赵翎皓[1]2016年在《乙肝病毒（HBV）对于肝癌宿主基因组的插入整合及其机制研究》文中研究表明研究背景和目的:原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在全世界范围内均位居发病率最为普遍的恶性实体肿瘤前列,其在全球范围内的癌症发病率中高居第五,并且其肿瘤导致的相关死亡率在所有肿瘤相关致死率相关统计中高居第叁。在许多发展中国家,原发性肝癌往往在晚期才被诊断出来并且此时的切除手术的疗效极其有限。原发性肝癌的发生率在全球范围内具有显着的地理分布及人种差异,并且还具有显着的性别差异存在。相比于白色人种,原发性肝癌的发病率及死亡率在亚洲人尤其的高。为我们所熟知的是,在世界范围内尤其在某些特定地区慢性乙型肝炎病毒(HBV)的感染是密切参与并推进原发性肝癌发生及进一步恶性发展的主要危险因素,在中国,超过80%的肝癌患者均同时伴有乙型肝炎病毒的感染。研究证实,乙型肝炎病毒的基因组DNA可以整合到宿主基因组中并且被认为是乙肝病毒诱发肝癌的主要原因之一。最近有越来越多的研究证据提示乙肝病毒对于宿主基因组的整合作用密切参与肝脏肿瘤的发生。这些乙肝病毒的整合能够诱导宿主基因拷贝数变化(CNV),染色体变化,亦或是宿主基因的表达变化。有研究报道乙型肝炎病毒更为倾向于整合入宿主肿瘤基因组中的热点靶向基因TERT,FAR2,MLL4之中。而与此同时也有其他的研究报道称乙型肝炎病毒往往更倾向于整合入相邻非肿瘤组织基因组的靶向基因FN1和SMAD5之中。.可见之前多篇关于乙肝病毒整合的研究报道之间存在较大的争议,而目前我们也并不知道造成这种差异的内在原因是什么。但是,通过比较我们发现既往相关研究还是存在较大的不足,其研究队列的肝癌样本数目较为有限,同时其检测乙肝病毒整合的技术也不够理想,并且我们认为目前发现的乙型肝炎病毒相关性肝癌关键基因的检测还远远没有系统完成。因此,我们认为针对乙肝病毒整合这个研究方向有必要采取进一步努力和探索,不仅为了确认既往的调查结果,更重要的是,更深入的探索那些重要的乙型肝炎病毒整合易感基因位点。相较于女性,男性患者原发性肝细胞癌的发生率显着更高。最近,大量的研究将重点放在研究性别因素和肝癌发病率以及其临床特征之间的内在关系上。Huang et al报道,乙型肝炎病毒相关的肝癌中男性比女性具有更高的发病风险并且男女患者会显示出不同临床特点。Hou et al报道,原发性肝癌不同的性别差异会使得肿瘤内部在分子水平上也各不相同,最终导致截然不同的分子表型。乙型肝炎病毒整合入人类基因组目前被认为是原发性肝癌癌变过程的一种早期事件。然而,目前没有一项研究报告将重点关注在乙肝病毒整合与性别因素的内在联系上。目前乙型肝炎病毒(HBV)已被鉴定出具有八种基因亚型(A-H)。多个研究小组报告,乙肝病毒不同的基因亚型其感染流行分布有明显的地理差异,并已被证明在临床疗效、患者预后生存及抗病毒治疗反应性等多个方面均存在显着的不同。在亚洲,最流行的乙型肝炎病毒基因亚型是基因亚型B和C。然而,目前没有一项研究报告将重点关注不同乙肝病毒亚型其基因组整合特性的差异。原发性肝癌患者绝大多数均伴有肝脏的肝硬化,但同时也有一部分肝癌患者并不经过长期的肝硬化阶段而直接进展成瘤。在全球,至少叁分之一的肝硬化是由于慢性乙型肝炎所致,并且慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的患者中显着一部分最终会进展成为原发性肝癌。大量研究表明肝硬化肝癌和非肝硬化肝癌之间存在着显着的临床和病毒学特征差异。然而,我们发现以往的大多数研究并没有特别区分肝癌患者的肝硬化和非肝硬化情况,此外,肝硬化肝癌和非肝硬化肝癌之间的乙型肝炎病毒整合特性差异目前仍然未知。以往关于乙肝病毒整合的研究多采用southern blot或是传统PCR技术,其技术局限性也很大程度上制约了以往研究的发现,使其无法系统全面的解析宿主基因组中乙肝病毒的整合断点。在乙型肝炎病毒基因组中含有大量的突变,这会导致PCR检测失败。即便使用全基因组测序技术(WGS),乙型肝炎病毒整合断点的检测的灵敏度其实也远远达不到理想的程度。为了解决实际的技术问题,我们的研究参与人员已经开发了一种全新的实验和计算方法,即高通量乙肝病毒整合靶向检测技术(HIVID)。通过实验已经证明,对于识别乙肝病毒整合位点这种全新的靶向检测技术比全基因组测序方法(WGS)更为灵敏。为了解决上述种种关于乙肝病毒整合的科学问题并进一步理解乙肝病毒整合参与肝癌发生发展的具体影响机制,我们系统收集了在我院进行肝癌切除手术的426例病人的配对肿瘤和相邻非肿瘤对照组织,提取其基因组后进行了HIVID的检测。研究入组的426例病毒均经过严格的临床和病理学验证证实其为原发性肝癌肝细胞型。并且我们随机选择12个肿瘤样本进行了转录组测序(RNA seq),以进一步研究其转录水平的变化。本研究旨在探讨乙肝病毒整合在原发性肝癌发生发展中的具体作用及机制,加深我们对于乙肝病毒整合作为肝癌恶性转化及浸润重要作用的了解,为今后乙肝病毒整合研究成果向临床进一步应用转化提供重要的理论依据。实验方法:(1)我们系统了收集426例临床肝癌病人的肝癌及癌旁组织样本进行HIVID检测,以系统全面研究乙肝病毒HBV在肝癌及癌旁组织基因组中的整合特性及其分布。(2)HIVID技术方法验证:通过随机方法挑选出了检测到的60个整合断点进行PCR以及Sanger测序验证。(3)通过肝癌肿瘤及癌旁组织分组进行断点整合谱差异比较。(4)研究全新发现的高频乙肝病毒整合基因转录组水平功能变化:实时定量聚合酶链反应实验(realtime-PCR)。(5)研究全新发现的高频乙肝病毒整合基因蛋白水平功能变化:免疫组化染色实验(IHC)。(6)研究在肿瘤组织中乙肝病毒整合对于其特异性富集信号通路m TOR signaling pathway蛋白水平功能变化:免疫组化染色实验(IHC)。(7)研究肿瘤组织内乙肝病毒整合在转录组水平上的保留及其功能变化:随机挑选了12个含有HBV病毒整合的肿瘤组织进行转录组测序(RNA-seq)实验。(8)研究HBV-DNA在体内的复制与其整合特性内在相关性:HBV-DNA检测试剂COBAS。(9)研究病毒整合的克隆性问题以及验证HIVID检测出的HBV整合断点的可靠性及灵敏性:选取了10个同时具备HIVID及RNA-seq数据的患者的肿瘤组织进行了全基因组测序(WGS)。(10)研究乙肝病毒整合与原发性肝癌临床特征之间的内在相关性及差异:HBV B型VS HBV C型乙肝病毒整合差异,肝硬化肝癌VS非肝硬化肝癌乙肝病毒整合差异,男性患者肝癌VS女性患者肝癌乙肝病毒整合差异。实验结果:(1)在肿瘤组织中一共发现了3486个HBV病毒整合断点,而在对应的癌旁组织中739个HBV病毒整合断点。HBV病毒的总体整合率为76.9%。配对的癌旁对照组织中,HBV病毒的整合率则仅为37.3%。(2)在60个随机挑选的断点中成功验证出52个整合断点存在,并且序列一致,总体验证率为86.7%。(3)HBV病毒在肝癌宿主的肿瘤组织及癌旁组织基因组中的整合分布及整合特性是具有较为显着的差异。在肿瘤组织中,HBV病毒可见高频整合于TERT,KMT2B,CCNE1等一系列基因,在癌旁对照组织中,HBV病毒则高频整合于FN1,PTPRN2及TERT等一系列基因中。(4)在肿瘤组织中,HBV病毒整合靶向基因在m TOR signaling pathway癌症相关通路上有所富集。免疫组化结果进一步证实,HBV病毒的整合可以影响m TOR信号通路在蛋白水平的激活状态。(5)针对肿瘤及癌旁组织中发现全新的高频HBV病毒靶向整合基因包括:PTPRD、UNC5D、NRG3、CTNND2、AHRR,通过IHC及realtime-PCR实验证实,HBV病毒整合可以影响这些靶向基因m RNA及蛋白水平表达。(6)在转录组水平,HBV整合片段在RNA水平在位于1500---1900bp的区域呈现出显着的富集现象,此区域与DNA水平所发现的现象一致。(7)HBV B型及HBV C型乙肝病毒在样本整合率等一系列整合特性上具有显着差异。(8)患者血清中HBV-DNA滴度与其基因组中的发现的整合断点数之间并未发现明显的相关性。(9)单一患者同一瘤体内的多数肝癌细胞均为单克隆起源。多数HBV病毒片段在宿主肝细胞癌细胞中的整合发生在肿瘤形成的早期阶段。(10)男性及女性原发性肝癌患者肿瘤组织中乙肝病毒整合特性上具有显着的性别差异。(11)肝硬化肝癌与非肝硬化肝癌中乙肝病毒整合谱具有显着差异。结论:通过本研究,我们首次采用大样本量队列以及更为灵敏的技术方法系统深入的解析了乙肝相关原发性肝癌肿瘤及癌旁组织中乙肝病毒的整合特性。我们的研究发现,在宿主基因组的基因富集区等特定重要区域以及一部分基因组重要关键位点上,乙肝病毒具有显着的整合偏好性。我们认为,乙肝病毒在宿主基因组上关键位点的整合使得肝细胞具有恶性转化的潜能,密切参与原发性肝癌发生发展的过程。
于馨[2]2017年在《HBV对LPS诱导的NLRP3炎症小体活化和IL-1β产生的抑制作用及机制研究》文中研究指明研究目的乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)是一种嗜肝DNA病毒,全球约有4亿HBV携带者,HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎,并与肝纤维化、肝硬化和肝癌的发生密切相关。HBV被认为是一种"隐匿性病毒",在感染早期能够逃避机体免疫监视,HBV可产生多种病毒相关蛋白以抑制机体天然和适应性抗病毒免疫应答,导致病毒在体内长期存在。NLRP3炎症小体(inflammasome)是一种存在于胞浆中的大分子多蛋白复合体,能够感知病原微生物感染、组织损伤和代谢失衡时所释放的分子信号,促进IL-1β和IL-18等炎性因子的成熟和释放。NLRP3炎症小体的活化需要双信号:第一信号(预刺激信号)由病原相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)诱导产生,通过活化NF-κB信号通路而促进NLRP3和pro-IL-lp的表达;第二信号(活化信号)由危险相关分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMP)诱导产生,通过活化caspase-1促进IL-1β等细胞因子的成熟和分泌。IL-1β作为一种多效炎症因子,能够促进多种免疫相关基因的表达,并募集淋巴细胞至感染部位,抑制包括HBV在内的多种病原微生物感染。研究表明,多种病原微生物可通过各种机制抑制NLRP3炎症小体的活化,进而逃逸机体的免疫应答。但是HBV感染与NLRP3炎症小体活化之间的关系尚不清楚。肝脏是人体最重要的代谢和解毒器官,来自肠道中的细菌成分(如LPS)可通过门静脉进入肝脏,导致肝脏中NLRP3炎症小体的活化和促炎因子的产生,而肝脏又是HBV的主要感染器官,那么HBV能否通过影响肝内NLRP3炎症小体的活化而促进自身的免疫逃逸?为了探讨这一问题,在本研究中,我们首先利用HBV体内外感染模型证实HBV自身并不能活化NLRP3炎症小体;进而通过给予LPS诱导肝组织中NLRP3炎症小体的活化,发现肝脏Kupffer细胞是表达NLRP3炎症小体和分泌IL-1β的主要细胞,而HBV感染可明显抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化;继而利用体外细胞模型、HBeAg突变小鼠模型和临床HBV慢性感染及肝癌患者标本证实HBV分泌的HBeAg介导了对NLRP3炎症小体活化的抑制作用,并深入探究了其作用机制;最后,在鼠伤寒感染模型中进一步验证了 HBV对NLRP3炎症小体活化的抑制作用。研究方法1.通过Real-time PCR和Western blotting技术检测HBV稳定表达细胞系、HBV感染小鼠及临床HBV患者肝组织中NLRP3炎症小体及活化相关分子的表达。2.通过尾静脉高压注射pAAV/HBV1.2或pAAV/HBV1.2-e-null质粒至C57BL/6小鼠体内,建立HBV感染小鼠模型或HBV-e-null小鼠模型。3.通过ELISA检测小鼠血清中HBsAg和HBeAg水平;通过免疫组化检测肝组织原位HBcAg表达;通过荧光定量PCR检测HBV DNA含量。4.通过流式细胞术和免疫荧光技术检测Kupffer细胞中IL-1β的表达。5.通过流式细胞术和Western blotting检测细胞中NF-κB的活化。6.利用ZDOCK 3.0.2程序对HBeAg与TRAM、MAL分子进行模拟对接。7.通过ELISA检测细胞培养上清、血清或肝脏研磨液中IL-1β、IL-18和IL-6的水平。8.通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测DCF的荧光强度以检测ROS产生。9.通过Western blotting检测细胞膜上p47-phox和Na+/K+ ATPase的表达。10.通过激光共聚焦显微镜分别观察胞浆中Fluo-3/AM和溶酶体中LysoTracker的荧光强度以检测细胞中Ca2+水平和溶酶体稳定性。11.用鼠伤寒沙门氏菌分别感染HBV慢性感染小鼠和对照小鼠后,通过检测肝脏组织中鼠伤寒沙门氏菌的载量和小鼠生存期,以确定小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的敏感性。实验结果1.HBV感染不能活化NLRP3炎症小体HepG2.2.15 细胞中 NLRP3、pro-caspase-1 和 pro-IL-1β等 NLRP3 炎症小体相关分子的表达水平显着低于HepG2细胞;体外用LPS和不同浓度的HBV颗粒刺激分化后的THP-1细胞不能活化NLRP3炎症小体;与对照小鼠相比,急性和慢性HBV感染小鼠的肝组织中NLRP3炎症小体相关成分及血清中IL-1β表达均未见明显升高。2.HBV能够抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化HBV慢性感染可显着抑制LPS诱导的小鼠肝组织中NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;肝脏中的巨噬细胞是表达NLRP3炎症小体和分泌IL-1β的主要细胞,并且HBV主要抑制小鼠肝脏Kupffer细胞中IL-1β的表达;用含HBV成分的培养上清孵育分化的THP-1细胞能够显着抑制细胞中LPS诱导的NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌。以上结果说明,HBV对LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化有抑制作用。3.HBeAg,而非HBsAg,具有抑制NLRP3炎症小体活化的作用HBeAg预孵育可显着抑制LPS诱导的THP-1细胞中的NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的成熟;体内实验显示,HBV慢性感染可显着抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体活化,但是在HBeAg缺失的HBV慢性感染小鼠中,HBV对炎症小体的抑制作用减弱;HBeAg不但可以抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化,还能抑制其它活化剂诱导的该炎症小体的活化。HBsAg预孵育与否并不影响LPS诱导的THP-1细胞中NLRP3炎症小体的活化。以上结果说明,对NLRP3炎症小体发挥抑制作用的是HBeAg,而不是HBsAg。4.HBeAg通过抑制NF-κB的活化抑制NLRP3和pro-IL-11的表达HBeAg预孵育分化的THP-1细胞,可显着抑制LPS诱导的NF-κB的活化水平和下游细胞因子IL-6和TNF-α的表达。利用ZDOCK 3.0.2程序对HBeAg和NF-κB信号通路下游的两个接头分子TRAM和MAL进行模拟对接,发现HBeAg和这两个分子均存在结合区域。说明HBeAg有可能通过与TRAM和MAL分子结合而抑制NF-κB的活化。5.HBeAg通过抑制ROS产生抑制NLRP3炎症小体的活化HBeAg预孵育分化的THP-1细胞,可显着抑制LPS诱导的NADPH氧化酶的活化,进而抑制ROS的产生;外加H2O2后,HBeAg对NLRP3炎症小体的抑制作用明显降低。6.HBeAg+的临床HCC和CHB患者体内NLRP3炎症小体的活化被抑制HBeAg+的 HCC 患者癌旁组织 NLRP3、活化的 caspase-1 p20、pro-IL-1β和成熟的IL-1β p17的表达水平显着低于HBeAg-患者。同样,HBeAg+的HCC患者肝组织Kupffer细胞中IL-1β水平明显低于HBeAg-患者。免疫耐受期(HBeAg+)CHB患者血清IL-1β水平较低,而部分免疫非活化期(HBeAg-)患者血清IL-1β水平较高。除HBeAg外尚有其它因素对炎症小体的活化和IL-1β的表达产生影响。7.HBV慢性感染小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染更加敏感与对照小鼠相比,HBV慢性感染小鼠在感染鼠伤寒沙门氏菌后,体内NLRP3和pro-IL-1β的表达、caspase-1的活化以及IL-1β的分泌更低,肝组织的细菌载量更高,生存期更短。说明HBV可能通过降低NLRP3炎症小体的活化和IL-1β的表达增加小鼠对鼠伤寒沙门氏菌感染的敏感性。结论及意义1.本研究发现Kupffer细胞是肝脏中表达NLRP3炎症小体和产生IL-1β的主要细胞。2.本研究首次发现HBV本身不能活化NLRP3炎症小体,但可以通过HBeAg抑制LPS诱导的NLRP3炎症小体的活化和IL-1β等促炎因子的产生,从而抑制机体的抗病毒免疫应答,有利于HBV在体内的存活和慢性感染状态的形成。3.本研究首次阐明HBeAg抑制NLRP3炎症小体的两个途径:既通过抑制NF-κB信号通路抑制NLRP3和pro-IL-1 β分子的表达,又通过抑制ROS抑制caspase-1的活化和IL-1β的成熟。4.本研究首次发现HBV可通过抑制肝脏NLRP3炎症小体活化而抑制炎症反应并阐明了其主要分子机制,揭示了 HBV免疫逃逸的一种新方式,为治疗HBV慢性感染及相关疾病提供新的策略。
吉兆华[3]2016年在《西北乙肝高流行地区新发感染的危险因素和S基因特征研究》文中指出背景乙肝是影响我国人民身体健康的重要传染病。近年来,随着乙肝疫苗的广泛应用及乙肝表面抗原(Hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag)携带人群的自然消亡,全人群HBs Ag携带率特别是5岁以下儿童中HBs Ag携带率有了显着下降。然而,根据国家乙肝防治示范区——武威市人群的乙肝血清流行病学调查数据,5岁以下儿童乙肝疫苗接种率已接近100%,但HBs Ag携带率仍维持在1%左右水平;根据2010年中国CDC数据,全国急性乙肝报告发病率为5.6/10万,据此推算全国每年至少新增78万例HBV新发感染者,其中成人占95%以上,我国儿童中突破性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染和成人HBV新发感染流行趋势依然严峻,新发感染的危险因素尤其是病毒自身因素须予以足够重视。目的摸清西北乙肝高流行地区甘肃省武威市儿童中突破性HBV感染和成人HBV新发感染的危险因素、传播途径及S区基因特征,为制定乙肝新发感染预防措施和策略提供科学依据。方法1.儿童突破性HBV感染研究选择武威市3家新生儿出生数最多的医院2009-2012年出生的突破性HBV感染高危人群(母亲HBs Ag阳性和因出生时因早产或低体重而推迟乙肝疫苗接种的儿童及其母亲)为调查对象,使用问卷调查法获取幼儿及其家庭成员的一般人口学特征信息及主要的危险因素(家庭成员乙肝史等),采集幼儿及其母亲血清,ELISA方法检测乙肝五项,实时荧光定量PCR方法检测HBV DNA,幼儿抗-HBs使用Abbott试剂进行定量。频数分布比较使用χ2检验或Fisher精确检验,均数且符合正态分布资料比较使用t检验,危险因素分析使用单因素与多因素非条件Logistic回归。2.成人HBV新发感染研究选择武威市城区6家医院,以健康体检、门诊病例和住院病例中发现的新发感染者为病例组,与之同一社区、性别相同、年龄相差不超过5岁且HBs Ag与抗-HBs均阴性的人群为对照组,通过问卷对其一般人口学特征、症状、主要危险因素进行调查,采集血清使用ELISA方法检测乙肝六项、荧光定量PCR方法检测HBV DNA、速度法检测ALT与AST。频数分布比较使用χ2检验或Fisher精确检验,均数且符合正态分布资料比较使用t检验,危险因素分析使用单因素与多因素非条件Logistic回归,使用危险因素互斥分层法推断危险因素及传播途径。3.新发感染者S区基因特征研究选择上述儿童突破性HBV感染、成人HBV新发感染和首次发现的无症状HBV携带者为研究对象,使用巢式PCR对其S区进行扩增并测序,应用Mega6.0软件对序列进行剪切对齐后构建进化树对基因进行分型;再将核甘酸转换为氨基酸(amino acid,aa)后根据不同基因型构建标准一致序列,各序列与之相比描述各aa位点及“a”决定簇突变情况;将与S区对应的逆转录酶区临床常见耐药突变位点存在的变异及其构成情况进行描述,使用χ2检验比较频数分布资料间的差异。结果1.儿童突破性HBV感染研究共完成了339个母亲所生的388个幼儿的调查,388个幼儿中男性占55.41%(215/388),平均年龄2.95±1.3岁,HBs Ag阳性7例,HBV DNA阳性11例,感染总人数13例,感染率3.61%(95%CI:1.56%-5.14%)。HBs Ag阳性母亲所生幼儿突破性HBV感染率4.17%(95%CI:1.82%-8.04%),HBs Ag阴性母亲所生幼儿突破性HBV感染率为2.55%(95%CI:0.83%-5.85%)。多因素分析结果显示母亲HBV DNA阳性(OR=4.49,95%CI:1.28-15.77)、其他家庭成员乙肝史(OR=6.18,95%CI:1.73-22.08)是儿童突破性感染的独立危险因素。根据危险因素构成推断,儿童突破性感染92.31%(12/13)归因于家庭内部传播,是最主要的传播途径,而其他水平传播途径占7.69%(1/13),是次要传播途径。其中家庭内部归因于母亲75%(8/12),其他家庭成员的水平传播占25%(4/12)。儿童中抗-HBs滴度≥10m IU/ml比例达到了70%以上,HBs Ag阴性母亲所生幼儿其抗-HBs滴度几何均数为22.76m IU/ml,HBs Ag阳性母亲所生幼儿其抗-HBs滴度几何均数为39.06m IU/ml,两者差异有统计学意义(t=2.31,P<0.05)。不管母亲HBs Ag状态如何,幼儿的年龄是影响抗-HBs滴度水平的重要因素,>3岁组高于≤3岁组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.成人HBV新感染研究中符合病例组纳入标准的215例,符合对照组纳入标准的共567例。病例组中男性142例,占66.05%,男女比例约为2:1;年龄分布以30-39岁组为主,占40.47%。215例中进行乙肝检测的原因以健康体检、有症状为主,分别占36.28%和25.12%。新发感染者中最常见的前叁位症状为:乏力、易疲劳、食欲减退,分别占61.86%、51.16%和44.65%,深色尿和显性黄疸比例最低,分别占20.93%与13.49%。新发感染者中ALT值>80U/L占49.77%,AST值>80U/L占29.30%,AST/ALT>1的有29人,占新发感染者的13.49%。133例新发感染者进行了腹部B超检查,其中52.63%未见异常,10.53%肝脾肿大,8.02%脂肪肝,7.52%肝硬化。临床诊断为“急性乙型病毒性肝炎”有32人,占HBV新发感染的14.88%。根据乙肝六项检测结果分析发现新发感染者血清模式共有12种,其中最常见的是“大叁阳”与“小叁阳”,两者共占所有血清模式的75.82%,HBs Ag与抗-HBs共阳性率达到了8.85%。共有17.67%(38人)接受了抗病毒治疗,6.98%(15人)单独使用中医中药进行治疗,4.65%(10人)进行了抗纤维化治疗,有1例年轻男性短期内发生急性肝衰竭而死亡。多因素分析发现1个保护性因素:乙肝疫苗接种史(OR=0.07,95%CI:0.04-0.12);10个独立危险因素:不使用安全套(OR=2.00,95%CI:1.18-3.38)、乙肝家族史(OR=2.85,95%CI:1.47-5.54)、肝硬化肝癌家族史(OR=4.65,95%CI:1.18-18.27)、刷牙出血史(OR=8.03,95%CI:4.76-13.55)、外出打工史(OR=5.52,95%CI:2.91-10.49)、村卫生室和个体诊所打针输液(OR=3.87,95%CI:2.11-7.1)、手术史(OR=5.27,95%CI:1.44-19.27)、口腔诊疗史(OR=3.87,95%CI:1.88-7.98)、共用毛巾牙刷(OR=4.35,95%CI:2.64-7.17)、在外就餐(OR=4.15,95%CI:2.4-7.19)。根据危险因素互斥分层法推断当前成人HBV新发感染中49.3%由密切生活接触途径感染,是最主要的传播途径,27.91%由医源性传播引起,性接触传播占20.46%,不明原因途径的占2.33%。3.S区基因特征研究纳入的13例儿童突破性HBV感染中,有9例测序成功,215例成人HBV新发感染者中172例测序成功,首次发现的121例慢性无症状携带者中有84例测序成功,叁者中均检出了B、C、D基因型,以C和D型为主,两者共占感染者的90.57%,其中C型占59.62%,D型占30.94%,叁者之间基因型分布无统计学意义(P>0.05)。叁种类型感染者“a”决定簇(aa124-aa147)区aa突变情况:9例突破性HBV感染儿童中共有4例发生aa124-aa147之间的7个氨基酸位点变异,其中I126T最常见,发现2例,G145R发现1例,突变检出率为44.44%;在成人HBV新发感染者中27例中发现了54个aa位点29种类型的aa突变,突变检出率为12.56%,最常见的突变的F134Y检出10例、I126T检出9例;慢性无症状携带者中检出10例12种类型28个位点的aa突变,突变检出率为11.90%,最常见的突变I126T检出9例。儿童突破性HBV感染者“a”决定簇(aa124-aa147)发生aa突变的比例与种类均高于成人新发感染者与慢性无症状携带者(P<0.05)。9例突破性HBV感染儿童中未检出耐药相关突变位点;172例新发感染者中13例检出有耐药相关突变位点,占7.56%(95%CI:4.09%-12.58%),慢性无症状携带者中10例检出了耐药相关突变位点,占11.90%(95%CI:5.86%-20.81%)。结论1.武威市儿童突破性HBV感染率仍较高,是未来消除乙肝的重要障碍之一。突破性HBV感染主要源于家庭内部传播,因此即要对HBV DNA阳性母亲在孕期采取相应措施预防宫内感染,又要对婴儿在出生时及时接种乙肝疫苗与HBIG,并应做好家庭内水平传播的防护。2.成人HBV新发感染以轻度肝损害为主,早期症状不典型,常见症状如乏力、易疲劳等虽然构成比例较高且出现时间较早,但均非HBV感染特异性症状,用于鉴别HBV感染的能力较差。基层卫生机构对HBV新发感染早期鉴别诊断能力较弱,重症患者治疗水平有限,应加强对其进行专业指导和培训。3.成人HBV新发感染预防要采取综合措施。首先应提高成人乙肝疫苗接种率,提倡使用安全套;其次应注意个人口腔卫生,有牙龈炎及时治疗,减少刷牙出血,不要与他人共用毛巾牙刷,在外就餐选择卫生条件较好的场所;最后还应定期加强医院手术室、个体诊所、村卫生室、医院口腔科、口腔诊所的消毒和卫生监督。4.儿童突破性HBV感染者中“a”决定簇aa变异率较高,可能与HBV“a”决定簇变异引起抗原-抗体结合力下降从而降低了乙肝疫苗预防效果有关。因此应加强儿童中突破性HBV感染“a”决定簇变异的监测,并及时评估现有乙肝疫苗的有效性。5.成人HBV新发感染者与慢性HBV携带者中均检出较高的耐药相关aa突变,这些人群是未来潜在的乙肝患者,因此对乙肝患者初治时宜选择强效、高耐药基因屏障药物或进行基因耐药检测后再选择低耐药药物进行抗病毒治疗。因免疫逃逸突变与NA耐药突变存在“镜像改变”,因此HBV如果发生NA大量耐药可能会导致人群乙肝疫苗免疫效果的下降,对现有乙肝免疫策略形成威胁。
刘贯锋[4]2016年在《MiR34a调节HBV复制和对肝癌细胞生长的影响及其机制研究》文中进行了进一步梳理MicroRNAs (miRNAs)是一类非编码小RNA,能在转录后水平上通过降解mRNA或抑制蛋白翻译而调节许多靶基因的表达。这些miRNAs参与了包括细胞发育,凋亡,增殖和分化在内的许多细胞学和生理学过程。肝细胞癌是第六大最常见恶性肿瘤,乙肝或丙肝病毒感染导致的慢性肝病是导致肝癌的主要诱发因素。但是目前对肝癌病人的治疗策略很有限,迫切需要我们去分析肝癌发病的致病机制,来寻找系统有效治疗的新靶标和发现新的早期诊断标志物。许多研究发现,miRNAs参与了乙肝病毒的复制与表达,在病毒与宿主的相互作用中起着关键作用。异常表达的miRNAs也能通过靶向调节与癌症相关信号通路的基因,而作为致癌或抑癌基因参与到肝癌的发病或发展中。异常表达的miRNAs在病毒与宿主互作和肝癌发展中的作用暗示,miRNAs可能成为治疗的靶标或治疗工具。本文的第一部分,我们利用构建的miRNA表达载体库在细胞瞬时转染模型中进行HBV复制相关miRNA分子的筛选,并选择其中具有代表性的niRNA分子进行抗HBV复制的分子机制研究。首先使用具有HBV低水平复制的肝癌细胞系HepG2.2.15作为筛选模型,从我们构建的miRNA表达库中筛选与HBV复制有潜在关联的miRNA。对细胞培养上清HBsAg蛋白表达检测结果发现有5种miRNAs与HBV的HBsAg蛋白表达相关：miR-let-7g, miR-101, miR-345促进了HBsAg的表达,而miR-34a和miR-92b抑制了HBsAg的表达。我们继续在瞬转HBV表达载体的HepG2细胞中检测这5中miRNAs对HBsAg/HbeAg的影响。结果显示miR-34a仍能够显着抑制HBsAg/HBeAg的表达,而其他miRNAs却没有明显效果。通过定量PCR检测,miR-34a在大部分肝癌组织中为低表达水平。所以我们选择miR-34a作为候选基因,研究其在HBV复制中作用及调节机制。我们在HepG2.2.15细胞中检测了miR-34a对上清HBsAg/HBeAg、HBV DNA和HBV细胞内HBV RNA、复制中间体、HBCAg蛋白表达的影响。结果表明,过表达miR-34a显着抑制HBV的复制与表达；而抑制miR-34a表达水平能明显促进HBV的复制与表达。我们进一步研究niR-34a对HBV复制与表达的分子机制研究。通过HBV序列分析,末找到miR-34a的直接靶标；排除了miR-34a直接作用于HBV转录子可能。我们推测,miR-34a有可能通过调节与HBV复制相关的肝转录因子,使用分析软件发现,在对miR-34a预测的靶基因中包含一些重要的与HBV复制相关的肝转录因子,包括HNF1A、FOXA1、HNF4A, HNF4G等。我们使用荧光素酶报告基因检测验证niR-34a对靶基因的作用,结果显示miR-34a表达能降低HNF4A和HNF4G的3'UTR荧光素酶活性。过表达miR-34a能抑制HNF4A mRNA和蛋白的表达。通过定量PCR检测发现,肝癌组织HNF4A表达与miR-34a表达呈负相关。我们也研究了niR-34a对HBV启动子和增强子的影响,我们把所有的HBV启动子克隆到报告基因载体上,并与miR-34a共转染到细胞,荧光素酶报告检测表明,miR-34a的过表达抑制HBV启动子PreS1、PreS2/S和增强子II的活性,这与HNF 4A对HBV的作用一致。以上的结果证明：HNF4A是miR-34a抑制HBV复制与表达的调解者。本文的第二部分,为了研究miR-34a在肝癌中生物学功能,我们在HepG2和Bel7404细胞中分别对miR-34a进行过表达和低表达的研究,采用MTT、细胞转移和侵袭实验和划痕愈合实验方法检测miR-34a对肝癌细胞系转移和增殖的影响。结果表明,miR-34a在肝癌细胞中表达水平与迁移侵袭能正相关；在肝癌细胞中过表达miR-34a显着抑制细胞的增殖和转移,而且miR-34a过表达还能抑制肝癌增殖能力,减缓了细胞周期G1-S的转变。接下来,我们对miR-34a肝癌细胞的调节机制进行了初步研究,使用miRNA预测软件预测发现致癌基因SOX4是miR-34a潜在的靶标,通过使用报告基因检测到SOX4的3'UTR的荧光素酶活性受到miR-34a的显着抑制,所以作为已经在卵巢癌中被报道能促进细胞增殖和转移的致癌基因SOX4是miR-34a的靶基因。SOX4的过表达能部分去除miR-34a对肝癌细胞的转移和增殖的抑制水平。另外,在,niR-34a低表达的细胞中β-catenin蛋白表达上调,并且SOX4的高表达显着增强了β-catenin的表达,这些结果这说明miR-34a的低表达可能通过上调SOX4及激活Wnt/p-catenin信号通路,最终促进细胞的增殖。
杨大荣[5]2015年在《新型肝炎病毒感染体系构建及抗病毒先天免疫应答研究》文中研究说明全球有超过5亿人口属于丙型肝炎病毒(HCV)和/或乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染人群,这些感染者有可能逐步发展为慢性肝炎、肝硬化和肝癌。因缺少理想的病毒感染体系而制约了病毒生活周期、先天免疫反应以及发病机制的相关研究,从而阻碍了研发抗病毒药物的进程。尽管乙肝病毒的预防性疫苗早已上市,HCV疫苗却还未研发成功。相比于其它大部分的病毒感染,HCV感染的主要特征是极易形成慢性感染(约80%)。另一方面,约有20%的HCV感染者能够自动清除体内病毒而不需要接受治疗,表明宿主的先天免疫反应可以控制病毒感染。在病毒感染过程中,诱导I型干扰素和干扰素刺激基因(ISGs)是宿主抵御病毒的主要方式。宿主通过模式识别受体(PRRs)捕获病毒感染所形成的病原体相关分子模式(PAMPs),激活先天免疫应答系统。主要的PRRs包括RIG-I样受体(RLRs)、Toll样受体(TLRs)、Nod样受体(NLRs)和蛋白激酶R(PKR)。然而,HCV和肝细胞抗病毒先天免疫反应之间的复杂相互作用机制未知。本研究工作旨在研发一个理想的HCV和HBV感染细胞培养体系,并基于此体系探究宿主应答病毒感染的先天免疫机制。第一,我们成功分离了一株新型肝癌细胞系HLCZ01。该细胞系来源于一位患有高分化肝癌的男性病人的肝组织。HLCZ01细胞的形态酷似人正常原代肝细胞(PHH),并表达多种肝细胞特异性标志物,包括白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肝细胞核因子4(HNF4)、细胞色素CYP3A4和mi R-122。同时,HLCZ01细胞还表达HCV的四种受体,分别为CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN。第二,HLCZ01细胞系支持HCV和HBV感染的完整生活周期。HLCZ01细胞既支持实验室来源和临床病人血清中的HCV感染和复制,又支持体外来源的和体内病人血清来源的HBV感染和复制。从病毒感染的HLCZ01细胞中组装和释放的HBV和HCV可以再感染原始的HLCZ01细胞。HLCZ01细胞支持HBV和HCV共感染,并且这两种肝炎病毒在HLCZ01细胞中的复制互不干扰。抗HBs Ag和抗CD81特异性抗体可分别阻断HBV和HCV入侵HLCZ01细胞。已开发的抗病毒药物可有效抑制HBV和HCV在HLCZ01细胞中的复制。HLCZ01是世界首例支持HBV和HCV病人血清直接感染以及HBV/HCV共感染的肝癌细胞系,这株细胞系可应用于肝炎病毒生活周期、肝细胞与肝炎病毒相互作用的研究以及抗病毒药物和疫苗的研发。第叁,HLCZ01细胞和PHH具有完整的先天免疫应答系统。一方面,HCV感染肝细胞后可诱导IFN-β和G1P3、ISG12a以及1-8U等抗病毒ISGs的表达。在HLCZ01细胞中,HBV的存在并不影响HCV诱导IFN-β和ISGs的产生。另一方面,HCV感染HLCZ01细胞和PHH至相对较长时间点时,可诱导病毒感染细胞凋亡,这可能是宿主细胞清除病毒的另一种先天免疫应答方式。在肝细胞中沉默TRAIL可抑制HCV诱导的细胞凋亡。RIG-I缺失可下调IFN-β和TRAIL的表达,并阻断病毒诱导的细胞凋亡,从而促进病毒复制。IRF3是RIG-I的下游信号分子,同样参与了TRAIL介导的肝细胞凋亡。第四,mi R-942通过调控ISG12a表达以介导HCV诱导的细胞凋亡。借助于HLCZ01细胞感染体系,找到了介导HCV所致细胞凋亡的重要调控分子ISG12a及其参与HCV诱导细胞凋亡的信号通路。经生物信息学方法预测和实验验证显示,mi R-942是ISG12a的负调控因子。HCV感染可下调mi R-942的表达,并且mi R-942与ISG12a在HCV感染的肝细胞和肝组织中的表达呈负相关性。过表达或沉默mi R-942可分别减弱或增强HCV诱导的细胞调亡。同时,促凋亡蛋白Noxa在HCV感染细胞中被诱导表达,诱导的Noxa可介导ISG12a依赖的肝细胞凋亡。综上所述,本研究工作构建了一株支持HCV和HBV完整生活周期的新型肝癌细胞系HLCZ01。借助于该感染体系,初步揭示了若干宿主应答病毒感染的先天免疫反应节点。RIG-I通路在HCV感染诱导I型干扰素产生和引发TRAIL介导的病毒感染细胞凋亡途径中起关键作用。mi R-942通过调控ISG12a表达可介导Noxa依赖的HCV所致细胞凋亡。
李浩[6]2017年在《利用CRISPR-Cas9基因编辑技术清除乙肝病毒（HBV）感染的研究》文中研究表明乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染会引起慢性肝炎、肝硬化及细胞癌等肝脏疾病,全球每年约有100万人死于乙肝病毒感染引起的肝脏疾病。虽然乙肝疫苗的广泛应用在很大程度上预防了乙肝病毒的传播,然而慢性乙肝的治疗一直处于困境。目前公认有效的治疗药物主要为核苷酸类似物,但核苷酸类似物仅能暂时降低患者血清中的病毒载量,甚至有停药后再度暴发的风险。这主要是因为目前临床上的治疗方法均不能清除乙肝慢性感染和复发的根源,也就是肝细胞内乙肝病毒的共价闭合环状DNA(ccc DNA)和HBV在复制过程中整合至宿主细胞基因组上的整合状态HBV DNA。因此,探寻从根本上清除HBV的方法成为治疗慢性乙肝的当务之急。近年来基于细菌获得性免疫系统CRISPR开发出的CRISPR-Cas9基因编辑技术几乎可以对任何物种进行DNA的精确编辑,这一方便、快捷的技术使得从根本上清除HBV ccc DNA和整合状态的HBV DNA成为了可能。在本研究中,我们首先利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在HBV细胞模型以及HBV小鼠模型中实现了对乙肝病毒复制根源HBV ccc DNA的靶向剪切以及对乙肝病毒复制与表达的高效抑制。随后,我们又利用该技术在清除HBV ccc DNA的同时,完全清除了HBV细胞模型中全长整合的HBV基因组,实现了对感染细胞中HBV更加彻底的清除。最后,为了检测CRISPR-Cas9在清除HBV过程中对细胞基因组造成的影响,我们利用全基因组测序技术评估了感染及清除HBV前后宿主细胞基因组的变化,并首次发现了宿主细胞基因组上有大量SNP会随着HBV的清除而恢复至HBV感染前的类型。1.CRISPR-Cas9抑制HBV复制与表达的研究(1)剪切HBV DNA的高效gRNA靶点筛选由于HBV基因组变异位点较多,开放阅读框高度重迭,且宿主细胞中存在多种形式的HBV DNA,为了筛选出能够高效剪切HBV基因组的g RNA靶点,我们通过生物信息学比对以及对CRISPR-Cas9剪切活性的检测,从8个候选g RNA中筛选出了对HBV DNA剪切及抑制效率最高的g RNA-S4靶点。通过深度测序,我们证实了该系统对HBV基因组的剪切作用并评估了该系统的剪切效率。(2)利用gRNA-S4系统高效抑制细胞及小鼠体内HBV的复制与表达我们利用HBV稳转细胞系Hep G2.A64以及HBV高压水动力小鼠分别作为模型,分别检测了g RNA-S4在体内、外对HBV复制的抑制效果。结果显示,g RNA-S4在细胞中高效抑制了HBV复制与表达并将HBV ccc DNA含量降低了95.37±0.64%。我们还利用该系统将HBV高压水动力小鼠血清中的HBs Ag含量降低了99.92±0.04%,将小鼠血清中的HBV DNA降至了阴性临界值以下。(3)CRISPR-Cas9靶向HBV的特点分析在上述实验中,由于细胞中存在多种形式的HBV DNA,其中环状HBV DNA在CRISPR-Cas9剪切后即降解。因此,我们在研究中发现CRISPR-Cas9对细胞中HBV的剪切效率实际上要远低于对HBV表达的抑制效率。此外,由于HBV基因组编码区的高度重迭,我们仅用破坏一个位点便可抑制HBV全部基因的表达。2 CRISPR-Cas9清除整合状态HBV DNA的研究HBV在感染过程中会将病毒基因组整合到宿主细胞染色体上,而这些整合的HBV DNA被认为是肝细胞癌发生的重要因素,会引起宿主基因组的变异进而改变细胞增殖与分化相关基因的表达。同时,实验室常用的HBV转基因细胞模型中除了含有HBV ccc DNA均整合有HBV的全长基因组,且全长整合的HBV DNA是稳转细胞模型中HBV复制与表达的主要模板。因此,为了实现对HBV感染的清除,除了靶向降解HBV ccc DNA之外,我们还必须清除细胞染色体上全长整合的HBV DNA。由于HBV稳转细胞中的乙肝病毒生活周期及复制模式与实际情况类似,均存在HBV ccc DNA和HBV复制中间体等多种形式的HBV DNA。因此利用CRISPR-Cas9在HBV稳转细胞模型中清除全长整合的HBV DNA同样能够很好地模拟真实感染中清除HBV DNA整合片段的过程。(1)建立了特异性扩增HBV稳转细胞中全长整合HBV DNA的新方法由于HBV细胞模型中HBV整合位点较多,且细胞内存在多种形式的HBV DNA,利用Alu-PCR以及细胞全基因组测序均难以定位出全长整合HBV基因组的具体位置。在本部分实验中,我们建立了一种特异性扩增HBV稳转细胞模型中全长整合HBV基因组的新方法,即利用HBV全长整合位点3’端外源启动子特异性引物,实现对细胞基因组中全长整合HBV基因组的扩增。(2)首次清除HBV稳转细胞中全长整合的HBV DNA我们利用靶向全长整合HBV基因组两端侧翼序列的gRNA-69系统成功清除了细胞中全长整合的HBV基因组。在清除细胞中全长整合的HBV DNA后,细胞中的HBV ccc DNA、HBs Ag、HBe Ag、HBV DNA在连续300天的培养中均无法检出。这部分结果表明,我们首次利用CRISPR-Cas9系统清除了细胞内的HBV感染。3清除HBV前后宿主细胞全基因组测序及分析(1)清除HBV感染后细胞基因组中HBV整合位点大量消失为了探究CRISPR-Cas9在清除HBV的过程中对宿主细胞基因组可能造成的影响,我们对HBV清除前后的细胞株以及HBV整合前的Hep G2细胞株分别进行了全基因组测序。通过对3株细胞HBV整合位点的分析,我们发现相比清除HBV前的细胞Hep G2.A64,清除了HBV后的69-7细胞基因组中HBV的随机整合位点减少了97.7%。(2)清除HBV感染后细胞基因组中大量SNP恢复至HBV感染前状态通过对HBV感染及清除前后3个细胞基因组上突变尤其是SNP的分析,我们发现,HBV感染后的A64细胞中共有2,284,202个SNP位点发生了变异,而其中的2,093,238的SNP位点在HBV被清除后恢复成了HBV感染前的状态。(3)排除CRISPR-Cas9脱靶效应及细胞污染的可能性为了进一步探究清除HBV感染后宿主细胞基因组突变恢复的原因,我们首先利用同源序列分析了g RNA的脱靶效应,证实了g RNA-69不存在明显的脱靶效应。然后通过对HBV整合位点的分析,证实了清除HBV后的69-7细胞并非此前HBV感染细胞A64中污染的Hep G2细胞。最后通过对g RNA-69剪切后的残余序列进一步分析,证实了清除HBV后的69-7细胞并非g RNA-69转染之前存在于A64细胞中的亚克隆,而是g RNA-69剪切A64细胞中HBV后所形成的细胞克隆。这部分结果否定了细胞基因组突变的恢复与CRISPR-Cas9的脱靶及细胞污染有关。(4)清除HBV感染后细胞基因组突变恢复的原因分析通过对HBV感染及清除前后细胞基因组SNP类型变化情况的分析结果以及宿主细胞DNA修复通路中RAD51基因表达量的检测结果我们推测,这种杂合SNP的恢复或许是由于存在同源修复模板,进而在DNA修复系统的参与下实现的恢复。本次研究中,我们利用CRISPR-Cas9技术首次实现了对宿主细胞内乙肝病毒感染的清除,深入分析了CRISPR-Cas9在清除HBV过程中的脱靶效应、抑制效率以及作用时间。在清除了HBV感染后的细胞基因组中,我们还观察到了大量HBV的整合位点以及宿主细胞基因组变异会随着HBV的清除而恢复。本次研究展现了CRISPR-Cas9技术在根治慢性乙肝以及阻断其向肝细胞癌发展方面的巨大潜力。此外,清除HBV感染后宿主细胞基因组上的新发现也将为今后进一步研究乙肝病毒与宿主基因组的相互作用以及乙肝病毒致癌机制提供新的线索。
关妘[7]2017年在《肝脏特有CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群的发现及HBV感染时转录因子对免疫细胞受体及配体表达调控的研究》文中指出研究目的:近年来,越来越多的证据表明,肝脏不仅是机体最大的代谢解毒器官,也是机体重要的免疫器官,并且具有独特的免疫学特点。肝脏独特的生理功能、解剖结构和组织微环境促使其含有独特的免疫细胞组成、细胞亚群和功能分子,形成了独特区域免疫的特性,这些特点也促使肝脏成为以天然免疫细胞(NK、NKT和γδ T细胞)占优势的免疫器官。现已在肝脏内发现一群具有组织特异性的CD49a+DX5-NK细胞,这群细胞只在肝脏大量聚集并具有不同于外周血和其他部位NK细胞的独特表型和功能特点,其他天然免疫细胞是否亦能够特异性存在肝脏并具有独特的表型和功能特点尚缺乏系统研究。γδ T细胞是一个具有天然免疫特性的独特的免疫细胞群体,其在淋巴细胞中所占比例虽低,但应答迅速,在面对外来微生物感染或应激状态下能够迅速产生细胞因子,发挥抗细菌、病毒感染和抗肿瘤的作用,被视为机体免疫防御和免疫监视的第一道防线。γδ T细胞在肝脏中的比例远高于外周血,约占肝脏T细胞的15-25%左右,肝脏独特的区域免疫学特性亦赋予肝脏γδ T细胞不同于其他部位γδ T细胞的功能特点,但肝脏中是否含有特异性驻留于肝脏的γδ T细胞以及它们在维持肝脏独特的免疫微环境中的作用尚不清楚。在HBV慢性感染发生时,可使肝脏的免疫耐受状态加重,抑制肝脏微环境中免疫细胞(包括CD8+T细胞和NK细胞)的功能,甚至导致这些细胞功能耗竭,主要表现为细胞数量和分泌的细胞因子减少、细胞活化降低,同时伴随着细胞表面活化性受体表达下降和抑制性受体表达升高。免疫细胞功能的减弱促进了HBV逃逸免疫系统的监视和攻击,但HBV逃逸免疫细胞攻击的确切机制尚不明确。本研究一方面通过比较小鼠肝脏、脾脏、胸腺和小肠上皮内γδ T细胞的表型差异发现了一群仅存在于肝脏中的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群,这群细胞具有肝脏驻留的特性。在小鼠HBV急性感染模型中,肝脏CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例和分泌IFN-γ的水平均增高,提示这群细胞在抵抗HBV急性感染中的重要作用。另一方面,我们发现HBV慢性感染时转录因子Eomes可促进CD8+T细胞表面抑制性受体的表达,促进T细胞耗竭和HBV免疫逃逸;转录因子GATA-2和GATA-3可与HBx蛋白形成叁聚体进而抑制NKG2D配体MICA的表达,削弱NK细胞对HBV感染的肝癌细胞的杀伤能力,促使HBV感染的肝癌细胞逃逸NK细胞的杀伤。方法:1流式细胞术检测了 C57BL/6J小鼠肝脏、脾脏、胸腺、骨髓、外周血和小肠上皮内γδ T细胞的比例。2 Q-PCR和流式细胞术检测C57BL/6J小鼠肝脏、脾脏、胸腺和小肠上皮内γδ T细胞表面的趋化因子受体、粘附分子、与细胞因子分泌相关的标记和细胞表面受体的表达。3流式细胞术检测成年鼠肝脏中CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例、细胞表面驻留相关标记和细胞内转录因子的表达。4 RT-PCR检测胎鼠和成年鼠胸腺和肝脏中γδ T细胞的亚群,流式细胞术检测胎鼠到成年鼠各个阶段胸腺和肝脏中γδ T细胞的比例、CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例、细胞表面驻留相关标记和细胞内转录因子的表达。5建立CD45.1和CD45.2联体小鼠模型,流式细胞术检测CD45.1+和CD45.2+的CXCR3~+CXCR6~+γδ T在CD45.1和CD45.2小鼠体内的分布。6灌流法提取小了鼠肝窦内皮细胞并进行体外培养,24h后收集上清,ELISA检测收集的上清中趋化因子CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL16的水平;Transwell法检测肝窦内皮细胞对CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的趋化作用。7灌流法提取小鼠肝窦内皮细胞,流式细胞术检测肝窦内皮细胞表面integrinβ7的表达。8分离小鼠肝淋巴细胞,体外经PMA/ion刺激,BFA阻断细胞因子分泌后,流式细胞术检测CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞分泌IFN-y和IL-17的水平及转录因子RORyt和T-bet的表达。9流式细胞术分选肝脏和胸腺中处于发育不同阶段的T细胞前体,Q-PCR检测转录因子 Eomes、PU.1、PLZF、Sox13、Rorc、Sox4 和 Id3 的表达。10分离C57BL/6J和GKO小鼠肝淋巴细胞,流式细胞术检测CXCR3~+CXCR6~+γδ T的比例。11尾静脉高压注射pAAVHBV1.2质粒建立小鼠HBV急性感染模型,分别在感染后的3d、7d、10d和14d检测CXCR3~+CXCR6~+γδ T的比例和分泌IFN-y和IL-17的水平。12流式细胞术分选CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞,过继转输到TCRδ-/-鼠中,分别以WT鼠、TCRδ-/-鼠和过继转输CXCR3~+CXCR6~+γδ T的TCRδ-/-鼠建立HBV急性感染模型,在高压注射HBV后0.5W、1W、2W、3W和4W时尾静脉取血,分离血清,化学发光法检测血清中HBsAg和HBeAg的含量。13建立小鼠HBV慢性感染模型,流式细胞术检测CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞比例和分泌细胞因子的水平,以及CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞表面活化性受体CD69和抑制性受体PD-1、LAG-3和CTLA4的表达。14建立小鼠HBV慢性感染模型,分离肝脏和脾脏淋巴细胞后,用流式细胞术检测了 CD4+T和CD8+T细胞表面抑制性受体BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1和LAG-3的表达。15建立小鼠HBV的慢性感染模型,分离肝脏和脾脏淋巴细胞后,流式细胞术检测 Eomes+CD8+ T 细胞、Eomes-CD8+ T 细胞、Eomes+HBV 特异性 CD8+ T 细胞和Eomes-HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性受体BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1 和 LAG-3 的表达。16分别在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感染模型,分离小鼠肝淋巴细胞后,流式细胞术检测CD8+ T细胞和HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性受体的表达。17分别在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感染模型,分离肝脏淋巴细胞体外经PMA/ion刺激、BFA阻断细胞因子分泌后,用流式细胞术检测HBV特异性CD8+ T细胞分泌TNF-α、IL-2和IFN-γ的水平。18分别在WT和EKO小鼠中建立HBV慢性感染模型,在尾静脉高压注射HBV质粒后3W、4W、5W、6W和12W尾静脉取血,化学发光法检测血清中HBsAg、HBeAg水平和HBV DNA的载量,用免疫组化检测HBV慢性感染模型建立成功的C57BL/6J小鼠和EKO小鼠肝组织中HBcAg的含量。19提取WT和EKO小鼠肝淋巴细胞,Q-PCR检测NFATc1、Blimp1、FoxO1和Nfil3的水平,Western Blot技术检测NFATc1的表达。20染色质免疫共沉淀技术检测Eomes与肝淋巴细胞中CD160和LAG-3启动子的结合。21 以 HepG2、HepG2.2.15、HepG2-N1 和 HepG2-HBV 为研究对象,用 Q-PCR和流式细胞术检测细胞中NKG2D配体的表达。22 以 HepG2、HepG2-HBV 和 HepG2.2.15 为研究对象,加入 MICA/B 和 NKG2D的阻断抗体后,CFSE/7AAD法检测NKL细胞对其的杀伤活性。23 HepG2 细胞转染 pEGFP-HBx、pEGFP-HBc、pEGFP-HBs 和 pEGFP-HBp后,Western Blot技术检测肝癌细胞表面MICA的表达。24 以 HepG2-N1、HepG2-X 和 HepG2-C 为研究对象,加入 MICA/B 和 NKG2D的阻断抗体后,CFSE/7AAD法检测NKL细胞对其的杀伤活性。25 用 GATA-2 siRNA 和 GATA-3 siRNA 沉默 HepG2 细胞 GATA-2 和 GATA-3的表达,Western Blot技术检测MICA的表达。26免疫共沉淀技术检测HBx、GATA-2和GATA-3是否可形成叁聚体。27染色质免疫共沉淀技术检测HBc蛋白是否可与MICA和MICB启动子中的CpG岛区结合。结果:一、肝脏特有的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群的发现1肝脏存在特有的γδ T细胞流式细胞术检测C57BL/6J小鼠的骨髓、小肠上皮内、淋巴结、肝脏、皮肤、脾脏和胸腺内γδ T细胞的比例,发现除了富含γδ T细胞的皮肤和小肠上皮外,肝脏内γδ T细胞的比例也很高,说明肝脏也是富含γδ T细胞的器官之一。同时,比较了裸鼠和C57BL/6J小鼠小肠上皮、淋巴结、肝脏和脾脏中γδ T细胞的比例,发现裸鼠肝脏中依然存在γδ T细胞,虽然比例低于C57BL/6J小鼠,这说明肝脏中存在一群特有的γδ T细胞,它们的存在不受胸腺的影响。2肝脏中存在CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群Q-PCR和流式细胞术检测发现CXCR3和CXCR6在肝脏中特异性高表达,进而发现了一群只在肝脏中存在的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群,流式细胞术检测这群细胞的表面标记和转录因子,发现这群细胞表达的细胞驻留性标记CD 103、CD69、CD44、CD49a 和 PLZF 的水平较高,提示肝脏中 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞可能是驻留在肝脏的,是肝脏特有的一群γδ T细胞。3 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群从胚胎期一直存在首先,我们用普通PCR检测了胚胎和成年时期肝脏和胸腺内γδ T细胞的亚群,发现胚胎期间肝脏一直存在Vγ2和Vγ4的γδ T细胞,用流式细胞术进一步验证了小鼠从胚胎期到成年一直存在γδ T细胞,并且CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群从胚胎到成年也一直存在。接下来,我们发现胚胎期到成年期CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群的驻留相关的标记和转录因子表达一致,说明这群细胞从胚胎时期一直驻留在肝脏中,是肝脏特有的γδ T细胞亚群。4 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞是特异性驻留于肝脏的γδ T细胞亚群在CD45.1和CD45.2联体小鼠模型中发现CD45.1+的CXCR3~+CXCR6~+γδ T几乎全部存在于CD45.1小鼠肝脏中,CD45.2+的CXCR3~+CXCR6~+γδ T也几乎全部存在于CD45.2小鼠肝脏中,说明CD45.1+和CD45.2+的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞没有进入体循环,是驻留于小鼠肝脏中的。5肝窦内皮细胞促进CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞在肝脏驻留ELISA结果发现小鼠肝窦内皮细胞分泌高水平的CXCL9、CXCL11和CXCL16。Transwell实验证明肝窦内皮细胞可通过分泌CXCL9、CXCL11和CXCL16 募集 CXCR3~+CXCR6~+γδ T,中和 CXCL9、CXCL11 和 CXCL16 后,肝窦内皮细胞对CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的募集作用减弱,而肝窦内皮细胞表面的integrinβ7与CD103结合促进CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的驻留。6 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞是分泌IFN-γ为主的细胞流式细胞术检测结果发现CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞分泌IFN-y的水平高于IL-17,并且转录因子T-bet的表达高于RORγt。肝脏T细胞前体中调控IFN-γ分泌的相关转录因子高于调控IL-17分泌的相关转录因子。7 IFN-γ缺失不影响CXCR3+CXCR6+ γ δ T细胞的比例GKO小鼠肝脏中CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞没有变化,说明小鼠缺失IFN-y不影响CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例。8 CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞参与抵抗HBV急性感染流式细胞术结果发现HBV急性感染早期CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞分泌的1FN-γ减少,HBV急性感染7d以后,CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞分泌的IFN-y增加。向TCRδ-/-鼠中转输CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞后发现小鼠体内HBsAg和HBeAg的量明显降低,说明CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞可参与抵抗HBV急性感染,并且在一定条件下产生IL-17增多。在小鼠HBV慢性感染模型中,CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞的比例略有下降,分泌IFN-γ量增多,IL-17的量不变,同时CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞表面的活化性受体CD69表达增加,抑制性受体PD-1、LAG-3和CTLA4的表达基本不变。二、HBV感染时转录因子对免疫细胞受体及配体表达调控的研究1 HBV慢性感染导致T细胞表面抑制性分子表达升高HBV慢性感染小鼠肝脏和脾脏中CD4+和CD8+ T细胞表面的抑制性分子BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1和LAG-3表达均高于正常小鼠,尤其是肝脏中的CD8+ T细胞更为明显,说明HBV慢性感染可加重肝脏的免疫抑制状态。2 Eomes与CD8+T细胞表面抑制性分子的表达呈正相关HBV慢性感染小鼠肝脏中Eomes+的CD8+ T细胞表达抑制性分子BTLA、CD160、Tim-3、CTLA4、PD-1 和 LAG-3 的水平高于 Eomes的 CD8+ T 细胞。HBV慢性感染的WT鼠肝脏中CD8+ T细胞表面制性分子的表达高于EKO小鼠。这些结果说明Eomes可促进CD8+T细胞表现抑制性分子的表达。3 WT小鼠肝脏HBV特异性CD8+ T细胞抑制性分子的表达高于EKO小鼠小鼠肝脏中Eomes+的HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性分子PD-1、Tim-3、CD160和LAG-3的表达水平高于Eomes-的HBV特异性CD8+ T细胞;WT鼠肝脏中HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性分子的表达水平也高于EKO鼠。饼图分析结果提示Eomes可促进HBV特异性CD8+ T细胞表面抑制性分子的共表达。4 WT和EKO小鼠肝脏HBV特异性CD8+ T效应功能无明显区别WT鼠HBV特异性CD8+ T细胞分泌的IL-2、TNF-α和IFN-γ水平与EKO小鼠没有区别,说明Eomes不影响CD8+ T细胞分泌IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的能力。5 Eomes缺失可促使HBV病毒的快速清除WT鼠尾静脉高压注射HBV质粒后血清中HBs抗原、HBe抗原水平、HBV DNA的载量和肝脏中HBcAg的含量均高于EKO鼠,表明小鼠缺失Eomes分子后,清除HBV病毒的能力更强。6 Eomes可直接与CD160启动子结合进而促进CD160的表达WT小鼠肝脏淋巴细胞NFATc1、Blimp-1和FoxO1的表达水平均高于EKO小鼠,染色质免疫共沉淀结果显示转录因子Eomes可直接与抑制性分子CD160启动子序列结合,直接调控其表达。7 HBV阳性肝癌细胞表面NKG2D配体的表达低于HBV阴性肝癌细胞Q-PCR和流式结果显示HepG2.2.15和HepG2-HBV细胞表面NKG2D的配体MICA、MICB和ULBP1,2,3的表达低于HepG2和HepG2-N1细胞,NK细胞对HepG2-HBV和HepG2.2.15细胞的杀伤活性明显低于HepG2细胞,MICA/B和NKG2D阻断抗体可进一步降低NK细胞对肝癌细胞的杀伤。8 HBx基因和HBc基因明显下调HepG2细胞表面NKG2D配体流式细胞术和Western Blot结果显示转染HBx和HBc基因后,HepG2细胞表面的MICA表达明显降低。HepG2-X和HepG2-C细胞对NK细胞杀伤敏感性明显低于HepG2-N1细胞,MICA/B和NKG2D阻断抗体可进一步降低肝癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性。9 GATA-2和GATA-3抑制肝癌表面MICA的表达经网站预测发现MCA启动子上含有转录因子GATA-2和GATA-3的结合位点,HepG2.2.15细胞中沉默GATA-2和GATA-3表达后,MICA的表达增加。10 HBx和GATA-2/GATA-3共同抑制MICA的表达染色质免疫共沉淀结果显示GATA-2和GATA-3可以直接结合在MICA启动子上,沉默HBx基因后,GATA-2和GATA-3与MICA启动子的结合降低。免疫共沉淀实验证明GATA-2、GATA-3和HBx蛋白可以形成叁聚体。11 HBc核心蛋白可直接与MICA启动子的CpG岛结合抑制MICA的表达染色质免疫共沉淀显示HBc蛋白可直接与MICA和MICB启动子上的CpG岛结合,而HBc蛋白不能与GATA-2和GATA-3形成叁聚体。结论及意义:1本研究通过比较小鼠肝脏、脾脏、胸腺和小肠上皮内γδ T细胞的表型差异,首次发现了一群仅存在于肝脏中的CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞亚群,并且这群细胞具有肝脏驻留的特性。在小鼠HBV急性感染模型模型中,过继转输CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞可抵抗HBV急性感染;在HBV慢性感染模型中,CXCR3~+CXCR6~+γδ T细胞产生更多的IFN-γ并高表达CD69,细胞处于活化状态,提示我们这群细胞可能不参与维持肝脏免疫耐受,但发挥的具体作用还不清楚,还需进一步验证。2我们首次发现HBV慢性感染时转录因子Eomes可促进CD8+ T细胞表面抑制性受
毛莹莹[8]2016年在《基于腺相关病毒载体的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治疗研究》文中认为乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)引起的传染病。HBV感染是一个非常严重的全球性公共卫生问题,是严重危害人类健康的重大传染病之一。据统计,全球大约有3.5亿慢性HBV感染者,每年全球大约有100万人死于与HBV感染相关的疾病,包括肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌等。中国是乙型病毒性肝炎的高流行地区,人群感染率高,在某些地区感染率高达35%以上,给国家带来沉重的社会经济负担。我国HBV携带者约9300万人,其中慢性乙肝患者高达2500万,是我国最为严重的叁大传染病之一,也是我国肝细胞癌(HCC)高发的重要原因。目前临床上对乙肝病毒感染的主要治疗药物包括干扰素、核苷及核苷酸类似物等,但是这些药物只能在少数慢性感染患者中产生长期应答,并不能彻底清除乙肝病毒,并且也存在着复发率高、药物毒副作用较大和药品价格昂贵等问题,因此发展慢性乙肝新的治疗策略仍是医学上面临的巨大挑战。基因治疗作为生物技术新的里程碑,是生物技术产业发展的主方向之一,曾被Science杂志评为2009年10大科学突破之一,而其中值得关注的是,重组腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体在治疗先天性黑蒙病中及B型血友病等疾病的基因治疗临床试验中取得了突破性的进展,第一个用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的AAV载体介导的基因治疗药物Glybera已在欧美国家批准上市。AAV以其低致病性、低免疫原性、能导致外源基因长期表达等优点被视为最具有开发潜质的病毒载体之一。而根据多篇文章报道,在众多AAV血清型中,8型腺相关病毒(AAV-8)对肝脏细胞的转导效率较高,是肝脏疾病基因治疗常用载体。miRNA是一类由内源性非蛋白质编码基因转录加工形成的长约21 nt的小分子单链RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经Dicer酶加工后生成,在动植物中参与转录后基因表达调控。人工miRNA (artificial miRNA, amiRNA)是指将天然miRNA的成熟序列替换为人工设计的靶向某一基因的反义序列,可模拟内源miRNA的作用机制人为地沉默目的基因,由于amiRNA利用了miRNA的天然生成途径,同时相对于shRNA具有干扰效果更好、体内毒性更低等优点而逐渐成为研究的新热点。本课题应用8型腺相关病毒载体携带叁个串联表达的amiRNA进行抗HBV的基因治疗研究。本课题第一部分探索了应用肝靶向性较好的AAV-8载体介导3个串联表达的amiRNA对乙肝模型小鼠体内HBV抑制作用的研究。本课题组成员在前期研究中构建了3条靶向不同基因型HBV的基因组保守区并去除任何靶向人和小鼠非特异序列的amiRNA,实验证明其对HBsAg和HBeAg匀有显着的抑制效果且3个串联表达的amiRNA较单个的amiRNA有更高的抑制HBV复制的作用。本研究中,我们构建了携带肝特异性启动子的3个串联amiRNA的rAAV表达质粒并命名为pAAV-liver-amiRNA135,通过将pAAV-liver-amiRNA135与不同基因型HBV表达质粒共转染HepG2细胞,在体外证明其对不同基因型HBV的HBsAg、HBeAg的表达以及HBV DNA的复制均有显着抑制作用(p<0.01)。接着,我们将pAAV-liver-amiRNA135包装成与质粒相比对肝脏细胞转导效率更高的重组腺相关病毒载体即AAV8-amiRNA135,然后对其进行药效学评价,为后期较深入的临床前研究和临床研究提供参考。首先,我们利用乙肝病毒低复制转基因小鼠联合水动力注射HBV表达质粒以维持小鼠肝内HBV长期高复制表达的方法构建了肝内HBV高复制的乙肝模型鼠并进行AAV8-amiRNA135的梯度药效学实验。将AAV8-amiRNA135以5×1011vg/只、5×1010vg/只、5×109vg/只、5×108vg/只经尾静脉分别注射模型小鼠,并以注射5×1011vg/只携带不靶向人类及老鼠任何基因的amiRNA序列的AAV8-Neg为阴性对照组,以注射5×1011vg/只携带双荧光素酶基因的AAV8-luc载体为空白对照组,在注射后不同时间点内采静脉血,用定量ELISA方法检测血清中HBsAg及HBeAg的表达水平,结果显示,AAV8-amiRNA135对乙肝模型小鼠血清HBsAg及HBeAg的抑制效果具有剂量依赖性,尤其是注射5×1011vg/只AAV8-amiRNA135的乙肝模型小鼠血清中HBsAg、 HBeAg;表达水平显着下降,甚至接近阴性水平。更重要的是,我们发现单次尾静脉注射AAV8-amiRNA135能有效抑制HBV复制至少15个月。接着,我们通过颈椎脱臼法处死小鼠,提取肝脏组织乙肝病毒核心颗粒DNA来检钡HBV DNA的拷贝数水平,结果显示,肝脏组织中HBVDNA拷贝数随着该病毒载体注射剂量的增大而显着降低(p<0.01),说明了amiRNA135的表达能有效抑制肝内HBVDNA的复制。此外,我们对肝脏组织进行了HE染色及针对乙肝表面抗原HBsAg和核心抗原HBcAg的免疫组织化学染色。HE染色结果显示,阴性对照组小鼠肝组织切片可见明显炎症细胞浸润,肝小叶结构紊乱,肝炎病理特征较明显；注射5×109vg AAV8-amiRNA135小鼠肝脏组织与阴性对照组相比,炎症细胞相对较少,有较为整齐的肝小叶结构；注射剂量为5×1010vg及5×1011vgAAV8-amiRNA135的小鼠,肝细胞形态正常,肝小叶排列整齐且无明显炎症细胞浸润,说明注射剂量为5x1010vg及5×1011Vg的AAV8-amiRNA135能有效抑制肝炎反应且无明显肝毒性。通过免疫组织化学染色法检测肝脏组织中HBsAg和HBcAg的表达水平,结果显示,肝脏组织中HBsAg和HBcAgP阳性细胞数均随着AAV8-amiRNA135注射剂量的增大而减少,说明AAV8-amiRNA135对乙肝转基因小鼠肝组织中HBsAg,及HBcAg的表达均有显着抑制作用,且抑制效果具有剂量依赖性。后续随着实验室高复制乙肝转基因小鼠模型的成功构建,我们进一步研究比较了AAV8-amiRNA135对不同品系的高复制乙肝转基因小鼠的抗HBV作用。HBV转基因小鼠选择了叁个品系,分别为C16-4♀、2C♂和2B♂、2B♀。将AAV8-amiRNA135以5×10¨vg/只经尾静脉分别注射以上小鼠,以注射5×1011vg/只的AAV8-Neg为阴性对照组,在注射后第1、2、3周采静脉血检测血清中HBsAg及HBeAg的表达水平,结果显示,AAV8-amiRNA135对叁个品系的乙肝转基因小鼠均有较好的抑制作用,其对血清中HBsAg的抑制效率均达到80%-90%,对HBeAg的抑制效率也达到40%-70%。注射病毒载体后第4周,通过颈椎脱臼法处死小鼠,对肝脏组织HBV DNA及HBV RNA拷贝数水平进行定量检测,结果显示,注射AAV8-amiRNA135的乙肝转基因小鼠肝组织中HBV DNA及HBV RNA拷贝数均显着低于阴性对照组(p<0.05),说明了amiRNA135的表达能有效抑制不同品系乙肝转基因小鼠肝脏组织中HBVDNA及RNA的复制。综上所述,这一部分研究所构建的AAV8-amiRNA135载体对HBV具有广泛而显着的抑制作用,且单次载体灌注能有效发挥抑制作用至少15个月,本研究结果为慢性乙肝的基因治疗开辟了新路径。为进一步提高AAV介导的肝脏疾病基因治疗效率,本课题第二部分和第叁部分内容旨在探索肝靶向性更高的重组腺相关病毒载体。在目前发现的众多AAV血清型中,已知AAV-8是肝脏基因治疗最常用的载体之一；AAV-DJ是将8种不同血清型AAV的衣壳基因通过DNA shuffling技术得到的嵌合型AAV载体,具有与AAV-8相同的肝靶向性且人体内存在的AAV抗体对它的中和性较低,因此也被认为是人类肝脏疾病基因治疗理想的载体之一。但尽管如此,AAV在肝脏基因转导的应用还具有一定的挑战性,例如,机体对AAV衣壳蛋白的免疫排斥、泛素蛋白酶体介导的蛋白降解途径均能使AAV在细胞内发生降解,从而降低其介导的基因传递效率。因此,为了降低AAV的免疫源性及胞内降解率,需要进一步优化AAV载体,从而提高其转导效率。据文献报道,对AAV衣壳蛋白表面特定的磷酸化/泛素化残基(如酪氨酸,赖氨酸,丝苏氨酸等)进行突变能进一步提高其转导效率,原因是这些位点突变后能阻断下游的泛素化介导的蛋白降解,从而提高AAV载体介导外源基因在细胞内的表达效率。我们首先利用磷酸化/泛素化位点预测软件,选定了叁个AAV8的突变位点和叁个AAV-DJ的突变位点,然后利用overlap-PC R方法进行定点突变,构建了叁个AAV8的突变体：Y447F、Y703F和Y708F,以及叁个AAV-DJ的突变体：K137,T251A, S503A。通过PEI转染法将突变的cap质粒、病毒包装辅助质粒pAAV-Helper及外源基因表达质粒共转染293T细胞,包装成表达GFP基因和/或双荧光素酶Gluc-Fluc基因的重组AAV载体。首先将表达双荧光素酶Gluc-Fluc基因的重组野生型AAV-8及其叁个酪氨酸突变体(Y447F、Y703F和Y708F)以1×1010vg注射6-8周龄的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾静脉血检钡Gluc的表达,结果显示,Y703F突变体介导Gluc的相对表达量在不同时间点均显着高于野生型AAV8约3-4倍(P<0.05)。注射42天后麻醉小鼠,利用活体成像方法检测各载体的体内靶向性,结果显示,叁种突变体均具有肝靶向性,与野生型AAV-8一致,且Y703F介导的Fluc在肝脏组织中的平均光强度显着高于野生型AAV-8约2倍(P<0.01)。活体成像实验后处死小鼠,提取各组织DNA,调整上样DNA模板至相同浓度,用QPCR方法检测Fluc DNA的水平,结果显示,在肝脏组织中,四种载体介导的Fluc DNA拷贝数在106～107GC (genomecopy) /100ng总DNA,而在其他组织,例如肾脏、心脏及肌肉组织,四种载体介导的Fluc的DNA拷贝数则低至105～106GC/100ng ,总DNA,进一步说明了叁个酪氨酸突变体的肝靶向性没有改变,而且Y703F突变体介导的Fluc对小鼠肝脏、肾脏及肌肉的转导效率均高于野生型AAV-8约3-7倍(P<0.01)。为了进一步验证该突变体的有效性,我们还比较了携带治疗性基因血管紧张素1-7 (Angiotemin 1-7 ,Ang (1-7))的wtAAV-8及其Y703F突变体在C57BL/6小鼠体内的转导效率,将两种病毒以1×1011vg经尾静脉分别注射小鼠,以注射1×1011vg Y703F-Luc为阴性对照组,在注射后第7,14,21,28天检测血清中Ang(1-7)的表达水平,结果显示,Y703F介导的Ang(1-7)表达水平从第14天开始显着高于wtAAV-8约2倍(p<0.01)；肝组织DNA拷贝数分析结果显示,Y703F介导的Ang(1-7)在肝脏的DNA拷贝数显着高于wtAAV-8约3倍(p<0.001)。因此我们得出,对AAV-8衣壳蛋白703位点上的酪氨酸残基进行突变能有效提高其对肝脏的转导效率,且该突变体具有与wtAAV-8相一致的肝靶向性。同样地,我们将表达双荧光素酶Gluc- F luc基因的AAV-DJ及其叁个突变体(K137R, T251A, $503A)以l×1011vg注射6-8周龄的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾静脉血检钡Gluc的表达,结果显示,S503A突变体介导Gluc的相对表达量在不同的时间点均高于AAV-DJ约3倍(P<0.01)。注射42天后麻醉小鼠,利用活体成像方法检测各载体的体内靶向性,结果显示,叁种突变体均具有肝靶向性,与AAV-DJ一致。活体成像实验后处死小鼠,提取各组织DNA,调整上样DNA模板至相同浓度,用QPCR方法检钡Fluc DNA的水平,结果显示,在肝脏组织中,四种载体介导的Fiuc的DNA拷贝数在107～108 GC/100ng总DNA,而在肾脏、心脏、胰脏、肺、脑及肌肉组织,四种病毒载体介导的Fluc的DNA拷贝数则低至105～107 GC/100ng总DNA,进一步说明了叁个突变体仍保持肝靶向性,而且S503A突变体介导的Fluc对小鼠肝脏、心脏及肌肉的转导效率均显着高于AAV-DJ约3倍(P<0.05)。然而,在体外实验中,我们将表达GFP基因的AAV-DJ及其叁个突变载体以MOI=1000感染叁种不同类型的细胞：293T、Hela和HepG2细胞,感染后48h检测四种病毒载体介导GFP对叁种不同细胞系的转导效率,结果显示,K137R和S503A突变体介导的GFP对叁种细胞的转导效率稍高于AAV-DJ约20%-30%(p<0.05),而T251A突变体则无明显差异。因此我们得出,虽然体外感染效率只有稍微的提高,但AAV-DJ衣壳蛋白503位点上的丝氨酸残基进行突变能够有效提高其对小鼠体内肝脏、心脏及肌肉的转导效率,具有重要应用意义。综合本课题的叁部分研究内容,我们主要取得了以下成果：1、本研究所研发的AAV8-amiRNA具有自主知识产权,实验证明该候选药物能在乙肝模型动物体内持续稳定地表达,从而达到长期稳定抑制HBV复制的作用。利用AAV-8作为载体携带3个串联表达的amiRNA在乙肝转基因小鼠体内表达,能有效抑制小鼠血清中HBsAg, HBeAg水平并显着降低肝脏HBsAg、HBcAg的表达水平以及HBVRNA, DNA的拷贝数；一次尾静脉注射能稳定发挥抑制作用至少15个月；对不同品系乙肝转基因小鼠均具有广泛而显着的抑制作用,该候选药物为乙肝的基因治疗开辟了新路径；2、通过overlapping-PCR方法对AAV-8衣壳蛋白进行单点突变,构建了叁个AAV8的酪氨酸突变体(Y447F、Y703F、Y708F),体内结果显示,Y703F突变能显着提高其对小鼠肝脏、肾脏及肌肉的转导效率且具有与wtAAV-8一致的肝靶向性；3、同样方法构建了叁个AAV-DJ的突变体(K137R、 T251A, S503A),虽然体外结果显示四个病毒载体对293T、Hela及HepG2细胞的感
臧梦雅[9]2016年在《IL-23/IL-23R在慢性乙型肝炎相关肝癌发展进程中的作用探讨》文中认为原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,严重影响我国人民的身体健康。临床与流行病学资料表明：我国90%以上的肝癌发生于乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染相关的慢性炎症基础之上。慢性HBV感染相关性肝癌组织中存在大量异质性的免疫细胞的浸润,这些浸润的免疫细胞的功能、表型特征以及细胞因子的产生和种类都发生了明显的变化,进而影响着肝癌的发生与发展。白细胞介素23(IL-23)是近年来发现的参与慢性炎症相关性肿瘤的重要炎性细胞因子之一,属IL-12细胞因子家族成员,由IL-23p19和IL-12p40两个亚基组成,在自身免疫性疾病、慢性炎症及肿瘤中均发挥重要作用。IL-23主要由单核巨噬细胞和树突状细胞产生,通过与由IL-12Rβ1和IL-23R两个亚基所组成的受体发挥作用,IL-23主要通过IL-23R发挥作用,激活STAT3信号通路,但是,持续性高浓度的IL-23还可通过IL-12Rβ1发挥作用,激活STAT4信号通路。其中IL-23R的表达在Th17的分化及其所介导的慢性炎症损伤和与多种肿瘤中发挥重要作用。但IL-23在慢性HBV感染相关HCC发展进程中的作用尚不明确。不同分化类型的CD4+Th细胞在抗病毒感染和抗肿瘤免疫中均发挥着关键性调控作用,我们首先利用1992年在江苏启东建立的慢性HBV感染者HCC筛查队列,参加人员每年进行随访,并保存随访过程中的血清样本。通过病例-对照研究,采用multiple ELISA技术,我们分析和比较了慢性HBV感染人群最终进展为肝癌者(50例)和通过随访10-15年仍然保持慢性HBV感染者(150例),在不同疾病进展阶段中,外周血血清中不同类型Th细胞相关的细胞因子的表达水平。结果发现最终进展为HCC患者的慢性HBV感染者外周血中Th17细胞相关细胞因子的浓度显着增加。通过对HBV病毒载量和细胞因子相关性分析以及比较有无肝细胞损伤患者血清细胞因子的水平,发现慢性HBV感染人群肝细的损伤状态与外周血IL-23的高水平相关。随后,我们通过分离健康人以及慢性乙肝患者的外周血单核细胞,培养并分化为巨噬细胞,利用永生化的人肝细胞系(L02)和转染了2xHBV的L02细胞(2xHBV-LO2)的细胞裂解液刺激巨噬细胞,结果显示巨噬细胞在受到上述两种细胞裂解液刺激后,IL-23产生均明显增加,但巨噬细胞IL-23的产生在受到2xHBV-LO2细胞裂解液刺激后升高更为明显,特别是在慢性乙肝患者中。进而,我们分析了仅含有HBV小S蛋白的表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)和HBV核心抗原(hepatitis B core antigen, HBcAg)刺激巨噬细胞产生IL-23的能力,发现HBcAg能更有效地刺激慢性乙肝患者外周血巨噬细胞IL-23的产生。IL-23功能的发挥主要通过与不同细胞表面所表达的IL-23R结合而实现。通过流式染色分析发现,在肝癌组织中IL-23R主要表达于巨噬细胞,并且IL-23RmRNA的表达水平与VEGF mRNA水平呈显着正相关。由于HCC组织的高度血管化,我们探讨了IL-23在促进HCC进展中对血管形成的影响。利用人巨噬细胞系THP-1细胞,以及通过外周血单核细胞培养分化的巨噬细胞进行研究发现,IL-23/IL-23R通过正反馈作用能促进巨噬细胞产生和分泌VEGF,通过管道形成实验进一步证明,IL-23处理的巨噬细胞能够促进血管形成。最后,我们利用HBV转基因小鼠,在出生2周龄时腹腔注射二乙基亚硝胺诱导肝细胞的癌变,并分别在出生后的第6周龄、第1O周龄和第16周龄时腹腔注射抗IL-23R的中和性抗体,连续注射4周,结果发现从第6周龄和第10周龄开始阻断IL-23R,与同型抗体对照小鼠相比,小鼠肝脏肿瘤的数量(P=-0.0007)和肿瘤直径(P=0.0079)显着降低。同时,肝脏组织中VEGF mRNA水平和蛋白水平在阻断IL-23R后也明显下降。除此之外,肝脏浸润的免疫细胞阻断IL-23R后CD8+IFNγ+T细胞百分比明显增加,体外杀伤实验显示T细胞的杀伤能力明显增强。在本研究中,我们发现HBV抗原诱导巨噬细胞所产生的IL-23在促进慢性HBV感染相关HCC的发生发展中发挥着重要的作用。首先我们发现慢性HBV感染者进展为HCC的过程中IL-23明显增高,其次证明HBV核心抗原能够诱导巨噬细胞产生和分泌IL-23。随后,对IL-23促进HCC的机制进行进一步研究后发现IL-23通过自分泌的方式促进巨噬细胞产生和分泌VEGF,从而促进HCC的发生和发展。这为今后HCC临床诊疗提供了潜在的干预新靶点。
窦橙云[10]2017年在《ESR1基因甲基化在慢加急性乙型肝炎肝衰竭和HBV相关肝癌中的研究》文中研究指明第一部分:ESR1基因启动子甲基化在慢加急性乙型肝炎肝衰竭病情评估中的研究研究背景慢加急性乙型肝炎肝衰竭(Acute-on-chronic hepatitis B liver failure,ACHBLF)是指在慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)的基础上,短期内出现急性或亚急性的肝功能损害,主要表现为极度乏力、高胆红素血症、凝血功能障碍、失代偿性腹水和肝性脑病,严重危及患者的生命健康。ACHBLF进行性发展,出现多器官功能衰竭,短期内死亡率极高。早期诊断ACHBLF,在适宜的时间点采取恰当的干预手段有可能降低ACHBLF的发病率和死亡率。虽然终末期肝病模型(Model for end-stage liver disease.MELD)已成为现阶段得到广泛应用的精确评估肝病严重程度的评分系统,但此标准建立在肝硬化基础之上,不是特异性的针对HBV感染所致的肝衰竭,而且用于ACHBLF患者的预后判断时准确性下降,因此急需寻找一种可以在ACHBLF发展的早早期阶段就可以精确判断其预后的标记物。临床实践发现,ACHBLF的发病率在男性患者远远高于女性,这种性别差异可能是由于雌激素表达减少或是对雌激素的反应性降低所致。在肝脏,雌激素只有与雌激素受体(Estrogen Receptor,SR),尤其是ESR1结合后才能发挥延缓肝细胞凋亡、改善肝纤维化、抑制肿瘤生长的生物学功能。HBV可以促进宿主ESR1基因的高甲基化,ESR1达降低,诱导肝病的发生,但ESR1基因启动子的异常甲基化在ACHBLF患者中所起的作用还未有研究。研究目的通过检测对比健康人(Healthy controls,HC)、CHB、肝衰竭前期及ACHBLF早期、中期、晚期叁期患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中ESR1基因启动子的甲基化状态,分析ESR1启动子的甲基化从HC、CHB、肝衰竭前期至肝衰竭时的动态变化并与ACHBLF患者的病情相结合,初步探讨PBMC-ESR1启动子的甲基化作为无创性的指标早期预测ACHBLF患者短期28天生存状态的可行性。研究方法研究对象为2009年9月到2016年1月间在山东大学齐鲁医院肝病科接受治疗的131例ACHBLF患者,随机选取同一时间段的73例CHB患者和40例HC作为对照组。131例ACHBLF患者中,113人在入院时已被诊断为ACHBLF(包括早期患者67例,中期29例,晚期17例),另外18人在住院期间从肝衰竭前期逐步进展至ACHBLF,作为动态观察组。所有的ACHBLF患者追踪随访28天。甲基化特异性PCR方法检测HC组、CHB、肝衰竭前期和ACHBLF患者PBMC-ES1基因启动子甲基化率,实时定量PCR技术检测ESR1 mRNA的表达。卡方检验分析不同组ESR1甲基化率的比较,Cox比例风险模型分析影响ACHBLF患者生存的危险因素,Kaplan-Meier方法计算生存曲线,ROC曲线判断PBMC-ESR1启动子的甲基化早期判断ACHBLF患者预后的合理性。研究结果1.ACHBLF组和CHB组在进行HBeAg、HBeAb、HBV-DNA比较时无明显的统计学差异;ACHBLF组、CHB组、HC组叁组间比较时,年龄、性别、肌酐均没有统计学差异,而显示肝衰竭严重程度的总胆红素、白蛋白、凝血酶原活动度、国际标准化比率存在统计学差异(P<0.001);ACHBLF组中腹水、肝性脑病、自发性细菌性腹膜炎的发生率分别为66.37%、30.97%和27.43%,死亡率为67.26%。ACHBLF患者生存组的总胆红素(P=0.003)、肝性脑病的发生率(P=0.001)、MELD值(P<0.001)明显低于非生存组,其他临床指标均没有显着的统计学差异。2.ACHBLF患者PBMC-ESR1基因启动子的甲基化率(66.37%)明显高于CHB组(21.92%,P<0.001)和HC组(11.54%,P<0.001),但CHB组和HC组间无统计学差异;ACHBLF非生存组PBMC-ESR1基因启动子的甲基化率显着高于生存组(77.63%vs 29.73%,P<0.001);ACHBLF患者甲基化组ESR1 mRNA的表达量明显低于非甲基化组(P<0.001)。3.ACHBLF患者PBMC-ESR1启动子甲基化组的白蛋白水平显着低于非甲基化组(P= 0.027),MELD值则高于非甲基化组(P= 0.044),其他临床指标均没有统计学差异。4.从肝衰竭前期进展至ACHBLF的动态观察中,ESR1启动子的甲基化率随病情的严重程度变化,病情越危急,甲基化率越高。5.Cox比例风险模型提示MELD值、肝性脑病、ESR1启动子的甲基化有可能是预测ACHBLF患者28天死亡率的独立危险因素。6.PBMC-ESR 基因启动子的甲基化预测ACHBLF早期患者28天生存状态的诊断价值明显高于MELD评分>24.6(P = 0.015)。结论PBMC-ESR1基因启动子的甲基化与ACHBLF患者的病情严重程度相关,可能是预测早期ACHBLF患者短期28天生存状态的无创性生物学指标。第二部分:血清ESR1、DNMT3b、CDH1基因的甲基化早期诊断HBV相关肝癌的研究研究背景:肝细胞癌(简称肝癌)在我国恶性肿瘤相关性死亡中排名第二位,严重影响国民健康。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是肝癌发生的重要危险因素之一,HBV感染相关的肝癌又称为HBV相关肝癌(HBV-related hepatocellular carcinoma,HBV-related HCC)。尽管肝癌的综合治疗发展迅速,但5年生存率仅为30%-40%,而HBV-related HCC预后更差,不到12%。理想的治疗效果取决于疾病的早期诊断和合理治疗。血清甲胎蛋白和影像学检查是目前诊断肝癌的主要检测手段,但是甲胎蛋白诊断肝癌时假阳性和假阴性较高,影像学检查在肿瘤体积较小时存在漏诊。因此寻求一种新的肿瘤标志物能够从慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)和 HBV相关肝硬化(HBV-related Liver cirrhosis,HBV-related LC)患者中早期筛查HBV-related HCC是临床亟待解决的问题。基因启动子的异常甲基化被广泛用作肿瘤发生、复发、转移和对化疗药物敏感性的生物学标志物。HBV基因组编码的HBx蛋白通过上调DNA甲基转移酶,引起基因启动子的高甲基化,表达下调,扰乱细胞正常的生长、增殖、分化、凋亡程序,最终导致HBV-related HCC的发生。HBV-related HCC患者中男性占绝大多数,说明雌激素信号通路可能具有抑制肝癌发生的作用。而雌激素只有与雌激素受体(Estrogen Receptor，ESR)(肝脏中以ESR1为主)结合后才能发挥抗氧化、抗肝纤维化、抗癌等生物学效应,ESR1基因组学的变异可能促进HBV-related HCC的发生。DNA甲基化转移酶3b(DNA methyltransferases 3b.DNT3b)是催化基因新生甲基化的关键酶。CDH1基因编码的钙粘附蛋白E,介导基底膜同种细胞间的连接,钙粘附蛋白 E表达减少,细胞间粘附力降低,肿瘤细胞的侵袭、转移能力增强。既往研究发现乳腺癌、结肠癌和胃癌中存在不同程度的ESR1、DNET3b和CDH1基因启动子的异常甲基化,但是目前并没有ESR1、DNMT3b和CDH1基因启动子甲基化的联合检测作为HBV-related HCC早期诊断的血清学标志物的文献报道。研究目的通过检测对比HBV-related HCC、HBV-related LC、CHB和健康人(Normal control,NC)血清中ESR1、DNMT3b和CDH1基因启动子的甲基化率,分析HBV-related HCC进展过程中不同基因的异常甲基化与病例资料的相关性,探讨血清基因启动子甲基化的联合检测用于早期诊断HBV-relatedHCC的可行性。研究方法研究选取2011年1月至2013年5月在山东大学齐鲁医院治疗的183例肝癌患者作为实验组,包括153例HBV-related HCC患者和30例非HBV相关肝癌患者(Non-HBV-related HCC),随机选取同一时间段的47例HBV相关肝硬化和126例CHB、50例NC作为对照组。甲基化特异性PCR方法分析不同人群血清ESSR1、DNMT3b和CDH1基因启动子的甲基化率。卡方检验或Fisher精确检验用于不同组不同基因启动子甲基化率的比较,ROC曲线分析二个基因甲基化的联合检测早期诊断HBV相关肝癌的合理性。研究结果1.HBV-related HCC 患者血清中ESR1(30.07%)、DNMT3b(41.18%)和CDH1(27.45%)的甲基化率显着高于HBV-related LC患者(P<0.001,P<0.001,P =0.007)、CHB患者(P<0.001,,P<0.001,,P<0.001)和NC组(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。但是,叁个基因启动子的甲基化率在NC和CHB、NC和HBV-related LC、CHB和HBV-related LC之间差异均没有统计学意义。2.Non-HBV-related HCC患者CDH1基因启动子的甲基化率(46.67%)显着高于HBV相关肝癌患者(27.45%,P = 0.037),而DNMT3b(P=0.905)和ESR1(P = 0.709)的甲基化率在两者之间均没有显着性差异。3.HBV-related HCC患者合并肝硬化时ESR1基因启动子的甲基化率显着高于未合并肝硬化者(= 0.005),手手术切除组ESR1的甲基化率明显高于采取其他治疗措施组(P= 0.027);DNMT3b的甲基化率在肿瘤直径大于10厘米的患者中高于3-10厘米患者(P=0.028),单个结节的甲基化率显着高于多个结节者(P =0.045);男性CDH1的甲基化率明显高于女性(P = 0.026)。而叁个基因启动子的甲基化均与甲胎蛋白白、e抗原、肿瘤细胞的分化程度、大血管侵犯、肝内微小转移灶无关。4.Non-HBV-related HCC患者血清中ESR1甲基化率在AFP ≥ 400 ng/mL组显着高于AFP<400 ng/mL组(P=0.048);DNM 3 的甲基化率在肿瘤直径小于3厘米的患者中高于3-10厘米患者(P= 0.010);CDH1启动子的甲基化率与性别、年龄、肿瘤直径、结节数目、e抗原、甲胎蛋白、合并肝硬化、肿瘤细胞的分化程度、大血管侵犯、肝内微小转移灶、治疗方式等均没有相关性。5.两个基因同时发生甲基化的组合中,血清CDH1和ESR1同时发生甲基化的概率在HBV-related HCC患者中为21.62%,而在Non-HBV-related HCC患者中这一组合发生的概率为0。6.从CHB患者中辨别HBV-related HCC时,甲基化联合检测的敏感性是84.48%,特异性66.26%,阳性预测值2.50,阴性预测值0.23,曲线下的面积(The area under ROC curves,AUC)显着高于甲胎蛋白(P=0.003);从HBV-related LC患者中诊断HBV-related HCC时,甲基化联合检测的AUC明显高于血清甲胎蛋白(P= 0.045)。结论1.HBV-related HCC患者血清中较常出现ESR1、DNMT3bCDH1基因启动子的异常高甲基化,血清甲基化的联合检测可能是早期诊断HBV-related HCC的标记物。2.HBV-related HCC和Non-HBV-related HCC相同基因启动子的甲基化率不同,不同基因联合检测的甲基化率也不同,提示HBV影响肝癌的表观遗传学修饰。
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