（遵义医学院附属口腔医院 贵州 遵义 563003）
【摘要】 诊断牙周疾病的传统方法，包括临床指标的检查和生化指标的检测。生化指标可以弥补临床指标检查的低敏感性。检测龈沟液中的弹性蛋白酶，可以早期发现并诊断牙周炎。本文综述了龈沟液中的弹性蛋白酶与牙周炎的诊断。
【关键词】 牙周炎；龈沟液；弹性蛋白酶
【中图分类号】R781.4 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）08-0011-03
The research progress of diagnosis of periodontitis and gingival sulcus elastase in a liquid Zhang Dan, Zhang Qiangtao. Stomatological Hospital Affiliated to Zunyi Medical College, Guizhou Province, Zunyi 563003, China
【Abstract】The traditional method of diagnosis of periodontal disease, including clinical index of examination and biochemical indicators of detection. Biochemical indicators can make up for low sensitivity of clinical indicators to check. Detection of gingival sulcus of elastase, liquid can be early detection and diagnosis of periodontitis. This paper reviews the gingival sulcus elastase in the liquid and the diagnosis of periodontitis.
【Key words】 Periodontitis; Gingiva groove liquid; Elastase
牙周炎是指牙齿支持组织发生的慢性、非特异性、感染性的炎性疾病。牙周炎的发展进程表现为活动期和静止期的交替出现，临床很难早期区分活动期和静止期，而明确牙周炎的活动期对于研究牙周病的发病机制，指导牙周炎的临床治疗及预后具有重要的意义。诊断牙周疾病的传统方法包括临床指标的检查和一些生化指标的检测。临床指标进行检查包括：(1)牙周袋探诊深度(PD)，(2)牙龈指数(GI)，(3)临床附着水平(CAL)，(4)X线检查牙槽骨吸收情况，（5）牙齿的松动度等[3-5]。这些反映牙周炎处于活动期的临床检查早已得到众多学者的认可, 但是临床检查量化程度较差、主观性强，敏感性低，常常在发生了牙槽骨严重破坏和附着丧失明显后才得以确定，但这时活动期已经过去。因此，以临床检查指标诊断牙周炎或评价牙周炎的治疗反应，虽然有效，但既不易早期发现并诊断牙周炎，又不易发现高危病人牙周炎复发的早期征象。一些文献报道生化指标的检查可以弥补临床指标检查的低敏感性，便于早期发现并诊断牙周炎，比如检测龈沟液中的弹性蛋白酶可以早期发现并诊断牙周炎[2-3]。本文拟就龈沟液中弹性蛋白酶与牙周炎的诊断做一综述。
1.弹性蛋白酶
1.1 龈沟液中弹性蛋白酶的特点
弹性蛋白酶是一种中性的丝氨酸蛋白酶（肽链内切酶），储存在粒细胞的嗜天青颗粒，数量为每个细胞三皮克。在人体组织包括牙周组织中，弹性蛋白酶具有降低大量各种分子生物学活性的能力，这些分子包括胶原，层连蛋白，纤连蛋白，蛋白聚糖和弹性蛋白[4]。弹性蛋白酶在牙周病的早期起着独特的作用，这种作用和胶原酶破坏完整的非胶原蛋白作用相反。在健康的牙周组织中，这些蛋白包绕胶原纤维以防止被胶原酶破坏[5-6]。
在组织损伤或细菌感染的情况下，中性粒细胞释放的很多种的蛋白水解酶，而弹性蛋白酶是其中的一种水解酶。弹性蛋白酶以酶原或活化酶的形式存在于粒细胞的颗粒中，但是他们活化的机制仍不是完全清楚。在细胞外，弹性蛋白酶的活性主要被中性粒细胞产生和释放的丝氨酸蛋白酶抑制剂-α1抗胰蛋白酶控制[7]。
龈沟液中的弹性蛋白酶主要从站到细胞总数约95%～98%的中性多形核白细胞释放，7.5～8.5为其适宜的PH值，有着广泛的生物性底物，包括纤维蛋白、弹性蛋白、免疫球蛋白、I-IV型胶原、一些补体等等[8-9]。龈沟液中的弹性蛋白酶只要是由PMN所释放的，他的水平与PMN的数量成正比，所以，龈沟液弹性蛋白酶的活性可以作为PMN局部浸润的指征。中性多形核白细胞弹性蛋白酶参与牙周组织的更新和代谢，刺激淋巴细胞提高自然杀伤细胞的攻击力，并且在有氧的条件下辅助并且增强MPO-H202-卤化物系统杀菌的性能[10-11]。如果局部释放过多或者一直不足，则会破坏上皮结构的基底膜[12]。
1.2 龈沟液中弹性蛋白酶的来源
从炎性牙龈组织移出转移到龈沟内是龈沟液中的弹性蛋白酶的主要来源[13]。Cox等[14-15]的研究结果表明，用离心的方法去除龈沟液中细胞可以明显降低龈沟液中弹性蛋白酶的活性，但是将细胞溶解后可以明显提高龈沟液中弹性蛋白酶的活性。这表明，龈沟液中的弹性蛋白酶主要来源于移出到龈沟内的PMNs，而不是组织中的弹性蛋白酶流出形成。龈沟液中常常含有活性的弹性蛋白酶，这可能是因为移出的的PMNs活性比较高或者是龈沟中的抑止因子相对比较缺乏[16]。牙周袋或者临近牙周袋壁中的炎症细胞或者细胞直接释放蛋白酶可能会造成龈沟液中的酶和抑止因子之间的失衡，特别是在疾病的活动期。炎症的过程中，PMN不停的从炎性龈组织移到牙周袋或者龈沟内，导致龈沟液中大量的PMNs集聚并且释放弹性蛋白酶，这也许也是牙龈中和龈沟液中弹性蛋白酶的水平不同的一个原因[17]。
1.3 龈沟液中弹性蛋白酶的洗提和保存
由于酶是一种生物催化剂，它的活性可能会受到各种生化因素的影响。包括温度、样本保存时间、洗提方法、样本状态、光线等[18]。实验表明，洗提方法“震荡+离心”的方法明显优于单纯的“震荡法”，洗提后龈沟液中的弹性蛋白酶的回收率提高。-20℃和-70℃保存样本中的弹性蛋白酶活性虽然没有明显差异，但是-20℃仍然有略高于-70℃的倾向，而且-20℃比-70℃下保持弹性蛋白酶的时间要略长一些[19]。
1.4 龈沟液中弹性蛋白酶的检测方法
目前检测弹性蛋白酶的主要有两种方法：免疫反应法、底物检测法。其中，较为常用的为底物检测法。
1.4.1免疫反应法 通过抗原和抗体的反应，采取酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗原性弹性蛋白酶，不仅可以检测游离的弹性蛋白酶，还可以检测弹性蛋白酶和其另外一种内源性的抑制α1蛋白酶抑制剂的复合物,此复合物不具有弹性蛋白酶的活性作用[20]。
1.4.2底物检测法 利用弹性蛋白酶降解中性蛋白这一特点，使其与低分子量产色或荧光底物反应，用荧光光度计或者分光光度计测定。用这个方法测定的是有活性的功能性弹性蛋白酶。早期多采用天然谷物，但是特异性较低，常常受到其他中性蛋白酶作用的干扰。后来出现了一些人工合成的化合物，比如:Meosuc-ala-pro-val-NA（或AFC）和L-pyroglutaryl-L-pro-val-NA。他们都是人工合成的低分子量化合物（分别是627.69Da和445.5Da）。末端基团-AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素) 敏感度最高,但是具有合成困难、成本较高的缺点。但是末端基团为一NA(4-硝酞基苯胺)时，敏感性中等，但是合成较易， 特异性强。只与人PMN-EA发生反应，而不易被口腔内细菌分解，适用于临床广泛应用[21-22]。
2.弹性蛋白酶与牙周炎
已经有多名学者的研究证实龈沟液中弹性蛋白酶水平的升高与牙周组织的破坏和炎症的加重有关，龈沟液弹性蛋白酶的活性和牙周的炎症程度和附着丧失的程度呈正相关[23-26]。牙周炎患者通过严格正规的牙周治疗后龈沟液中弹性蛋白酶的水平明显下降[25][27-32]。Gustaffson等[27]发现在相同牙龈炎症程度的情况下，牙周炎位点的的弹性蛋白酶的水平要远远高于牙龈炎位点的水平，这提示我们龈沟液中弹性蛋白酶的水平和牙周组织破坏的程度密切相关。Ingman等[32]研究发现青少年牙周炎龈沟液中弹性蛋白酶的水平明显高于健康的对照组，但是明显低于成年人牙周炎组，导致这种情况的原因可能与局部组织中PMN的功能低下有关系，但是由于实验的样本量较少，所以还缺乏足够的证据证明。
龈沟液中弹性蛋白酶的水平和临床指标的正相关可以作为判断疗效的客观指标[33-34]。对于处在治疗维护期患者的五年检测表明，相同的炎症及破坏程度，治疗效果差得位点比效果好的位点弹性蛋白酶水平高，这个研究有助于发现难治性的牙周炎高危病人[34]。
Palcanis等[35]研究发现，通过纵向观察6个月，利用弹性蛋白酶预测骨丧失和附着丧失的特异性和敏感度分别是是66%和84%。Armitage的研究也显示出类似的结论[36]。Eley[37]等人通过两年的纵向研究发现，弹性蛋白酶水平为400U/L和125μU/30s时，特异性为分别为99.91%、100%，敏感度分别为99.95%、100%。但是Nakashima[38]等人认为龈沟液中弹性蛋白酶不能单独作为预测附着丧失的指标，应该要和其他的生化指标结合起来，比如：胶原酶、前列腺素E2、骨钙素等，但是生化指标检测的特异性和敏感度也仅仅为80%、91%。
康军等[39]研究显示，AgP组探针深度和附着丧失都高于CP组，龈沟液中弹性蛋白酶的活性也较高，差异有统计学意义（P＜0.01）。从CP组和AgP组选择位点只有附着丧失有差异，即使其他的临床牙周指标匹配的患者，龈沟液弹性蛋白酶活性AgP组也高于CP组（P＜0.01），表明龈沟液中弹性蛋白酶的活性虽然可以在一定程度上反应牙龈炎的炎症状态，但更是牙周组织破坏严重程度的客观反映。对于判断牙周组织破坏的程度、检验牙周治疗的效果、预测将来发生附着丧失的情况具有指导意义，并且有可能成为牙周炎活动期的诊断指标。
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论文作者:张丹（综述）,张彊弢（审校）
论文发表刊物:《医药前沿》2016年3月第8期
论文发表时间:2016/5/13
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