兔耳增生性瘢痕动物模型的建立及应用

兔耳增生性瘢痕动物模型的建立及应用

张燕, 海洪宇, 王莹[1]2018年在《建立增生性瘢痕动物模型的研究进展》文中研究说明皮肤组织受到创伤后,其修复形式包括再生及瘢痕两种,其中瘢痕则包括正常瘢痕和病理性瘢痕。不高于皮肤表面的瘢痕为正常瘢痕,病理性的瘢痕则可能因为组织在修复过程中细胞外基质的过度增殖及沉积而产生的高于正常皮肤的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,增生性瘢痕从发生部位和病变程度上来讲,不同程度的影响外观及正常机能。在临床上导致增生性瘢痕形成的机理尚未完全明确,通过各种手术治疗方法及其他非手术的治疗方法进行瘢

陈煜华[2]2013年在《慢病毒介导的VEGF干涉联合METH-1抑制血管生成预防兔耳增生性瘢痕的研究》文中指出增生性瘢痕是皮肤损伤后创面愈合的异常结果,在国人中的发病率很高[1],增生性瘢痕的预防和治疗也是整形外科的重点研究领域之一,其常发生于各种烧、创伤和手术之后,由于其形成机制并不十分清楚,目前依然缺乏有效的防治方法[2]。近年来的研究表明血管化与增生性瘢痕的形成密切相关[3],血管化过程中有多种细胞因子的共同参与,其中血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的作用最强的促血管生成因子之一[4],VEGF的高表达与增生性瘢痕的形成密切相关。本实验室在此理论的基础上,已经设计、合成、筛选出了针对VEGF抑制效果最佳的小干扰RNA片段,并构建了该干涉片段的慢病毒载体——慢病毒介导的靶向沉默血管内皮生长因子(Lentivirus-mediated silence interferenceVEGF,LV-SiVEGF)[5]。实验一拟在本实验室前期研究的基础上,将LV-SiVEGF基因作用于兔耳增生性瘢痕动物模型,通过对兔耳组织中增生性瘢痕指数、成纤维细胞增殖、胶原合成、血管内皮细胞的检测,超微结构变化等,探讨通过血管靶向基因治疗抑制增生性瘢痕的可行性。同时,我们前期的研究还发现重组血管生成抑制剂(Proteins containingMetalloprotease and Thrombospondin domain-1,METH-1)对增生性瘢痕也有明显的抑制作用[6],并构建出了METH-1的慢病毒载体——慢病毒介导的重组血管生成抑制剂METH-1(Lentivirus-mediated METH-1,LV-METH-1)[7]。因此,实验二拟在兔耳增生性瘢痕动物模型上,观察稳定干扰VEGF的表达和联合应用重组血管生成抑制剂METH-1对兔耳增生性瘢痕形成的影响,通过对增生性瘢痕指数、成纤维细胞增殖、胶原合成、内皮细胞的检测等,深入研究血管靶向基因治疗抑制增生性瘢痕形成的可行性,进一步探寻对增生性瘢痕行之有效的防治方法。全文包括两个部分:第一部分:靶向沉默VEGF对兔耳增生性瘢痕的影响目的探讨慢病毒介导的靶向沉默血管内皮生长因子LV-SiVEGF对兔耳增生性瘢痕形成的影响及其可能的作用机制,研究血管靶向基因治疗对兔耳增生性瘢痕的预防作用。方法以10只日本大耳白兔建立兔耳增生性瘢痕模型,并随机选择兔的左、右耳作为实验组和对照组。待创面愈合后,实验组注射携带有干扰序列LV-SiVEGF的重组慢病毒,对应的作为对照组注射慢病毒介导的空载病毒对照(Lentivirus-mediated No-load virus control,LV-NC)。创面愈合后第30天取材,观察对比各组瘢痕外观形态的变化,并对瘢痕组织进行HE染色、Masson染色、CD34染色、VEGF染色、透射电镜观察,研究分析靶向沉默兔耳瘢痕组织中VEGF的表达对组织内增生性瘢痕指数、组织血管生成、成纤维细胞增殖、胶原合成、内皮细胞增殖的影响。结果与对照组相比,实验组血管靶向基因治疗30天后,兔耳增生性瘢痕中微血管生成明显减少、胶原合成及成纤维细胞增殖均受到明显抑制,超微结构观察结果显示血管内皮细胞活性下降。结论瘢痕形成早期应用LV-SiVEGF基因治疗可明显抑制兔耳增生性瘢痕的形成。第二部分:靶向沉默VEGF与重组血管生成抑制剂METH-1单独和联合应用对兔耳增生性瘢痕的影响目的探讨慢病毒介导的靶向沉默血管内皮生长因子LV-SiVEGF与慢病毒介导的重组血管生成抑制剂LV-METH-1单独和联合应用对兔耳增生性瘢痕形成的影响及其可能的作用机制,研究血管靶向基因治疗对兔耳增生性瘢痕的预防作用。方法选择20只日本大耳白兔复制出兔耳增生性瘢痕模型,并随机将创面分为四个实验组:对照组、单独LV-SiVEGF组、单独LV-METH-1组、联合应用组。待创面愈合后,对照组注射无关的LV-NC空载慢病毒;单独LV-SiVEGF组注射携带有干扰序列LV-SiVEGF的重组慢病毒;单独LV-METH-1组注射携带有目的基因LV-METH-1的重组慢病毒;联合应用组注射携带有干扰序列LV-SiVEGF和目的基因LV-METH-1的重组慢病毒。创面愈合后第30天取材,观察对比各组瘢痕外观形态的变化,并对瘢痕组织进行HE染色、Masson染色、CD34染色、VEGF染色、透射电镜观察,研究分析靶向沉默兔耳瘢痕组织中VEGF的表达对组织内增生性瘢痕指数、组织血管生成、成纤维细胞增殖、胶原合成、内皮细胞增殖的影响。结果与对照组相比,单独LV-SiVEGF组、单独LV-METH-1组、联合应用组血管靶向基因治疗30天后,兔耳增生性瘢痕中微血管生成均有不同程度的减少(血管数目计数:对照组>单独LV-METH-1组>单独LV-SiVEGF组>联合应用组)、胶原合成及成纤维细胞增殖均受到不同程度的抑制(成纤维细胞计数:对照组>单独LV-METH-1组>单独LV-SiVEGF组>联合应用组)。结论瘢痕形成早期应用LV-SiVEGF或/和LV-METH-1进行基因治疗可明显抑制兔耳增生性瘢痕的形成,其中,应用抑制效果由好到差依次是联合应用组、单独LV-SiVEGF组、单独LV-METH-1组。本课题主要是观察和验证两种基因LV-SiVEGF和LV-METH-1在动物体内对增生性瘢痕的影响,动物模型采用本实验室应用比较成熟的兔耳增生性瘢痕动物模型,将LV-SiVEGF和LV-METH-1基因作用于兔耳局部,通过对增生性瘢痕指数、组织血管生成、成纤维细胞增殖、胶原合成、内皮细胞的检测等,探讨通过血管靶向基因治疗抑制增生性瘢痕这条路径的可行性。

周勤生[3]2004年在《兔耳增生性瘢痕动物模型的建立及应用》文中指出目的 建立兔耳增生性瘢痕动物模型并观察外科感染常见致病细菌对兔耳腹侧创面愈合后增生组织块形成的影响。方法 选用成年新西兰大耳白兔6只于其双耳腹侧制作创面,待其愈合后形成增生性瘢痕组织块做为兔耳增生性瘢痕动物模型。同法于20只新西兰大耳白兔双耳腹侧制作创面,将20只新西兰大耳白兔随机分成对照组、金黄色葡萄球菌污染组、大肠杆菌污染组、绿脓杆菌污染组,观察各组创面愈合情况与增生性组织块发生等情况、测定各组不同时间点成纤维细胞数、检测不同时间点转化生长因子(TGF-β_1)和胶原Ⅰ(collagen-Ⅰ)表达。结果 人为造成兔耳腹侧创面后可出现类似人增生性瘢痕的增生组织块,发生率为66.7%,其组织学表现为增生性组织块形成早期有大量成纤维细胞增殖、高峰期真皮明显增厚、纤维细胞和胶原纤维增多、胶原排列呈漩涡状或结节状结构近似人的增生性瘢痕组织,可作为研究人增生性瘢痕的动物模型。在相同兔耳模型制成的创面上用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌予以污染并设对照组,四组平均愈合时间分别为(13.367±1.025)d、(19.283±1.091)d、(13.967±0.948)d、(16.233±0.981)d有统计学差异(p<0.01);观察四组增生性组织块出现率(分别为67.7%、90%、75%及80%)金黄色葡萄球菌污染组出现率与对照组比较有差异(p<0.05):各组创面愈合时间与增生性组织块出现率呈正相关(r=0.169,p<0.01);四组增生性组织块成纤维细胞数、TGF-β_1、胶原Ⅰ(collagen-Ⅰ)表达早期最显着,随着时间推移逐渐减少直至消失;检测增生性组织块中TGF-β_1显示其在兔耳增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原Ⅰ合成具有正性调控作新洛医斗斗大学医学闷皿士学位论文用。结论增生性瘫痕兔耳动物模型制作简单、模型稳定、重复性强,可作为人增生性瘫痕形成机制与防治研究的动物模型;外科感染常见致病细菌可延长兔耳创面愈合时间、增加兔耳创面愈合后增生性组织块的发生率,因而是促进增生性瘫痕形成的重要因素;兔耳创面愈合后增生性瘫痕组织块中成纤维细胞数高、TGF一p.与胶原I含量高,与人增生性瘫痕中检测结果基本相同,这些观测指标可作为研究人增生性瘫痕形成机制的重要参照依据,有助于从细胞与分子生物学水平为临床防治增生性瘫痕提供有效的实验手段。关键词增生性瘫痕兔耳动物模型外科感染常见致病细菌

刘巍敏[4]2013年在《PI-3K/Akt信号转导通路在兔耳增生性瘢痕模型中的作用机制研究》文中提出[目的]:本研究建立兔耳瘢痕模型,以磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase, PI-3K)特异性抑制剂2-(4-吗啉基)-8-苯基-4氢-1-苯并毗喃-4酮(LY294002)进行干预,观察兔耳瘢痕形态学变化、瘢痕组织胶原含量及比例,AKT磷酸化表达,以及成纤维细胞凋亡,了解PI-3K/Akt信号转导通路在增生性瘢痕中的作用,探讨增生性瘢痕形成的分子机制,为临床探索瘢痕治疗的靶点提供实验依据。[方法]:全麻下建立兔耳瘢痕模型以及用LY294002进行干预,用随机数字法分为4组:A组实验组:浓度为100μmol/L的LY294002;B组空白对照组:未处理的瘢痕组;C组对照组:DMSO组;D阴性对照组:正常兔耳皮肤,A, B, C, D各5只兔子,共120个创面。术后连续外敷LY294002溶液或DMSO溶液21天,外敷剂量为每个创面面积0.5ml。在术后30天,60天,90天采集标本。采用光镜下观察苏木素-伊红染色、天狼猩红染色的组织结构变化情况;免疫组化法观察瘢痕组织和正常皮肤中磷脂酰肌醇-3激酶(PI-3K/Akt)下游底物Akt(Ser-473/Thr-308)两个位点磷酸化的表达情况,免疫荧光双染色法观察P-Akt (Ser473)及Thr-308蛋白活化同步活化状态,应用Western blot法对磷酸化Akt进行定性及半定量研究,及用TUNEL法观察细胞凋亡。[结果]:1、成功建立了兔耳增生性瘢痕模型,并鉴定其胶原的构成:正常组织Ⅰ型胶原约占(25.4±7.13)%,Ⅲ型胶原约占(74.58±7.14)%;瘢痕组织中,Ⅰ型胶原含量分别为(62.72±8.72)%;Ⅲ型胶原分别约为(35.26±6.80)%,具有差异显着(P<0.05)。2、经过对兔耳远、中、近端生成瘢痕进行评估,结果显示中、近端生成的瘢痕,发生率及增生厚度都更优于兔耳远端。3、LY294002组的瘢痕生长受到抑制,增生厚度与DMSO组及瘢痕组比较具有显着性差异(P<0.05):4、免疫细胞化学染色结果表明,PI-3K/Akt下游底物P-Akt (Thr308)和P-Akt(Ser473)蛋白定主要位于细胞浆内,阳性表达率分析结果显示,与正常兔耳皮肤组织相比兔耳瘢痕中存在P-Akt (Thr308)(50%)和P-Akt (Ser473)(75%)的阳性高表达率,与DMSO组阳性表达率无差异(P>0.05)。而使用特异性抑制剂组与瘢痕组相比较组织中P-Akt (Thr308)和P-Akt (Ser473)的阳性表达率明显降低,统计学处理,差别具有显着性差异(P<0.01)。5、各组兔耳瘢痕组织中Akt, P-Akt (Thr308)及P-Akt (Ser473)蛋白的Western blot结果。GAPDH在各组瘢痕组织中表达基本一致,总AKT在B、C组中表达基本一致,A、D组表达略低于其余两组(P<0.01)。而P-Akt (S473)的表达A、D组表达弱于B、C组,P-Akt (Thr308)的表达水平较低,其表达趋势与总Akt及P-Akt (Ser473)呈正相关。6、免疫荧光双染色法可见P-Akt (Thr308)、P-Akt (Ser473)主要在胞浆内表达,并同时存在于瘢痕组织中,而LY294002组较瘢痕组呈现低表达。7、光镜下观察TUNEL凋亡染色结果,B组(DMSO组)与C组(正常皮肤组)中可见部分细胞存在散在凋亡(2.38±0.41)%。与B、C组相比A组(LY294002组)凋亡率上升(3.66±0.42)%,视野下可见大量细胞凋亡,差异具有显着性差异(P<0.01)。[结论1:1、在增生性瘢痕中,AKT、P-Akt (Thr308)及P-Akt (Ser473)蛋白呈高表达,其磷酸化位点P-Akt (Thr308)及P-Akt (Ser473)共活化,加入特异性抑制剂LY294002,其表达水平下调。2、在增生性瘢痕中,PI-3K/AKT信号转导通路活化后抑制成纤维细胞的凋亡,加入特异性抑制剂抑制其通路后,凋亡增加。3、P13K-Akt信号转导通路的激活抑制了成纤维细胞的凋亡;使该信号通路的激活水平上调,该信号转导通路可能是瘢痕形成的的机制之一。4、LY294002可能通过抑制iJPI-3K/Akt信号转导通路的表达而抑制细胞增殖,产生抑制瘢痕增生的作用。

牛占国[5]2007年在《外用复方中药瘢痕膏抑制兔耳增生性瘢痕的实验研究》文中指出目的:探讨一种外用复方中药瘢痕膏对增生性瘢痕防治效果和机制,为其临床使用提供理论和实践依据。方法:选用新西兰大耳白兔16只,进行兔耳增生性瘢痕动物模型的复制。创面完全上皮化后将实验动物随机分为4组:分别设为实验组(瘢痕膏组)、康瑞保组对照组、积雪甙对照组和空白对照组,每组8只兔耳,96个创面。实验组、康瑞保组和积雪甙组于创面完全上皮化时即20天后开始用药,将药膏涂在瘢痕部位,3次/天,分别于用药后第30天和第100天取材,然后进行大体观察、病理观察、瘢痕厚度及增生指数的测量、微循环血流灌注、瘢痕成纤维细胞数量、胶原、a—平滑肌肌动蛋白及转化生长因子-β_1的检测等。两组之间和多组之间的差异比较分别采用成组设计的t检验和方差分析,检验标准取a=0.05。结果:兔16只(32耳)均进入结果分析。①用药后30d观察,空白对照组增生较厚,颜色较苍白,质地硬;实验组亦有增生,但增生较轻,颜色红润,弹性较好;康瑞保组瘢痕增生亦较轻;积雪甙组表现介于实验组与空白对照组之间;②实验组微循环灌注的PU值高于其他各组(P<0.05);③用药后100天实验组瘢痕明显变薄,质地柔软,接近正常皮肤,空白对照组仍较厚,较硬;④用药后30天实验组成纤维细胞数量明显低于空白对照组(P<0.05),而用药后100天二者的成纤维细胞计数差异无统计学意义(P>0.05);实验组用药后30天和用药后100天α—平滑肌肌动蛋白;⑤实验组用药后30天和100天胶原的定量、半定量测定均明显低于空白对照组(P<0.05);⑥用药后30天实验组转化生长因子-β_1的表达明显低于对照组(P<0.05),而用药后100天实验组转化生长因子-β_1的表达与对照组的差异则无统计学意义(P>0.05)。结论:此外用中药对兔耳增生性瘢痕具有明显的近远期疗效,可以减少成纤维细胞数量,使增生性瘢痕纤维化程度有所减轻,预防瘢痕挛缩。

江洁美[6]2014年在《复方芪参提取物抑制兔耳瘢痕增生的实验研究》文中进行了进一步梳理目的1.体外研究表明复方芪参提取物(Compound Astragalus and Salvia miltiorrhiza extract, CASE)可显着抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、胶原合成及侵袭作用,在此研究的基础上,本文通过建立兔耳增生性瘢痕模型,研究CASE在体内是否具有抑制瘢痕增生的作用;2.为了阐明CASE抗瘢痕作用的分子机制,研究CASE对兔耳增生性瘢痕中TGF-β/Smad信号转导途径的影响。方法建立兔耳瘢痕模型,自行结痂愈合;术后21天,瘢痕开始形成,随机分为正常对照组、模型组、CASE低浓度组(0.94%, w/w)、CASE中浓度组(1.88%,w/w)、CASE高浓度组(3.76%,w/w)及阳性药物组(积雪苷),每日给予兔耳瘢痕局部涂抹药物,使用游标卡尺测量每组兔耳瘢痕的厚度,每周一次,了解瘢痕生长情况,给药28天后,取兔耳瘢痕组织,测量组织中羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)的含量,了解CASE对瘢痕组织中胶原合成的影响;采用HE染色和Masson染色了解CASE对瘢痕组织的病理改变;采用Western-blot方法和免疫组化法检测瘢痕组织中转化生长因子β1(Transforming growth factor-beta1, TGF-β1), Smad2/3,Smad4, Smad7蛋白表达情况。结果1. CASE显着抑制兔耳瘢痕的增生随着时间的延长,模型组瘢痕增生显着,而CASE组瘢痕增生较模型组明显减缓,结果表明CASE具有显着抑制瘢痕增生的作用。2. CASE明显减少瘢痕组织中Hyp的含量CASE组瘢痕组织中Hyp含量较模型组中明显减少,且具有浓度依赖性。另外,CASE高浓度组中Hyp含量接近正常组,表明CASE可显着减少瘢痕组织中胶原的含量,并使其趋于正常。3. CASE抑制兔耳增生性瘢痕中成纤维细胞的生成和胶原的合成CASE明显减少瘢痕组织中成纤维细胞数量、改善胶原纤维的排列、减少瘢痕组织中胶原的含量,随着药物浓度的增高,作用越显着。4. CASE影响TGF-β/Smad信号转导通路的表达CASE能明显抑制瘢痕组织中TGF-β1,Smad4的蛋白表达,并显着上调Smad7的蛋白表达,提示CASE的抑制瘢痕增生作用可能机制为调控TGF-β/Smad转导通路。结论1. CASE能抑制兔耳瘢痕的增生,提示CASE在体内同样具有抗瘢痕的作用。2. CASE影响兔耳瘢痕组织中TGF-β1, Smad4, Smad7的蛋白表达,提示CASE可能通过调控TGF-β1/Smad信号传导通路而起到抗瘢痕的作用。

李虎, 李小静, 宁金龙, 高凤山, 董继英[7]2006年在《兔耳增生性瘢痕模型的建立及微血管构筑在病理性瘢痕形成和发展过程中的意义》文中提出目的:建立兔耳增生性瘢痕的动物模型,应用醋酸曲安奈德局部干预,观察病理性瘢痕新生毛细血管的改变,以探讨微血管构筑在病理性瘢痕形成、发展过程中的意义。方法:实验于2003-05/2004-05在安徽医科大学动物实验室进行。①选取新西兰大耳兔16只随机分为醋酸曲安奈德组和对照组两组(n=8),在兔耳腹侧面制作Φ6mm全层皮肤缺损创面,每耳4孔,共计128孔,建立增生性瘢痕模型。②模型建立后第20天醋酸曲安奈德组给予醋酸曲安奈德5mg/kg,在增生瘢痕组织周围分点注射,每孔0.25mL,间隔3d给药1次,共3次;对照组给予等量生理盐水。③给药前及停药后10,20,50d两组同时取材,每次每只兔耳切取一孔,进行瘢痕大体外观形态观察,苏木精-伊红染色镜下观察。停药后50d光镜下计数瘢痕内微血管数目。结果:15只兔进入结果分析。①大体观察:瘢痕上皮化时间为15~20d,上皮化后20d瘢痕增生高度约为皮肤厚度的3倍,瘢痕约在60d开始自行退变软化,瘢痕增生维持状态最多持续100d。经醋酸曲安奈德干预后的瘢痕色泽变淡,厚度降低,瘢痕持续时间缩短。②瘢痕面积:停药后10,20,50d醋酸曲安奈德组均小于对照组(P<0.01)。③停药后50d瘢痕内微血管数醋酸曲安奈德组少于对照组[(8.5±2.7),(20.2±4.7)个/视野,P<0.01]。结论:①兔耳增生性瘢痕模型的建立产生类似人类增生性瘢痕样病理改变。②兔耳增生性瘢痕形成过程中出现血管内皮细胞增殖和生成大量毛细血管,显示微血管的生成在增生性瘢痕的形成中可能起重要作用。③醋酸曲安奈德通过抑制新生血管的形成,起到一定防治瘢痕的作用。

张陶靓[8]2013年在《点阵CO_2激光联合积雪苷霜治疗兔耳增生性瘢痕的实验研究》文中研究表明本研究以中医药理论为指导,结合现代医学对增生性瘢痕的研究,通过动物实验探讨点阵C02激光联合积雪苷霜对增生性瘢痕的疗效及作用机理。理论部分系统回顾了增生性瘢痕的相关文献,对增生性瘢痕的病机和治法作了初步探讨,中医认为“气滞血瘀”为本,“余毒未散”为标,现代医学认为增生性瘢痕是创伤的异常结局,主要以成纤维细胞增殖,胶原纤维过度沉积为病理基础。据此我们选用具有“活血化瘀、清热解毒”之中成药积雪苷霜软膏,结合具有局限性光热化作用的点阵CO2激光,以启动皮肤再生修复程序,促使表皮和真皮结构重塑,借助兔耳增生性瘢痕实验研究对其疗效及作用机理的探讨。目的:通过点阵CO2激光联合积雪苷霜治疗兔耳增生性瘢痕的实验研究,以验证点阵C02激光联合积雪苷霜治疗增生性瘢痕的有效性,同时观察治疗后组织形态学以及成纤维细胞密度的变化,初步探讨其作用机制,为临床疗效提供理论依据。方法:新西兰大耳兔10只,体重2kg左右,雌雄不限,适应饲养24小时后建立兔耳瘢痕模型,术后4周,随机分组选择每只兔的左右侧耳进行对比观察,分为联合组/激光组,积雪苷组/对照组。术后8周,耳缘静脉空气栓塞法处死动物,无菌条件下切取含周围正常组织的瘢痕组织标本,10%甲醛溶液固定,作常规石蜡切片;观察治疗前后瘢痕外观形态的变化、组织形态变化,激光后痂皮脱落时间、上皮化时间。测量兔耳瘢痕增生厚度,瘢痕增生指数(HI)、成纤维细胞密度(NA)。结果:1.点阵CO2激光和积雪苷霜治疗增生性瘢痕(HS)均有效,均能使HI下降及NA减少。2.点阵C02激光联合积雪苷霜对HS疗效明显高于积雪苷单治疗组(P<0.05)。3.点阵CO2激光联合积雪苷霜与单一激光治疗组相比,HI无明显差异(P>0.05),但联合组NA明显低于激光组(P<0.05),并且积雪苷能显着缩短激光后表皮的修复期。

李昕珊[9]2014年在《人参提取物Rb1对兔耳增生性瘢痕的治疗效果》文中研究指明目的:通过建立兔耳增生性瘢痕模型,探讨人参提取物中Rbl成分对增生性瘢痕的治疗效果。方法:选取15只成年普通家兔,雌雄不拘,每只兔耳腹侧中段做2-3处直径约为1cm的圆形缺损(即每只兔子的耳腹侧有5处缺损)。任其自然愈合,待完全上皮化约26天瘢痕形成后,每个瘢痕做不同处理,分别设为空白对照组a,生理盐水注射组b,人参提取物Rbl药物注射组c、d、e,其药物浓度分别为0.2mg/ml,0.4mg/ml,1mg/ml。每处瘢痕注射剂量约为0.3m1,药物注射分每3天1次,共注射3次。于药物注射完毕后的第2周,第4周,第6周取材,每次取5只家兔。取下的瘢痕组织置于无菌、无酶的质量分数为4的多聚甲醛固定液中。固定一个月后将瘢痕组织常规切片,并做HE染色,VG染色,显微镜下测量并计算瘢痕指数(HI)、胶原含量,免疫组织化学检测Caspase-3表达和原位杂交方法测胶原Ⅰ型mRNA的表达。应用spss13.0进行数据处理,计量资料以“均数(x)±标准差(s)”的表现形式,行t检验和方差分析,P≤0.05为差异有显着意义。结果:应用人参皂苷的瘢痕与未使用药物的瘢痕比较,确有抑制增生的作用,随药物浓度的增加,HI、胶原面积降低。c,d组间无统计学意义(P>0.05), e组与c,d组间有统计学意义(P<0.05),即高浓度药物能够抑制瘢痕增生。免疫组织化学检测Caspase-3和原位杂交Collagen Ⅰ mRNA的表达,高浓度人参皂苷Rbl干预的Caspase-3增加,胶原Ⅰ型mRNA表达降低。结论:人参提取物Rbl能减少瘢痕组织中胶原的合成,促进成纤维细胞凋亡过程,从而有效的抑制增生性瘢痕的进一步发展。

邱竣[10]2011年在《细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究》文中提出研究背景增生性瘢痕(hypertrophic-scar, HS)是创伤后,尤其是深度烧伤后最常见的一种人类特有的病理性愈合现象。创伤后机体将启动一系列修复程序,瘢痕愈合是有多种细胞和细胞因子参与修复的过程,其中尤以成纤维细胞最为重要,成纤维细胞(fibroblast, FB)的异常增殖和含Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(extracellar matrix, ECM)成分的过度沉积、排列紊乱及大量的粘多糖堆积导致瘢痕的形成,所以成纤维细胞的生物学行为被认为是创伤愈合与瘢痕形成的决定性因素。19世纪60、70年代Mancini等先后定义这种失控的瘢痕组织:高出皮肤平面但局限在原损伤范围内的为增生性瘢痕。Muir等提出另外的观点,认为增生性瘢痕是局限在原创缘内,不能自动消退,切除后易复发。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩,由于增生的瘢痕高出皮肤表面、骚痒、刺痛、色素沉着及挛缩,常常严重影响患者的外观及功能,给患者的身体和精神带来严重损害,对它的预防及治疗一直是医学领域急待解决的一个难题,通过不断的努力我们在瘢痕的防治上取得了一定的成绩,其手段主要有:手术治疗、激素注射、压迫治疗、放射治疗、冷冻治疗和硅胶薄贴膜等其它药物治疗。目前临床上对于瘢痕的非手术治疗中,类固醇激素,特别是醋酸曲安奈德是一种公认疗效确切的药物,常用于瘢痕的局部注射,类固醇激素能有效抑制瘢痕胶原的合成,提高胶原酶活性,并促使胶原分解,但目前存在以下不足:①疼痛;②局部注射后药物的扩散不均;③目前的药物剂量及使用方法不易控制,长期使用激素的全身副作用明显;④瘢痕内注射只适用于小范围注射,扩大注射面积会受到单次剂量的限制。所以在瘢痕非手术治疗中,一种无痛的,局部药物贴膜应用是较为理想的方法,在当今,尽管对增生性瘢痕的发病机制和治疗手段进行了大量的研究,但目前仍没有理想的结果。基于上述原因,寻找一种方便有效的瘢痕治疗方法一直是医学工作者奋斗的目标。近几年,应用于增生性瘢痕的生物材料得到医学界的广泛关注其中细菌纤维素更是关注的焦点。细菌纤维素(Bacterial Cellulose,简称BC)是目前最细的天然纤维,属于纳米级纤维,大小仅为人工合成纤维的1/10,从化学组成上看,细菌纤维素与植物纤维素都是由葡萄糖以p-1,4-糖普键连接而成的高分子化合物。其结构、理化特性和生化特性等皆与植物纤维素有较大的差异。因为BC具有独特的生物亲和性、相容性、可降解性、适应性和无过敏反应性以及高的持水性和结晶度、良好的纳米纤维网络、高的张力和强度,尤其是良好的机械韧性,这些优良的特性,使细菌纤维素有着广泛的商业用途,如扬声器的振动膜、食品添加剂、渗透汽化膜、纸张性能增强剂、伤口护理敷料等。所以该材料有望成为一种优良的创伤愈合敷料。根据文献报道,从兔耳创面上皮化到逐渐出现增生,并在持续一定时间后又逐渐消退的过程来看,兔耳创伤愈合与人类创伤愈合的发生、发展过程相似。国内外已有学者曾报道细菌纤维素对皮肤创伤的促愈作用方面的相关实验研究,但是细菌纤维素是否能够对HS有治疗作用尚无人研究,正基于此我们设计了本实验。本实验内容分为两部分:1.兔耳增生性瘢痕动物实验模型的建立。动物瘢痕模型是进行瘢痕研究最有用的工具之一,在以往的研究中一般采用成纤维细胞体外培养体系,包括单层培养和叁维培养体系来对瘢痕进行研究,再就是通过临床观察来总结瘢痕的防治经验,这些研究方法都有一定的缺憾:成纤维细胞体外培养体系是体外实验,无法很好的模拟体内环境和条件;临床观测无法细致的研究瘢痕的发生、发展、转归。这些缺点都为更深入的研究瘢痕造成了无法逾越的障碍,因此,建立一种有效的动物模型一直是国内外医学工作者努力的方向。1997年Morris等报道:利用兔耳成功建立了增性瘢痕模型,并证实此模型产生的增生性瘢痕类似于人类增生性瘢痕,能量化的评价药物对瘢痕的作用。2.细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究。在增生性瘢痕面贴敷细菌纤维素后观察不同处理后第0,14,21,28,42,56d瘢痕面大体形态学变化、组织学变化、羟脯氨酸(Hpr)含量,通过实验研究为细菌纤维素的临床运用提供基础理论依据。目的1.了解兔耳创面愈合后可否发生类似人类增生性瘢痕样的改变。2.观察细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕的疗效,以证实其在减轻瘢痕中所起的作用。方法实验一:建立兔耳增生性瘢痕模型。取成年新西兰白兔30只,以3%戊巴比妥钠(30mg/kg)静脉麻醉后用圆规在每只兔耳皮肤腹侧面刻画出5个直径为1.5cm的圆,内外侧各2个,耳根部1个,每个间隔约1.0cm,避开血管,切除圆内皮肤及其下软骨膜,保留软骨,每只兔子两只兔耳有10个创面,30只兔子共300个兔耳创面。实验二:细菌纤维素作用于兔耳增生性瘢痕的实验研究。术后第21d左右兔耳创面上皮化且瘢痕增生明显。此时根据每只兔耳5个瘢痕面随机给予不同处理方式设计组别:A、B、C、D、E组;A组瘢痕面贴BC(1:5)、B组瘢痕面贴BC(1:6)、C组瘢痕面贴BC(1:8)、D组瘢痕面贴疤痕贴(阳性对照)、E组瘢痕面未贴任何材料且瘢痕自然生长(阴性对照)。又按观察时间点不同将30只兔子分为6组,每组5只,在给予兔耳瘢痕面不同处理方式后第0d、第14d、第21d、第28d、第42d、第56d观察每组5只兔子耳朵瘢痕增生情况,大体形态学观察及瘢痕厚度测量、组织学光镜下观察瘢痕组织成纤维细胞数量和胶原纤维结构和α-SMA表达量、羟脯氨酸(Hpr)含量检测。结果1.大体形态观察:给予兔耳瘢痕面不同处理方式后, A、B、C组和阳性对照D组第14d以前瘢痕面积和厚度均有增加,瘢痕组织颜色增红,质地都有变硬,阴性对照E组约第21d瘢痕厚度增大到顶峰,各组在高峰期后瘢痕逐渐软化,A、B、C组瘢痕面积减小、厚度降低、颜色减弱强度低于阳性对照D组但高于阴性对照E组。各观察时间点A、B、C、D、E组瘢痕组织厚度方差分析结果(F=21.871,P<0.001),差异具有统计学意义;A、B、C叁组两两之间差异不具有统计学意义(P>0.05);A、B、C叁组与阳性对照D组两两之间比较,A、B组与阳性对照D组两两之间差异具有统计学意义(P<0.001),C组与阳性对照D组差异不具有统计学意义(P>0.05);A、B、C叁组和阴性对照E组差异均具有统计学意义(P≤0.05);同时阳性对照D组和阴性对照E组差异也具有统计学意义(P<0.001)。2.组织学观察:兔耳创面愈合后初期各组瘢痕明显高出周围的正常皮肤,真皮组织增生明显,表皮下有大量结缔组织增生,增生的真皮中可见大量成纤维细胞,扩张的毛细血管,较多细胞外基质。不同处理后第14d A、B、C组真皮层变薄,浅层以胶原纤维聚集为主,呈杂乱无序的排列,深层与软骨平行排列,毛细血管管腔部分闭塞,成纤维细胞数达到高峰,其量较阴性对照E组明显减少,但稍多于阳性对照D组;处理后第21dA、B、C组可见中量增殖的成纤维细胞,中量规则排列的胶原纤维,各组均有程度不等的炎细胞浸润,同时可见较多的上皮细胞和毛细血管,此时阴性对照E组有大量增殖的成纤维细胞,大量不规则的粗大胶原纤维呈漩涡状排列或结节状排列,成纤维细胞数达到高峰;处理后第28,42,56d各组成纤维细胞数含量较前减少,A、B、C叁组成纤维细胞数量分别比较A>B>C(P≤0.05),A、B、C叁组胶原纤维结构比较差异不具有统计学意义(p>0.05),A、B、C组胶原排列较阴性对照E组整齐,但仍次于阳性对照D组。各组.a-SMA表达量测定:各组在不同处理后第0dα-SMA表达为一般阳性,随着时间延长,各组α-SMA表达数量呈上升趋势, A、B、C、D组第14d达到最高峰,而E组中α-SMA的高峰期表达阳性持续到第21d,在高峰期E组表达呈强阳性、A、B、C组中表达呈阳性、D组表达呈弱阳性,再随着时间的延长,高峰期后各组α-SMA阳性细胞表达数量减少,其中E组减少最小,其他各组减少较大,据此阳性表达强度D0.05);A、B、C叁组和阴性对照E组差异均具有统计学意义(P<0.001);同时阳性对照D组和阴性对照E组差异也具有统计学意义(P<0.001)。结论1.本实验兔耳腹面的全层皮肤缺损愈合后,可以产生与人增生性瘢痕的组织学结构类似的增生块,增生块的持续时间也与人的增生性瘢痕持续时间相似,进一步验证了增生性瘢痕动物模型。2.外用细菌纤维素敷料有效抑制了兔耳创面愈合后增生性瘢痕的形成,效果比较明显。3.外用细菌纤维素敷料减轻兔耳增生性瘢痕的效果不如疤痕贴片明显。4.吸水性比例为1:8的细菌纤维素为抑制兔耳增生性瘢痕的最适敷料,效果最明显。5.细菌纤维素敷料有望成为一种新型的减轻增生性瘢痕的医用敷料。

参考文献:

[1]. 建立增生性瘢痕动物模型的研究进展[J]. 张燕, 海洪宇, 王莹. 中国畜牧兽医文摘. 2018

[2]. 慢病毒介导的VEGF干涉联合METH-1抑制血管生成预防兔耳增生性瘢痕的研究[D]. 陈煜华. 第四军医大学. 2013

[3]. 兔耳增生性瘢痕动物模型的建立及应用[D]. 周勤生. 新疆医科大学. 2004

[4]. PI-3K/Akt信号转导通路在兔耳增生性瘢痕模型中的作用机制研究[D]. 刘巍敏. 昆明医科大学. 2013

[5]. 外用复方中药瘢痕膏抑制兔耳增生性瘢痕的实验研究[D]. 牛占国. 广西医科大学. 2007

[6]. 复方芪参提取物抑制兔耳瘢痕增生的实验研究[D]. 江洁美. 安徽医科大学. 2014

[7]. 兔耳增生性瘢痕模型的建立及微血管构筑在病理性瘢痕形成和发展过程中的意义[J]. 李虎, 李小静, 宁金龙, 高凤山, 董继英. 中国临床康复. 2006

[8]. 点阵CO_2激光联合积雪苷霜治疗兔耳增生性瘢痕的实验研究[D]. 张陶靓. 南京中医药大学. 2013

[9]. 人参提取物Rb1对兔耳增生性瘢痕的治疗效果[D]. 李昕珊. 桂林医学院. 2014

[10]. 细菌纤维素对兔耳增生性瘢痕影响的实验研究[D]. 邱竣. 南方医科大学. 2011

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兔耳增生性瘢痕动物模型的建立及应用
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