接。分别构成pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC重组质粒。(4)重组质粒经PmeI酶切线性化后,转入Adeasy-1细菌与pAdeasy-1质粒发生同源重组。挑选阳性重组质粒pAdeasy-hTERT-ODC和pAdeasy-hTERT-SAMDC,经PacI酶切后,转染293细胞包装和扩增出腺病毒颗粒。荧光显微镜和PCR的方法对重组腺病毒进行鉴定。【实验结果】(1)采用PCR方法扩增出120bp、205bp的ODC、SAMDC基因片断,经电泳鉴定正确。(2) pGL3-hTERT-ODC和pGL3-hTERT-SAMDC重组质粒经XbaI、NcoI双酶切分别得到120bp、205bp小片段和4.5kb大片段,经测序鉴定正确。(3) pAdTrack-hTERT-ODC和pAdTrack-hTERT-SAMDC重组质粒经PCR扩增分别得到长120bp的ODC片断和长205bp的SAMDC片断,经测序鉴定此序列正确。(4)重组质粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC分别经PacⅠ酶切得4.5kb和35kb两个片段。(5)重组质粒pAd-hTERT-ODC和pAd-hTERT-SAMDC分别转染293细胞进行包装扩增,可见明显病毒空斑形成,荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白在293细胞中表达。扩增后腺病毒滴度为2×10~9pfu/ml,PCR证实两个重组质粒基因组中分别含有目的基因ODC和SAMDC。【结论】成功构建了由人端粒酶逆转录酶启动子hTERTp介导ODC反义RNA表达的腺病毒载体rAd-hTERT-ODC和SAMDC反义RNA表达的腺病毒载体rAd-hTERT-SAMDC,为肿瘤疾病的靶向性基因治疗和预防提供了必要的侯备工具。第叁部分两组反义腺病毒载体靶向性抑制肿瘤细胞增殖作用的研究【研究目的】研究两组重组腺病毒rAd-hTERT-ODC/SAMDC(rAd-hTERT-ODC和rAd-hTERT-SAMDC)对五株细胞(A549、Bel-7402、HepG2、HELF和LO2)中ODC、SAMDC基因表达的下调作用,并观察其对肿瘤细胞增殖以及侵袭能力的靶向抑制作用。【研究方法】(1)将两组重组腺病毒载体分别转染入上述五株细胞,通过MTS法测定不同MOI的腺病毒对各株细胞的转染效率,以找到不同细胞的最适感染滴度。rAd-hTERT-ODC/SAMDC分别以最适感染滴度感染人肺癌细胞系A549、人肝癌细胞系Bel-7402、HepG2及正常细胞系人胚肺成纤维细胞HELF、人肝细胞LO2。(2)采用Western-blot技术检测重组腺病毒感染细胞后,ODC和SAMDC蛋白表达情况。(3)采用MTS实验检测重组腺病毒对各株细胞增殖的抑制作用。(4)采用流式细胞术检测重组腺病毒对各细胞周期分布的影响。(5)采用Matrigel侵袭实验分析重组腺病毒对肿瘤细胞侵袭活性的影响。【实验结果】(1)腺病毒对A549细胞的最适感染滴度为50MOI,对其它细胞为25MOI。分别以该MOI的重组腺病毒感染A549、Bel-7402和HepG2肿瘤细胞可明显抑制其生长增殖,最大抑制率分别为65%、62%和55%;但对HELF和LO2正常细胞抑制生长作用不明显。(2)腺病毒感染肿瘤细胞后,可明显抑制ODC和SAMDC基因表达。rAd-hTERT-ODC对A549、Bel-7402和HepG2肿瘤细胞中ODC的抑制分别达50%、60%、50%,rAd-hTERT-SAMDC对SAMDC的抑制可达40%、50%、40%。两种重组腺病毒对正常细胞内的ODC和SAMDC均未见有明显抑制作用。(3)流式细胞DNA含量分析显示,两种重组腺病毒可引起肿瘤细胞周期阻滞于G_0-G_1期,但并未引起明显凋亡。对于正常细胞,rAd-hTERT-ODC和rAd-hTERT-SAMDC组与rAd-GFP组、PBS组未见明显改变。(4) Matrigel侵袭实验显示,重组腺病毒可显着抑制体外肿瘤细胞的侵袭能力。【结论】两组重组腺病毒rAd-hTERT-ODC、rAd-hTERT-SAMDC分别能有效抑制肿瘤细胞中ODC和SAMDC基因的表达,使细胞周期阻滞于G_0-G_1期,抑制肿瘤细胞的增殖活性,并明显抑制肿瘤细胞的侵袭活力。而对于正常细胞却没有明显抑制作用。从而初步证明rAd-hTERT-ODC、rAd-hTERT-SAMDC通过靶向性的抑制肿瘤细胞中多胺的合成,目的性抑制肿瘤的生长;重组病毒对于正常细胞却是相对安全的。
赵鹏[4]2012年在《全反式维甲酸及硒联合氧化苦参碱干预大鼠肝癌变进程中端粒酶逆转录酶及体征的动态变化》文中进行了进一步梳理目的：探讨SD大鼠在肝癌变进程中及在全反式维甲酸（all trans retinoic acid，ATRA）和硒(selenium，Se)分别联合氧化苦参碱（oxymatrine，OMT）的干预下，大鼠的体征指标以及端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）在肝组织中的动态变化。为研究肝癌发生发展的分子机理及寻找新的肝癌治疗药物提供参考依据。方法：以二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DENA)为诱癌剂，建立大鼠肝癌变不同时期的动物模型，同时对其分别用OMT+ARTA和OMT+Se进行药物干预，自诱癌之日起，分别在2、4、6、8、10、12、14、16、18w处死大鼠取其肝脏，通过组织石蜡切片、免疫组化和免疫印记法（Western blot），探讨大鼠肝癌演进及药物干预过程中，大鼠肝脏TERT的表达变化情况。结果：①病理结果：诱癌组大鼠在2-4w多呈轻度炎性反应（mild inflammatoryreaction，MIR），6-8w出现重度炎性反应(severe inflammatory reaction，SIR)，10-12w多呈腺瘤样增生(adenomatous hyperplasia， AH)，14-16w以非典型腺瘤样增生(atypical-adenomatous hyperplasia，AAH)为主，16-18w开始出现胆管上皮癌(cholangiocellular carcinoma，CCC)。②免疫组化：两个干预组与诱癌组TERT的阳性率均显着高于对照组，整个癌变进程中对照组TERT几乎无阳性表达；OMT+ATRA干预组于AH和AAH期的TERT阳性率均显着低于诱癌组（P<0.05）； OMT+Se干预组TERT的阳性率于AH期显着低于诱癌组（P<0.05），AAH期极显着低于诱癌组（P<0.01）。TERT的特异性染色主要集中在胞浆，在AAH、CCC期也可见于胞核。③Western blot：在癌变进程中，对照组TERT蛋白的含量均处于极低的状态；诱癌组TERT的含量随诱癌的进行而逐渐升高；两干预组TERT的含量在整个癌变进程中均低于诱癌组，至AH期两干预组均显着低于诱癌组（P<0.05）；AAH期时，OMT+Se组TERT的表达量显着低于诱癌组（P<0.05），OMT+ARTA组与诱癌组之间无明显差异。结论：DENA诱发大鼠肝癌变进程中，TERT的表达逐渐升高。OMT+ARTA和OMT+Se的干预可使TERT在AH和AAH期的表达降低，提示OMT、ARTA及Se的联合使用可在一定程度上抑制TERT的表达，减缓肝癌变进程，提高生存质量及存活率。
韩明鲲[5]2005年在《人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子的克隆及其在喉癌基因治疗中的意义》文中研究表明目的:1、克隆人端粒酶催化亚基(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因的核心启动子,并构建hTERT基因核心启动子调控的荧光素酶报告载体,检测其在肿瘤细胞和正常细胞中表达的差异。2、将HSV-tk基因定向插入到hTERT基因核心启动子下游,检测HSV-tk基因是否在肿瘤细胞中特异性表达。 方法:提取人HeLa细胞的基因组,利用PCR技术克隆hTERT基因的核心启动子。将其插入荧光素酶报告载体中,经限制性内切酶Sac Ⅰ、Hind Ⅲ酶切和PCR鉴定后,转染肿瘤细胞及正常细胞,观察两种细胞中荧光素酶基因表达的差异。以含有HSV-tk基因cDNA全长的质粒pBluescript-tk为模板扩增出tk基因,在tk基因两端加入Xba Ⅰ和Nco Ⅰ酶切位点。用限制性内切酶Xba Ⅰ和Nco Ⅰ将hTERT核心启动子调控的荧光素酶载体中的荧光素酶切除,将tk基因连接于hTERT核心启动子的下游。转染喉癌细胞系Hep-2和正常肝细胞系7702,利用RT-PCR检测tk基因的表达。 结果:hTERT基因的启动子调控的表达载体在肿瘤细胞中呈高效表
袁平[6]2018年在《端粒酶逆转录酶启动子区多样性及ETV4在非小细胞肺癌中的研究》文中指出背景肺癌为近年来在世界范围内发病率高居第一位的恶性疾病,且为男、女性肿瘤致死的首要原因。由于肺脏为人体唯一暴露在外界环境下的内脏器官,居多证据证明肺癌的发生是在内源环境与外界因素的共同作用下多因素,多基因参与的演变过程。尽管肺癌在临床上十分常见,迄今为止尚未有明确的结论解释肺癌发病的分子机制。端粒是位于真核生物染色体末端长度约为8-20kb的重复序列DNA(TTAGGG)n及相关蛋白组成,主要功能包括保护染色体末端免于融合与降解、并且参与染色体的定位、复制。细胞中维持端粒长度的最主要途径是由端粒酶介导的。端粒酶是由蛋白质与RNA组成的具有逆转录酶活性的核糖核蛋白,具有维持染色体稳定性和完整性的作用,从而保证细胞的正常增殖。目前认为端粒酶的核心部件为端粒酶逆转录酶(TERT,telomerase reverse transcriptase),该酶为维持端粒酶活性的最主要核心物质。TERT启动子区基因的多样性可改变TERT的表达水平,该启动子区转录起始位点上游360bp内的突变可形成Ets/TCF结合序列,对于Ets转录因子家族蛋白具有较高的结合亲性,从而增加TERT的转录水平。ETV4是Ets转录因子家族成员中多瘤病毒增强子3基因(PEA3,Polymoma virus enhancer-3)的成员之一,该因子过表达可导致正常细胞发生恶变,从而增强肿瘤细胞的侵袭与转移能力,但该基因作为Ets家族转录因子对于肺癌的作用尚未了解透彻第一部分:端粒酶逆转录酶启动子区多样性在非小细胞肺癌中的研究研究目的:探讨在非小细胞肺癌(NSCLC,Non-small Cell Lung Cancer)患者肿瘤中TERT启动子突变以及位于启动子区域中rs2853669单核苷酸多态性(SNP,Single Nucleotide Polymorphisms)对TERT mRNA表达及端粒长度的影响,同时分析TERT启动子序列的多样性与表皮生长因子受体(EGFR,Epidermal Growth Factor Receptor)突变的交互作用对TERT mRNA的表达、端粒序列长度以及患者预后的关系。研究方法:1.用聚合酶链式反应(PCR,Polymerase Chain Reaction)对患者肿瘤组织中TERT启动子区以及EGFR第18,19,20,21外显子进行扩增,用Sanger测序法对扩增产物进行测序。2.采用荧光定量PCR检测患者肿瘤组织中TERT mRNA的表达水平,用单色多重荧光定量(MMQPCR,Monochrome multiplex quantitative PCR)检测患者肿瘤细胞中的相对端粒长度。3.建立数学模型分析启动子区的多样性与端粒酶逆转录酶表达水平和端粒序列长度的关系,并探索分析端粒酶启动子多样性在表皮生长因子受体突变的情况下对端粒酶逆转录酶与端粒序列长度的关系、端粒序列长度以及患者生存的影响。结果:1.TERT启动子区多样性检出率250例患者中有11例患者(4.4%)携带经典TERT启动子区变异。其中包括距离转录起始位点-146位置突变(-146C>T)4例,距离起始位点-124位置突变(-124C>G)2例。此外还包括-166-167CC>AA突变两例,-189G>A突变两例,-173+C—例。与端粒酶启动子区未发生突变的患者相比,产生突变患者的TERT mRNA表达水平较高(P=0.021),且肿瘤组织细胞中相对端粒长度较长(P=0.039)。2.SNPrs2853669的分布情况与临床特征比较在所检测的250例患者中,共有142名患者携带rs2853669 SNP,其中包括杂合子T/C序列携带者106名,纯合子C/C序列携带者36名。另外108名患者为非rs2853669SNP携带者(T/T)。rs2853669 SNP组间比较显示T/T携带者肿瘤最大长径较大(P=0.025)且多数属于T分期较为晚期的肿瘤(P=0.011)。分析显示携带T/T的肿瘤细胞中TERTmRNA表达水平较高(P=0.005)。3.rs2853669 SNP与EGFR突变的关系T/C携带者EGFR突变产生比率较高(37.7%)(P=0.003)。C/C携带者EGFR突变率最低(16.7%)。其中第19外显子,20外显子突变在T/C携带者中的突变率最高(P=0.033)。4.EGFR突变与rs2853669对TERT mRNA与相对端粒序列长度的影响T/C携带者的病理标本中TERTmRNA表达量最高,其次为T/T携带者(Pc/c Vs.T/C<0.01,PC/CVS.T/T=0.043)。在EGFR未突变的情况下该差异的统计功效更为明显 P C/C Vs.T/C<0.001,PC/c Vs.T/T=0.032)。在EGFR突变的情况下,只有T/C序列携带者的端粒酶逆转录酶mRNA表达量高于T/T序列携带者(P=0.023)。杂合子T/C序列携带者肿瘤中相对端粒长度最长但差别未能达到统计学意义(PT/C VS.T/T=0.052,PT/C vs.c/c=0.071)。然而该差异在EGFR未突变的患者中具有统计学意义(PT/C VS.T/T=0.039,PT/C VS.C/C=0.039)。5.EGFR突变与rs2853669 SNP的交互关系对NSCLC患者生存的影响携带杂合子T/C与纯合子T/T,C/C的NSCLC患者的生存期中位数分别为(64.74+3.1)月,(80.02+2.4)月与(76.3+2.4)月,且存在显着性差异(P=0.001),无病生存期分别为(65.7+3.1)月,(81.3+2.4)月与(74.9+2.8)月,同样存在显着性差异(P=0.027)。且这种差异只会出现在EGFR为发生突变的患者组中。在EGFR突变的患者中,总生存期与无病生存期未出现显着性差异。结论:1.TERT启动子突变与rs2853669 SNP可调节端粒酶逆转录酶mRNA的表达并且对相对端粒长度有影响。2.TERT启动子突变与rs2853669 SNP可影响NSCLC患者的总生存率与无病生存率。3.rs2853669SNP对端粒生物学的调节受患者EGFR突变状态的影响。第二部分:ETV4蛋白下调抑制非小细胞肺癌增殖机制的研究研究目的:采用荧光定量PCR检测NSCLC患者癌与癌旁组织标本中ETV4的表达水平,在体外实验中下调非小细胞肺癌细胞系中ETV4的表达,观察细胞的增殖情况,并对可能的分子机制进行探索研究。研究方法:1.用定量PCR分析76名非小细胞肺癌患者癌与癌旁组织中ETV4的表达差异,以及TERT启动子突变与rs2853669对ETV4表达的影响。2.人为下调NSCLC细胞系中ETV4的表达,观察其对细胞系增殖与TERT的影响。3.体用蛋白质印记技术、流式细胞仪探究ETV4下调抑制细胞增殖的机制结果:1.癌组织与癌旁组织相比ETV4表达量较高(P=0.001),携带TERT启动子突变的患者ETV4表达量相对较高(P=0.08),携带rs2853669 TC(P<0.01)与TT(P=0.072)等位基因的患者ETV4表达量较高。2.下调H661,HCC827与A549细胞系中ETV4表达后细胞增殖受到抑制且导致G0/1期细胞周期阻滞;下调ETV4后H661与A549细胞中cyclinD1、cyclinD3、CDK4余P21蛋白以及磷酸化erk有所下调(P<0.05)。3.下调H661与HCC827细胞中ETV4表达后TERT的表达也有所下调(P<0.05);在A549细胞中沉默ETV4后可下调AP-1家族蛋白LEF-1、β-caterin与J-Jun的表达水平。结论:1.非小细胞肺癌组织相对癌旁组织ETV4表达量显着升高。TERT启动子突变携带者与rs2853669 SNP TC与TT等位基因携带者呈高表达ETV4。高ETV4与较大的肿瘤最大长径与淋巴结转移有统计学相关意义。2.体外实验表明下调ETV4的表达水平可通过引起G1/G0期细胞周期阻滞,该周期阻滞可能是由激活erk通路对周期蛋白相关底物进行去磷酸化而导致的。3.下调ETV4的表达水平可同时下调AP-1转录家族基因,提示在非小细胞肺癌中,Ets转录家族ETV4与AP-1转录家族基因之间存在相互调节作用,从而对TERT的表达可能存在共性调节作用。
周希[7]2018年在《人端粒酶逆转录酶下调p53抑制胃癌细胞铁死亡的机制研究》文中进行了进一步梳理目的:研究人端粒酶逆转录酶h TERT在胃癌细胞中调控铁死亡的作用及分子机制。方法:1.以人胃癌细胞株为研究对象,erastin作为铁死亡诱导剂,在五株胃癌细胞SNU-1、SGC7901、MGC803、AGS、MKN45细胞中建立肿瘤细胞铁死亡模型。用erastin以一定的浓度梯度:1u M,2.5u M,5u,10u M,15u M,20u M,40u M处理胃癌细胞24小时,用CCK-8检测生长抑制率,通过q-PCR检测五株胃癌细胞内h TERT、SLC7A11、GPX4的表达确定后续实验研究对象为SNU-1和SGC791这两株胃癌细胞。2.为研究erastin杀死肿瘤细胞是否是通过诱导铁死亡,用erastin 20u M处理SNU-1,SGC7901两株胃癌细胞,通过透射电镜成像观察细胞内线粒体的变化以及其它亚细胞器的变化。分别用铁死亡抑制剂Fer-1,凋亡抑制剂Z-VAD-fmk,坏死抑制剂necrosttin-1,自噬抑制剂3-MA和erastin共处理细胞24小时,通过CCK-8检测生长抑制率,GSH检测试剂盒检测细胞内谷胱甘肽含量,MDA试剂盒检测细胞内脂质过氧化情况。3.研究h TERT铁死亡时,首先通过GEO数据库分析在胃癌中,h TERT和GPX4的表达相关,并用erastin刺激两株胃癌细胞后提取蛋白进行h TRET蛋白检测。通过构建h TERT稳定过表达细胞株lenti-h TERT-SNU-1/lenti-NC-SNU-1;lenti-h TERT-SGC7901/lenti-NC-SGC7901。用erastin(20u M)处理细胞24小时后,CCK-8检测生长抑制率,Western blot检测细胞内h TERT、p53、SLC7A11、GPX4的表达,q-PCR检测p53的表达。用蛋白酶体抑制剂MG123和erastin共处理细胞,检测细胞内p53蛋白水平。4.为研究h TERT促进p53蛋白降解是否通过MDM2,构建了Si-h-MDM2序列干扰MDM2表达,在erstin处理后检测细胞内p53蛋白水平。5.用Graph pad Prism 6.0数据分析实验结果,p值小于0.05有意义。结果:1.Erastin处理五株人胃癌细胞后后CCK-8检测到细胞的生长抑制率不同,其中SNU-1和SGC7901胃癌细胞在erastin处理24小时后生长抑制率较高,q PCR检测到在SNU-1、SGC7901中SLC7A11、GPX4表达较低。2.erastin诱导SNU-1、SGC7901胃癌细胞的铁死亡。erastin处理24小时后透射电镜成像提示细胞内线粒体缩小,线粒体膜密度增加了。erastin+铁死亡抑制剂fer-1组生长抑制率较erastin组低,细胞内GSH含量较erastin组高,MDA水平较erastin组低。3.通过数据库分析,h TERT和GPX4在在胃癌中基因表达相关系数为0.22,p值小于0.0001。erastin处理后的细胞内h TERT蛋白水平上调。4.h TERT稳定过表达于SNU-1、SGC7901胃癌细胞中,过表达组SNU-1细胞较对照组在erastin处理24h后生长抑制率低。SGC7901过表达组细胞和对照组差异无统计学意义。在h TERT过表达的SNU-1胃癌细胞中,细胞在erastin处理后p53蛋白水平下调,m RNA水平无变化。SLC7A11和GPX4蛋白水平上调,而SGC7901细胞中较对照组差异无统计学意义。MG132抑制剂处理后过表达h TERT的SNU-1胃癌细胞内p53蛋白水平上调。4.h TERT和MDM2共定位于细胞核中,干扰lenti-h TERT-SNU-1细胞中MDM2表达后,细胞内p53蛋白水平回复。结论:erastin可诱导人胃癌细胞SNU-1、SGC7901铁死亡,h TERT通过泛素-蛋白酶体途径依赖MDM2促进p53蛋白降解,从而抑制SNU-1、SGC7901胃癌细胞铁死亡。
参考文献：
[1]. 端粒酶逆转录酶及其相关基因表达与肝细胞癌细胞凋亡、增殖关系的实验研究[D]. 李松岗. 浙江大学. 2003
[2]. 人端粒酶逆转录酶启动子驱动重组腺病毒治疗人前列腺癌的动物实验研究[D]. 齐进春. 河北医科大学. 2006
[3]. 人端粒酶逆转录酶启动子（hTERTpromoter）介导的ODC、SAMDC反义腺病毒的构建及其靶向抗肿瘤研究[D]. 王伟. 山东大学. 2009
[4]. 全反式维甲酸及硒联合氧化苦参碱干预大鼠肝癌变进程中端粒酶逆转录酶及体征的动态变化[D]. 赵鹏. 河南师范大学. 2012
[5]. 人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因启动子的克隆及其在喉癌基因治疗中的意义[D]. 韩明鲲. 第四军医大学. 2005
[6]. 端粒酶逆转录酶启动子区多样性及ETV4在非小细胞肺癌中的研究[D]. 袁平. 浙江大学. 2018
[7]. 人端粒酶逆转录酶下调p53抑制胃癌细胞铁死亡的机制研究[D]. 周希. 西南医科大学. 2018
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