【摘要】目的：了解青海地区医院分离产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌的基因型。方法：采用CLSI推荐的表型确证实验来收集产ESBLs大肠埃希菌(173株)，提取质粒DNA；分别用TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9扩增引物进行聚合酶链反应(PCR)扩增，扩增产物进行测序后在Genbank数据库进行比对确定基因型。结果：检出9种ESBLs基因型，检出比例较高的是CTX-M型（100株）和TEM（55株），检出CTX-M型亚型以CTX-M-14、CTX-M-55、CTX-M-15为主。其中单一基因型占总检测菌株数的50.29％，两种及两种以上基因型占20.23%。结论：（1）青海地区ESBLs大肠埃希菌的主要基因型是CTX-M型和TEM型。TEM、CTX-M-14和CTX-M-55是本地区主要流行的ESBL基因型。（2）同时携带两种及两种以上耐药基因菌株占总检测菌株数的20.23%，提示多重耐药基因菌株比例较高，需引起临床的重视。
【关键词】超广谱β-内酰胺酶；大肠埃希菌；基因型；青海地区
【中图分类号】R440 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）30-0363-02
大肠埃希菌是医院感染常见的致病菌，产生超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrum β-lactamases，ESBLs）菌株的出现，造成现存有效抗菌药物失效，限制了治疗方案的选择。ESBLs具有多种耐药基因，绝大多数定位于耐药菌质粒DNA序列中，同一质粒还可同时携带多个耐药基因，引起多重耐药[1]。在世界各国及国内各地区ESBLs基因类型的分布并不完全相同，有相关研究报道，我国产ESBLs大肠埃希菌基因型以CTX-M为主[2]。为了解本地区产ESBLs大肠埃希菌的基因型特征，对产ESBLs菌株感染的预防、控制和治疗提供更多的信息和依据，本研究检测ESBLs的TEM、SHV和CTX-M型在青海地区的流行状况。现将结果报道如下。
1.材料和方法
1.1 菌株
收集178株青海省内省、市、州、县共5家医院微生物实验室临床分离的产ESBLs大肠埃希菌。参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的纸片扩散表型确证方法[3]，筛选出产ESBLs大肠埃希菌菌株173株。质控菌株为ATCC 25922。
1.2 主要仪器及试剂
法国生物梅里埃VITEK2-compact鉴定药敏系统、ABI steponeplus扩增仪、药敏纸片（OXOID）、质粒提取试剂（上海生工）、扩增试剂（上海生工）、引物（上海生工合成）；DNA marker（上海生工）
1.3 方法
1.3.1细菌鉴定和药敏试验 临床样本用法国生物梅里埃VITEK2-compact鉴定药敏系统进行菌株鉴定及药敏试验。
1.3.2表型确证 用NCCLS推荐的表型确证方法（双纸片协同法）筛选出ESBLs菌株。
1.3.3提取质粒 采用质粒提取试剂盒提取细菌质粒，严格按说明书操作。
1.3.4 PCR扩增[1]
引物：
TEM（P1：TATCCGCTCATGAGACAATA P2：AGAAGTGGTCCTGCAACTTT 产物长度717bp）
SHV（P1：TCTCCCTGTTAGCCACCCTG P2：CCACTGCAGCAGCTGCCGTT 产物长度593bp）
CTX-M-1（P1：ACGCTGTTGTTAGGAAGTG P2：TTGAGGCTGGGTGAAGT 产物长度741bp）
CTX-M-2（P1：ACGCTACCCCTGCTATT P2：CAGAAACCGTGGGTTACGA 产物长度829bp）
CTX-M-9（P1:AGTGCAACGGATGATGT P2:GGCTGGGTAAAATAGGTC 产物长度774bp）
PCR扩增体系（总体积50μl）：上、下游引物各2μl，DNA模板1μl， PCR Master 25μl，H2O 20μl
PCR扩增：在ABI steponeplus扩增仪进行扩增
1.3.5 PCR产物电泳及测序 采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，凝胶成像系统观察结果，扩增产物由上海生工公司测序，测序结果在Gene Bank数据库进行比较分析[1]。
2.结果
见表1、图1
表1 大肠埃希菌检出基因型别（株，%）
图1 大肠埃希菌基因型别分布
3.讨论
随着科技的进步，越来越多的抗生素被发现，在救治感染患者的同时，抗药性问题也随之而来。近年来各类产ESBLs的菌株种类、数量及基因种类不断增加，使抗感染问题更加困难[4-5]。了解本地区ESBLs基因型的特点，对医院感染监测有重要作用，并可以为本地区流行病学提供数据。 据相关资料报道，浙江地区产ESBLs大肠埃希菌的基因型以CTX-M-14型为主[6]。天津市以SHV型、TEM型、CTX-M-1型、CTX-M-9型为主[7]。通过本次研究，青海地区产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌主要流行基因型别以CTX-M型为主，其次为TEM型。CTX-M型亚型中以14型、55型和15型为主，还有少量的27型、24 型、3型、64型及123型存在。TEM型以TEM-1为主。本实验173株菌中携带耐药基因菌占73.99%，其中只携带一种基因型菌株占53.17%，同时携带多种基因型菌株占20.8%，这说明本地区耐药基因携带菌株比例大，同时携带多基因菌株也较多，这对耐药菌治疗及控制其蔓延提出了更高要求。我们必须重视临床合理用药，加强感染控制，防止多重基因型ESBLs菌的播散。
【参考文献】
[1]蒋惠莉.青海地区产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌CTX-M基因型及耐药性研究[J].青海医药,2017，47（1）:4-7.
[2]季淑娟，顾怡明，谭文涛，等.中国部分地区大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌超广谱β内酰胺酶基因型研究[J].中华检验医学杂志,2004,27(9):590-593.
[3] National Committee for Clinical Laboratory Standard．Performance standard for antimicrobial susceptibility testing；Twelfth informational supplement(M100-S12)[J]．NCCLS，2002，Wayne，Pennsylvania．
[4]杨润秀，郭彦言，陈进玲,等.产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌2013-2015年耐药谱动态分析[J].中华医院感染学杂志,2017,12:2656-2659.
[5]罗瑜，黄永茂，林雁，等.大肠埃希菌耐多药与产超广谱β-内酰胺酶关系的研究[J].西南军医,2018,3:315-318.
[6]季淑娟,陈亚岗,俞云松,等.浙江省产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的基因分型[J].中华传染病杂志,2005（2）：75-78.
[7]刘蕊,刘慧敏,穆小燕，等.天津地区医院产ESBLs菌株基因型研究[J].中华医院感染学杂志,2009,24:3321-3324.
论文作者:蒋惠莉
论文发表刊物:《医药前沿》2018年30期
论文发表时间:2018/12/7
标签：菌株论文; 大肠论文; 基因型论文; 质粒论文; 青海论文; 基因论文; 产物论文; 《医药前沿》2018年30期论文;