蔡文旋[1]2008年在《苏云金芽孢杆菌WB7几丁质酶定点突变研究》文中提出几丁质是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(NAG)以β-1,4糖苷键连接而成的直链状高分子生物多聚体,是昆虫表皮、骨骼及中肠围食膜的组成成分。几丁质酶可催化降解几丁质的β-1,4糖苷键,破坏昆虫围食膜并干扰昆虫的生长发育,所以引起人们的重视。本研究通过对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)WB7菌株几丁质酶催化区的活性位点进行定点突变实验,构建了12个突变体pET-F201L、pET-F201Y、pET-G203A、pET-G203D、pET-D205E、pET-D205N、pET-D207E、pET-D207N、pET-W208C、pET-W208R,pET-E209D和pE%E209Q,从而研究酶活性中心功能基团在酶催化中的作用机制。结果表明,突变体pET-F201L、pET-G203D、pET-D205N、pET-D207E、pET-D207N、pET-W208C和pET-E209D在各测活条件下均完全失活,而pET-F201Y的酶活力下降了72%,pET-G203A酶活力下降了70%,pET-D205E酶活力是野生型的52%,pET-W208R的酶活力是野生型的69%,pET-E209Q的酶活力是所有突变体中最高的,是野生型的71%。pH-酶活曲线表明,pET-F201Y、pET-G203A与pET-D205E作用的pH范围变窄了,与野生型相比,pET-D205E的有效pH范围缩小了一个单位,而pET-F201Y与pET-G203A则缩小了2个单位。几个仍有酶活的突变体及野生型几丁质酶作用的最适pH均为8.0。从温度-酶活曲线可以看出,突变体pET-G203A的热稳定性下降了,其作用的最适温度为50℃,当温度达到60℃时,酶活急剧下降,而野生型几丁质酶及其它突变体作用的最适温度为60℃,当温度达到70℃时,酶活迅速下降。G203在几丁质酶催化中的作用可能是维持蛋白质的叁维结构;D207可能在反应过程中离子化,其所带的负电荷通过形成一对离子对,从而使反应过程中生成的带正电荷的唑啉中间物保持稳定状态;而D205与D207可能通过氢键结合,这种氢键主要用于维持活性中心的离子化状态;W208可能通过“堆积效应”和氢键作用与底物结合,若被其它氨基酸取代后,很可能会影响到酶对底物的识别与结合,进而影响酶活;E209很可能作为一种广义酸,用于提供质子,它可能参与了催化机制中的第一环节也是最关键的一个环节,就是糖苷键的质子化作用,同时也参与了第二步,也就是作为质子受体,从水获得质子;F201作用机理目前尚不清楚。
伍赠玲[2]2004年在《苏云金芽孢杆菌WB50菌株vip3A基因和几丁质酶基因的定位》文中提出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)是研究最为深入、使用最为广泛的一种杀虫微生物，在生物防治中占有极其重要的地位。营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins，VIPs)是一种在对数生长期分泌的活性蛋白，主要分为VIP1、VIP2和VIP3叁类，其中，VIP3A对鳞翅目昆虫具有较广谱的杀虫活性，甚至能毒杀一些对Bt杀虫晶体蛋白有很强抗性的昆虫。几丁质酶能够分解作为真菌细胞壁和昆虫围食膜主要成分的几丁质，具有重要的生防价值。研究苏云金杆菌VIP3A、几丁质酶对开发Bt新资源、改良Bt制剂具有重要意义。 Bt基因定位研究可以拓宽Bt杀虫谱，增强杀虫活性。确定了基因在基因组中的位置后，即可对该基因所在的质粒或染色体进行限制性酶谱的构建以及全序列的测定，有助于发现新的基因、研究基因之间的互作关系和表达调控机制。 本研究对Dt编码VIP3A、几丁质酶的基因进行了克隆和定位。主要研究结果如下： 一、对常规的叁种提取Bt质粒DNA的方法进行了比较。煮沸裂解法提取的质粒DNA杂质多，只能作为粗略检测的模板；BGSC法适合于提取分子量较大的质粒DNA；用常规碱裂解法所得的质粒DNA条带不全，大质粒缺失，且重复性差，不适合作Southern杂交的模板DNA。本研究摸索出一种适合于提取Bt质粒的改良碱裂解法，该法提取的质粒DNA条带清晰、无拖尾，谱带齐全，且质粒DNA纯度高，产物可直接用于限制性内切酶消化、PCR扩增等分析，满足Southern杂交的对模板纯度较高的要求。 二、克隆了WB50的vip3A基因并在GenBank上登录(登录号AY295778)。根据GenBank上已知的Bt vip3A基因序列(登录号：L48811)，设计出扩增vip3A基因的一对含NotⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物VCL1／VCL2，以WB 50的质粒DNA为模板，利用PCR扩增出vip3A基因序列。将PCR产物纯化回收后连接到克隆载体pMD18-T上，用CaCl_2转化法导入到受体菌Escherichia coli JM109中，福建农林大学硕士学位论文摘要在x一gal、IPTG平板上挑选若干个白色菌落，进行限制性酶切和PCR分析，验证阳性克隆子并测序。测序结果经在线的Blast软件进行同源性分析表明:与其高度同源的基因均为人尸3A基因，同源性高达99%以上，该基因在GenBank上的登录号为AY295778。 叁、WB50菌株v动刘基因定位。WB50菌株的v勿3A基因是从质粒DNA中克隆得到的，初步推测viP剑基因定位于质粒上。为进一步验证此推测以及精确定位该基因，将质粒DNA各条带纯化、回收，PCR分别扩增F劫3A基因，结果表明，叮刀别基因不定位在小于23kb的质粒上。以染色体DNA为模板进行PCR扩增，未得到目的片段，确定染色体DNA不编码1材乡3A基因。以F动3A基因468 bp的片段作探针，对WB50的质粒和染色体DNA进行Southern杂交，结果表明，该基因定位于31.8 kb的质粒上。 四、WB50菌株chi基因定位。本研究从Bt菌株wB50的总DNA和染色体 DNA中扩增出几丁质酶基因(chi)，而用质粒DNA则无法扩增出该基因，将该基因初步定位于质粒外的遗传因子上。此外，采用chi基因片段作探针，对WB50菌株的DNA样品进行Southem杂交，进一步精确定位该基因在染色体上。
颜聪毅[3]2008年在《南海海域苏云金芽孢杆菌的分离筛选和产几丁质酶条件初探及一株几丁质降解菌的鉴定》文中进行了进一步梳理苏云金芽孢杆菌(Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,它产生的杀虫晶体蛋白是巨大的天然害虫生防资源,对多个目的害虫具有杀虫活性;而几丁质酶(chitinase)作为一种重要的杀虫活性物质,具有多种富有价值的生物学功能,它们在生物防治、环境保护等方面都具有重要的社会效益和经济价值。因此,开展新型苏云金芽孢杆菌资源的分离筛选、鉴定、分子生物学以及产几丁质酶相关条件的研究都具有重要意义。海洋环境的特殊性往往造就了海洋微生物及其代谢产物的多样性,因而是人们寻找与发现活性物质产生菌的重要场所。本研究采用醋酸钠法加热处理,对南海吕宋、越南上升流区所采集的水体和沉积物样品进行了分离筛选,共得到22株苏云金芽孢杆菌菌株,在扫描电镜下观察,发现除两株伴孢晶体形状为菱形外,其余的均为球形晶体。通过透明光圈法,在以胶体几丁质为唯一碳源的无机盐培养基上,筛选出一株产几丁质酶活性较高的菌株B-19,并对其产酶特性及温度、碳源、氮源等、pH值等产酶条件的优化进行了初步研究。经过一系列的研究,苏云金芽孢杆菌B-19确定了较适宜的产酶条件:培养基中添加1%酵母粉,2%胶体几丁质,初始pH为7.0,培养温度为30℃,最佳培养时间为36h,摇床转速160r/min。Mg~(2+)、Ca~(2+)、Li~+和Ni~(2+)等金属离子对几丁质粗酶液有明显的激活作用,而K~+、Zn~+等离子对酶活有抑制作用。在此优化条件下,苏云金芽孢杆菌B-19发酵液的几丁质酶活力提高了大约200%。几丁质酶是一种诱导酶,几丁质是它的诱导物,而几丁单糖(N-乙酰氨基葡萄糖,NAG)和葡萄糖(glucose)阻遏几丁质酶的产生。这些研究的初步结果为以后海洋环境中苏云金芽孢杆菌的分离筛选、鉴定和产几丁质酶的研究和利用奠定了基础。此外,我们还从沉积物样品中筛选出一株几丁质降解菌B-Y20,经生理生化试验及16S rDNA分子鉴定,确定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),为人们今后对海洋微生物特别是深海环境中几丁质降解菌的开发和利用提供新的菌种资源基础。
罗朝辉[4]2007年在《苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因与烟草几丁质酶tchiA21基因的重组表达及功能研究》文中提出苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物，苏云金芽孢杆菌的杀虫活性主要来源于其在芽孢形成过程中产生的杀虫晶体蛋白，杀虫晶体蛋自结构和作用机制是目前国内外研究的一个热点；但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、毒力低等缺点，因此在了解杀虫晶体蛋白结构与功能关系的基础上，通过生物技术手段构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。本研究利用苏云金芽孢杆菌cry1Ac基因和烟草几丁质酶tchi21基因重组获得高效杀虫工程菌株XBU-HUAccB5。从研究室保存的菌株Bt 4.0718(CCTCC No.M200016)出发，通过设计引物Ac-F／Ac-R和ter-F／ter-R，以其质粒为模版PCR扩增cry1Ac基因及cry1Ac基因的终止子下游序列，设计引物chi-F／chi-R从含有烟草几丁质酶cDNA的质粒中PCR扩增tchi21基因，用NcoⅠ酶切上述两步的PCR产物，回收两个酶切片段进行连接，以连接产物为模板，用chi-F／ter-R引物对扩增融合chi-ter片段，利用构建含Bt 4.0718菌株的cry1Ac基因质粒pUAc19和融合chi-ter片段用BglⅡ和SmaⅠ酶切、回收、连接，构建中间载体质粒pUAccB19，同时将质粒pUAccB19和穿梭表达载体pHT315用SalⅠ／SmalⅠ酶切，回收其目的片段，构建表达载体质粒pHUAccB5，将表达载体pHUAccB5电转化无晶体突变株XBU001获得重组菌株XBU-HUAccB5。对工程菌株XBU-HUAccB5经SDS-PAGE和Western blotting分析：工程菌株分别表达了130 kDa的Cry1Ac蛋白，同时还表达了30 kDa的几丁质酶蛋白，经Western blotting检测，工程菌株XBU-HUAccB5的Cry1Ac蛋白和几丁质酶的表达得到证实，经原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)观察显示，工程菌株XBU-HUAccB5产生晶体蛋白呈有规则的菱形；在对发酵液的几丁质酶酶活性检测中，无晶体突变株在的酶活发酵过程中一直保持在1.5U／ml，工程菌XBU-HUAccB5的几丁质酶酶活一直呈上升的趋势，在72h时达到最高峰为7.5U／ml，是无晶体突变株的5倍，几丁质酶活变化趋势与工程菌的生长曲线一致。生测结果显示：工程菌HTX-42(cry1Ac单价基因转XBU001)对初孵棉铃虫(Helicoverpa armigera Hubner)在48h的LC_(50)是117.7780μg／ml，72h的LC_(50)是89.8691μg／ml；工程菌XBU-HUAccB5(cry1Ac与几丁质酶tchi21双价基因转XBU001)对初孵棉铃虫在48h的LC_(50)是10.4240μg／ml，72h的LC_(50)是4.7904μg／ml。工程菌XBU-HUAccB5比工程菌HTX-42对棉铃虫的生测毒力处理在48h时高11.30倍，在72h高18.76倍。结果表明在72h内随着时间的延长，几丁质酶协同Cry1Ac杀虫的效果越显着。本研究已成功构建cry1Ac基因和tchi21基因融合的Bt工程菌，这对进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株，研制出超效、广谱、安全的杀虫剂，以克服Bt杀虫剂存在的杀虫毒力低、易产生抗性等问题的研究提供了新的技术途径。
蔡亚君, 袁志明, 胡晓敏, 蔡全信[5]2011年在《苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达》文中研究表明从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因组DNA,通过PCR的方法克隆了几丁质酶chiAC基因(GenBank登录号为EF427670)。置换chiAC基因的启动子为T7启动子时,chiAC基因能在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达,并产生大小约70 kDa的表达产物。
李力[6]2001年在《苏云金芽孢杆菌几丁质酶的研究》文中提出苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是研究最深入、使用最广泛的一种杀虫微生物，在生物防治中占有极其重要的地位。几丁质酶（Chitinase，EC 3.2.1.14）能够分解作为真菌细胞壁和昆虫围食膜主要成分的几丁质，具有重要的生防价值。研究苏云金杆菌几丁质酶对开发Bt的新资源、改良Bt制剂具有重要意义。 从本室分离保存的64株苏云金杆菌中，利用几丁质平板筛选到4株能产几丁质酶的菌株。其中WB-50的几丁质酶活性最高。对它的产酶条件进行了研究，结果表明：在pH7.0的基础培养基中添加2.0％的细粉几丁质、1.0％的酵母膏，在220rpm、30℃条件下培养72h，几丁质酶的产出最大。 根据GenBank上登录的Bt subsp．pakistani的几丁质酶基因chi和Bacillus cereus的几丁质酶基因chiB序列的同源性，设计出可扩增部分几丁质酶基因的一对引物BFL1／BFL2，以WB-50的总DNA为模板，利用PCR扩增出部分几丁质酶基因序列。将PCR产物纯化回收后直接测序，经在线的Blast软件进行同源性分析表明：它与chiB的相应部分的同源性将近100％。根据这一结果，可利用引物BFL1／BFL2来鉴定Bt的几丁质酶基因，在所鉴定的另外22株苏云金杆菌中有18株具有几丁质酶基因。这个比例大大超过了利用几丁质平板筛选到产几丁质酶菌株的比例。再利用chiB基因序列设计出扩增全长几丁质酶基因的一对引物QCL1／QCL2，其中QCL1包含了BamHI的酶切位点，得到了包含全部氨基酸信息的几丁质酶基因，命名为chiA。Southern杂交证实了这一结果。利用PCR产物克隆载体pGEM-T easy vector与chiA连接，构建出重组克隆载体，定名为pT-CHI。再将pT-CHI用BamH I和EcoR I双酶切，与用相同酶切的原核表达载体pGEX-2T连接。重组质粒命名为p2T-CHI。在IPTG的诱导福建农林大学硕士学位论文下，pZT（HI的几丁质酶A与谷眺甘肋转移酶的融合基因得到了表达，SDS－PAGE实验证实了这一结果。
宋光明, 沈微, 孙金凤, 饶志明, 方慧英[7]2008年在《苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的分泌表达》文中提出[目的]研究来源于苏云金芽孢杆菌的几丁质酶基因chiA在枯草芽孢杆菌中的表达情况。[方法]以苏云金芽孢杆菌染色体DNA为模板,PCR扩增获取几丁质酶基因chiA,将其与枯草芽孢杆菌表达载体pHSG连接,构建重组菌,经IPTG诱导后,检测培养液中的几丁质酶活性。[结果]扩增得到几丁质酶基因chiA大小为2.5 kb。构建的重组菌对底物[4-MU-(GlcNAc)3]显示出一定的水解活性,培养液酶活约为2.8 U/ml,而pHSG空质粒转化子在同样条件下其培养液没有明显酶活。该重组酶的最适pH值为6.5,最适反应温度为50℃,与苏云金芽孢杆菌自身产生的几丁质酶性质一致。[结论]几丁质酶基因chiA能在枯草芽孢杆菌中成功表达,表达产物可成功分泌到细胞外。
卢伟, 赵秋敏, 陈艳玲, 韩苗苗, 蔡峻[8]2007年在《几丁质酶在苏云金芽孢杆菌中的分布及抑小麦赤霉菌菌株的筛选》文中研究表明利用几丁质平板法和几丁质酶基因特异引物 PCR 两种方法,对本室保藏的995株苏云金芽孢杆菌的几丁质酶及其基因进行了检测.结果显示所有被检测的菌株都可以在几丁质为唯一碳源的平板上生长.其中93.0%的菌株 PCR 检测阳性,54.1%的菌株可产生明显的水解圈.证明苏云金芽孢杆菌中几丁质酶普遍存在.通过研究发现 Bt 几丁质酶活力高低与其血清型及杀虫晶体蛋白基因的类型无相关性.同时对286个菌株进行了抑小麦赤霉菌实验,筛选出19株抑真菌效果较好的苏云金芽孢杆菌.
黄小红, 陈清西, 王君, 沙莉, 黄志鹏[9]2005年在《有机溶剂对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)几丁质酶的影响》文中研究指明以苏云金芽孢杆菌(Bt)的发酵液为材料,经硫酸铵分级分离、DEAE-32离子交换柱层析分离,获得部分纯化的Bt几丁质酶(EC3. 2. 1. 14)制剂.研究了几种有机溶剂对Bt几丁质酶的影响.结果表明,甲醇、丙叁醇、甲醛和戊二醛对几丁质酶有抑制作用;乙醇、丙醇、乙二醇和二甲亚砜在低浓度时对酶有激活作用,随着浓度的升高表现出抑制作用;二氧六环的浓度低于 5%时,对酶的影响不明显,而高于 5%时,对酶则有激活作用;丙酮对酶有激活作用. 图 1参 10
檀建新[10]2000年在《Bt cry基因克隆和环状芽孢杆菌几丁质酶的研究》文中认为苏云金芽孢杆茵产生的杀虫晶体蛋白对鳞翅目等多种害虫具有杀虫活性，几丁质酶对植物真菌病害有防治作用。本文从这两方面入手对苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因克隆、表达和环状芽孢杆菌几丁质酶进行了研究。以期为构建具有杀虫和抗病双重活性的工程菌或转基因植物提供科学依据和有效材料。1．苏云金芽孢杆菌C005是由湖北Bt中心提供的国内自行分离的对鳞 翅目害虫小菜蛾具高毒力的野生菌株，能产生双锥体晶体。PCR-RFLP 鉴定含有cry1Ab基因。以此菌株为出发菌株，PCR扩增产物为探针， 通过Southern blotting证明质粒的PstI酶切产物中8.5kb处有阳性杂 交带，利用PCR方法筛选转化子，克隆了含cry1Ab全长基因的8.5kb 大片段并测序。该基因编码区为3468bps，Cry1Ab13蛋白含1155个 氨基酸、分子量为130.6kDa，等电点为pH4.845。该基因已在 EMBL/GenBank基因库中注册，Accession number为AF254640，被 国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为cry1Ab13。2．苏云金芽孢杆菌B-G-8是由东北农业大学提供的国内自行分离的野 生菌株，经PCR—RFLP鉴定B-G-8菌株中含有新的cry1A基因。B-G-8 质粒DNA经Sau3AⅠ部分酶切，回收5～7kb片断与pUCP19连接 并转化大肠杆菌，利用PCR方法筛选转化子，克隆了含cry1A全长 基因的6.9kb大片段并测序。序列同源性分析表明3000bps的编码区 序列与cry1Ac5的同源性最高为82.8％，说明该基因是一新的cry1A 基因。该基因编码区长3549bps，编码1182个氨基酸的蛋白质，蛋白 分子量为134kDa，等电点是pH4.985。现已提交EMBL/GenBank基 因库注册，Accession number为AF281866。DE＜将含 CrylAbl3的 8．skb的 PSt大片段插入广宿主载体 pGMll05，构建了含CI’y jAbjJ的重组质粒pGM81，并转化大肠杆菌JM107石，荧光假单胞菌和苏云金芽抱杆菌无晶体突变株CryB”，得到转化子分别是 ETG81－J、ETGS Is，PtTG81和 Bi。tISI，SDS—PAGE电泳证明它们都表达了Cry1Ab 130石kDa蛋白。电镜观察表明BiotI81有双锥体形晶体形成。PffG81和 Bi。tI81均表现出杀虫活性。PffG81原液 48小时使敏感品系的小菜蛾死亡率达 90％，Bi。tISI在 24个时对北京地区小菜蛾（敏感品系）的LC；。为工35qL／mL，对海南地区小菜蛾（抗性品系）24刁时的 LC。。为弓．35卜L／mL。4卜L／g浓度的 BiotI81 和 C005对棉铃虫体重增加的抑制作用分别为 97．7％和 gi二％。 将含有 CryIA基因的大片段插入 E COltst穿梭载体 pHT315，转化大肠杆菌JM、SCSllo和苏云金芽抱杆菌无晶体突变株BE20，也获得了转化子 ETG59－J、ETG59－S和 Bi。tI59，BIOtI59 SDS—PAGE电泳在70kD处有蛋白带表达。电镜下观察到双锥体形晶体。 Bi。tISI和 Bi。tI59比出发菌株 C005和 B．G．8的生长略慢，蛋白质表达也相应推迟，但生长趋势一致。从颐和园等地点采集土样、沙样等共55个，搜集各类细菌228株，在几丁质平板上用透明圈法筛选得到 4株细菌、12株放线菌，60株 BI均有较高的几丁质酶活性，其中CT14菌株的几丁质酶活性最高。CT14菌体形态为长杆状，0．4～0石XI．6～4．8 u m，芽泡膨大中生或近端生，椭圆形，菌落淡黄色、湿润粘稠，经鉴定 CT为环状芽抱杆菌。比较了 CT几丁质酶活性测定方法中的影响因素，确定最佳反应条件是：500 p L反应体系中几丁质酶作用时间20分钟、加入蜗牛酶40u L（0．ic／mL）、保温 30分钟、力入 0．smol＊的 K。B，0，150 u L、DMAB量至少ZmL，并且须在反应结束后30分钟内测定585urn OD值。 不同碳、氮源对 CT几丁质酶活性影响试验表明：在无几丁质的培养基中 CTI4的几丁质酶有一定表达，加入几丁质后可以诱导几丁质酶大量表达：在以几丁质为碳源的含氮源的培养基中，由于无其他单 二中臼农业科学院博士学位论文糖抑制，发酵液有较高的几丁质酶活性。 CT几丁质酶在洲～7的缓冲液中能保持较高的稳定性，pH7时活性最高：几丁质酶在20～40℃条件下保温30分钟仍有较高稳定性，且在 40℃时几丁质酶活性最高。0．lmol／L Na＼ K二 Mg‘＼ Ba‘二 Zn‘”Ga‘”Mn‘”，Cu‘”，Ag”，Fe‘“金属离于均不同程度抑制几丁质酶的活性，但 F／。对几丁质酶有一定激活作用。6．CTI4几丁质粗酶液经阴离子交换柱层析后产生一个穿透峰（PO）和叁 个盐洗脱峰（PI，Pll，Pill），它们都有几丁质酶活性。SDS—PAGE 电泳表明有几丁质酶活性的穿透峰中蛋白质分布在40～50kDa之间， 而盐洗脱峰 PI中蛋白质在 60kDa或 25kDa左右，盐洗脱峰 Pll中的蛋 白质存在于25kDa或20kDa左右，盐洗脱峰Pill中的蛋白质在20kDa 以下。据此推测，CT菌株的几丁质酶可能不只一种。7．抑菌试验表明：0．sing CTI4几丁质酶粗蛋白，对多种病原真菌生长?
参考文献：
[1]. 苏云金芽孢杆菌WB7几丁质酶定点突变研究[D]. 蔡文旋. 福建农林大学. 2008
[2]. 苏云金芽孢杆菌WB50菌株vip3A基因和几丁质酶基因的定位[D]. 伍赠玲. 福建农林大学. 2004
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[10]. Bt cry基因克隆和环状芽孢杆菌几丁质酶的研究[D]. 檀建新. 中国农业科学院. 2000