湖北省华中科技大学同济医学院附属荆州医院湖北荆州434020
作者简介：朱美娥（1983年10月 ），女，大学本科学历，湖北潜江人，汉族，湖北省华中科技大学同济医学院附属荆州医院神经内科, 主治医师，研究方向 神经内科，地址 湖北省荆州市荆州区人民路1号 湖北省华中科技大学同济医学院附属荆州医院，邮编434020
【摘要】目的 利用β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）诱导NG108-15细胞创建老年痴呆（Alzheimer disease，AD）模型。方法 将NG108-15细胞在37℃饱和湿度下培养，用不同浓度的Aβ25-35诱导NG108-15细胞，在不同时间内利用Fura-2/AM荧光分析法检测细胞内Ca2+浓度，MTT法测定细胞活力，利用碘化丙啶及Hoechst 33258染色分析细胞凋亡情况。结果 Aβ25-35诱导NG108-15细胞后，细胞内Ca2+浓度上升；细胞活力下降，不同时间及不同浓度之间差异具有统计学意义（P<0.05）；不同浓度Aβ25-35诱导NG108-15细胞后，NG108-15细胞在Ca2+浓度上升后5.5~12.1h，不同时间显现出凋亡的典型形态学特征。结论 经过β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）诱导NG108-15细胞能够建立理想的老年性痴呆细胞模型，值得临床推广。
【关键词】β-淀粉样蛋白；NG108-15细胞；老年性痴呆细胞模型
【中图分类号】R587.23【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0246-02
老年性痴呆又被成为阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD），是一种记忆认知功能障碍、进行性加重的神经变性疾病。其为老年多发性疾病，伴随着神经细胞减少、神经元纤维缠结（NFT）及老年斑（SP）形成等病理学变化[1]。β-淀粉样蛋白是构成SP的主要成分，其对神经元有直接的毒性作用，被认为是诱导神经元凋亡的主要因素，而细胞大量凋亡又是AD退行性改变的主要可能因素。目前[2,3]，临床上尚无较为理想的AD细胞模型，本研究利用Aβ25-35诱导NG108-15细胞创建老年性痴呆细胞模型，为研究AD的相关机制及探究治疗方法提供了新的方法。
1材料与方法
1.1细胞培养
将NG108-15细胞在体积分数为5%的CO2培养箱中培养，温度设定为37℃，NG108-15细胞株由日本金泽大学神经物性部门提供。
1.2试剂
Aβ25-35购自Sigma公司，配置成100μmol/L，经过滤、分装于-20℃保存。Fura-2/AM购自Sigma公司，DM SO购自 Amresco 公司，配置成1mmol/L，于-20℃保存。碘化丙啶及Hoechst 33258购自Sigma公司，配置成10mg/L，于4℃下避光保存。MTT购自Amresco 公司。
1.3方法
取生长对数期的NG108-15细胞进行消化、离心，然后用完全培养基重悬，密度105/ml，将其接种到96孔板中，当80%汇合时替换旧培养液，加入新培养液，将所有细胞均分成（A-F）6组，分别加入不同浓度的Aβ25-35：0μmol/L，5μmol/L，10μmol/L，20μmol/L，30μmol/L，40μmol/L，继续培养到6、12、24、36、48、60h进行检测。
1.3.1Fura-2/AM荧光分析Ca2+浓度
将6组不同时间段收获的细胞重悬于HBSS（KCl0·4 g/L ，NaCl8·0 g/L ，CaCl20.14 g/L，MgCl20·2g/L，Glucose1·0g/L，Hepe2·38g/L）中，细胞密度控制为106/L。将细胞接种于96孔板中，每个孔板100μL，37℃培养5min，然后加入浓度为10μmol/L的Fura-2/AM，37℃培养30min，然后用含有牛血清白蛋白的HBSS液（两者体积比0.2%）清洗细胞2次，HBSS重悬，调整细胞密度为5×105/ml，37℃下孵化20min。游离Fura激发波长340nm，结合Fura激发波长380nm，发射波长510nm条件下于荧光光度计下检测。Ca2+计算公式：[Ca2+]=Kd×[(R-Rmin)/(Rmax-R)]，Kd为Ca2+解离常数，224nmol/L，R为不同条件下的荧光信号比值[4]。R=(F[i]-F0)/(F[c]-F0)，F[i]为340 nm荧光强度、F[c]为 380 nm荧光强度，F0为不加Fura-2时自发荧光强度[5]。
1.3.2MTT法测定细胞活力
每组设置3个平行样本，在96孔板中培养，每孔加入20μlMTT，浓度为5mg/ml，37℃下培养4h，扣板法扣除培养液获取细胞，每孔加入150μlDMSO，37℃震荡培养10min，等紫色结晶充分溶解，用酶标仪上测定各孔光吸收值（OD），以空白孔调零，波长设定为570nm。OD值换算细胞存活率，细胞存活率（%）=实验组OD/对照组OD×100%[6]。
1.3.3碘化丙啶及Hoechst 33258染色检测细胞
将收获的细胞经过离心在0.01mol/LPBS中重悬，密度106/L。加入HO至最终浓度为1mg/L，37℃染色10min。离心，PBS重悬于冰上冷却加PI染色至终浓度为5mg/L，流式细胞仪检测。
1.4统计学分析
数据采用SPSS19.0统计软件分析，百分比数据比较采用χ2检验，计量数据以平均值±标准差表示，实施t检验。当P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 Aβ25-35致细胞内Ca2+变化情况
低浓度的（5μmol/L和10μmol/L）Aβ25-35诱导NG108-15细胞后，Ca2+没有出现显著变化。 20μmol/L Aβ25-35诱导24h后Ca2+上升，在36h时上升最快，相比于之前时间段差异显著（P<0.05），随后48h和60h也出现上升，但相比于36h没有显著差异（P>0.05）。随着浓度升高，Ca2+显著升高的时间也提前，30μmol/LCa2+显著升高出现在12h，40μmol/L则出现在6h。Aβ25-35浓度越高，细胞内Ca2+浓度也越高。
2.3细胞凋亡及形态变化情况
对于正常生长的细胞，在生长到一定时间内能够自主凋亡及继发性死亡，在60h内细胞凋亡率小于9.3%，死亡率＜3.7%，通过Aβ25-35作用于NG108-15细胞后细胞凋亡率显著增加，5μmol/L和10μmol/L Aβ25-35作用于NG108-15细胞后在60h时细胞凋亡率可达13.1%，200μmol/L作用后48h凋亡率达33.1%，60h凋亡率达21.2%，死亡细胞达37.2%。随着浓度升高，细胞凋亡及死亡峰值均提前，且比例不断升高，差异比较具有统计学意义（P<0.05）。
3讨论
AD是一种以起病隐匿且病情呈进行性发展的神经系统退行性疾病。临床主要表现为人格行为改变、记忆障碍、失语、失认、执行功能障碍、视空间技能损害等全面性痴呆表现。AD的具体病因至今仍未有明确的研究结果。有研究指出， Aβ会导致SP和tau蛋白异常磷酸化形成NFTs，这是AD最为重要的病理学特点。Aβ是β-淀粉样蛋白前体蛋白的水解产物，大量聚集在脑内的神经元和突出间，会产生神经毒性。需要临床研究证实Aβ引起的神经毒性反应是AD发生和发展的关键因素，其神经细胞毒性作用主要表现为：（1）导致突出丢失和神经元凋亡；（2）损害胆碱能功能；（3）导致tau蛋白磷酸化；（4）诱发免疫炎症反应；（5）导致能量代谢障碍；（6）诱发氧化应激反应，并导致发生自由基损伤。因此，Aβ可通过损害线粒体、增加钙离子内流、脂代谢紊乱、氧化应激反应以及激活小胶质细胞和NFT引起脑内炎症等直接或间接作用等使得突出丢失以及神经元细胞凋亡，从而导致机体神经功能受损发生障碍，并出现行为学的变化。因此，我们在建立AD细胞模型时，将神经元的凋亡与否认为是模型建立成功与否的重要衡量指标，并选择了NG108-15细胞作为模型，该细胞具有胆碱能特性，可作为胆碱能神经细胞模型。
本研究发现，低浓度的（5μmol/L和10μmol/L）Aβ25-35诱导NG108-15细胞后，Ca2+没有出现显著变化。20μmol/L Aβ25-35诱导24h后Ca2+上升，在36h时上升最快，相比于之前时间段差异显著（P<0.05），随后48h和60h也出现上升，但相比于36h没有显著差异（P>0.05）。随着浓度升高，Ca2+显著升高的时间也提前，30μmol/LCa2+显著升高出现在12h，40μmol/L则出现在6h。Aβ25-35浓度越高，细胞内Ca2+浓度也越高。Aβ25-35能够显著降低NG108-15细胞活力，且浓度越高，细胞活力降低速度越快，所用的时间越短。对于正常生长的细胞，在生长到一定时间内能够自主凋亡及继发性死亡，在60h内细胞凋亡率小于9.3%，死亡率＜3.7%，通过Aβ25-35作用于NG108-15细胞后细胞凋亡率显著增加，5μmol/L和10μmol/L Aβ25-35作用于NG108-15细胞后在60h时细胞凋亡率可达13.1%，200μmol/L作用后48h凋亡率达33.1%，60h凋亡率达21.2%，死亡细胞达37.2%。随着浓度升高，细胞凋亡及死亡峰值均提前，且比例不断升高，差异比较具有统计学意义（P<0.05）。 综上所述，经过β-淀粉样蛋白（Aβ25-35）诱导NG108-15细胞能够建立理想的老年性痴呆细胞模型，值得临床推广。
参考文献
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[3]Nishitsuji K,Hosono T,Uchimura K,et al. Lipoprotein lipase is a novel amyloid beta( Abeta) -binding protein that promotes glycosaminoglycandependent cellular uptake of Abeta in astrocytes[J]. J Biol Chem,2011,286( 8) : 6393-401.
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[6] 黄汉昌,姜瑞瑞,林 婧,张明贤.阿尔茨海默病发生机制及其治疗药物研究进展[J].中国老年杂志,2011,31(15):2993-2997.
论文作者:朱美娥
论文发表刊物:《中国医院药学杂志》2016年8月
论文发表时间:2016/10/25
标签：细胞论文; 浓度论文; 凋亡论文; 诱导论文; 神经元论文; 蛋白论文; 老年性痴呆论文; 《中国医院药学杂志》2016年8月论文;