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摘要：线粒体是细胞能量代谢的中心，而在各种致病因素作用下线粒体极易出现各种结构和功能损伤，这在疾病的发生与发展中起着十分重要的影响，文章就线粒体结构和功能损伤及其检测方法作一综述。
关键词：线粒体损伤；检测方法
线粒体位于细胞核外,既能产生能量又能携带遗传信息,它在生物的生长、发育、代谢、衰老、疾病、死亡以及生物进化等方面都有非常重要的意义。而在外界各种致病因素作用下线粒体极易出现损伤,造成线粒体功能的障碍,进一步导致细胞功能的损伤,引起细胞的自噬、凋亡。这在疾病的发生与发展中起着十分重要的影响，因此寻找特异、敏感的线粒体损伤指标，检测可能的早期损伤，对于机体有着十分重要的意义。
线粒体损伤的基本机制包括线粒体DNA(mtDNA)的损伤和线粒体膜损伤。氧化应激的激活,产生过多的氧自由基,除了引起碱基配对错误、碱基位点的修饰和链的断裂使mtDNA损伤外,还使细胞及线粒体膜脂质过氧化,导致线粒体功能障碍,ATP生成减少,钙泵失活使细胞内钙增多,激活磷脂酶活性,使膜磷脂分解,造成膜通透性改变和跨膜电位的变化,导致蛋白质的释放并造成线粒体自身以及细胞的功能障碍,细胞色素C从线粒体释放到细胞浆,导致细胞凋亡或死亡。
线粒体损伤检测方法:
(1)线粒体形态学变化检测方法：20世纪60年代初，Engel 等[1]首先用MGT染色发现线粒体肌病患者肌膜和 肌纤维之间呈不规则的红染颗粒改变，称为粗糙红 纤维，为线粒体肌病具有特征性的形态学改变。宋 东林等[2]曾用电镜观察线粒体肌病时发现在骨骼肌 肌膜下线粒体异常增多，并有巨大畸形线粒体出现， 线粒体嵴型异常，可呈同心漩涡状、迷宫状或矩形结 晶状结构。姚英民等[3]曾用电镜观察轮状病毒感染 时线粒体形态变化时发现线粒体外形肿胀，电子密 度增高，基质中在大量具有紊乱的峭和晶状物，峭模 糊不清，基质凝集。此外还可以采用分光光度法和钙离子荧光探针FLUO-2/AM及荧光分光光度法测定线粒体肿胀及游离钙离子的含量。
(2)mtDNA缺失突变的检测方法:实时荧光PCR技术是目前最准确、重现性最好并得到 国际公认的核酸分子定量检测的标准方法。它是在PCR反 应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量。该技术 具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、无污染、自动化程度 高、能实现多重反应、具实时性和准确性等优点，适于快速分 析要求的大样本。进行mtDNA缺失片段和对照DNA片段的 定量分析时，一般采用相对定量，最后计算出发生缺失的 mtDNA占总mtDNA的比例。 常用的检测模式有TaqMan探针和SYBR Green I检测模 式。
(3)线粒体渗透转换孔（mitochondrial permeablity transition pore,MPTP)）[4]是线粒体渗透转换功能的结 构基础，MPTP 对细胞内多种离子浓度变化非常敏 感[5]，特别是对Ca2+浓度变化敏感。MPTP 的大量开启能引起膜 电位的崩解并导致包括细胞的凋亡。因此测定MPTP 在线粒体的研究中至关重要。有关对MPTP 的检测 方法有：活性物质标记测定、膜片钳法等[6]。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆标记法 需要对物质进行标记且测定繁琐，需要特殊的检测 方法；膜片钳法需要特殊的电极，工艺复杂，需要较高的技术；分光光度法简单易用，只需对反应体系的 吸光度进行时间扫描，就可获得线粒体渗透转换能 力的时相变化，间接反映了MPTP的能力.
(4)膜电位的检测方法:Chu等[7]刮曾用激光共聚焦检 测大鼠肠黏膜细胞线粒体跨膜电位变化，该法采用 线粒体跨膜电位检测试剂盒JC-1。JC-1是一种广 泛用于检测线粒体膜电位Δψm的理想荧光探针。 可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线 粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中，形 成聚合物，可以产生红色荧光；在线粒体膜电位较低 时，JC-1不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1为单 体，可以产生绿色荧光。这样就可以非常方便地通 过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常 用红绿荧光的相对比例来衡鼍线粒体去极化的比 例。Lim等[8]用四苯膦等脂溶性阳离子渗透入线粒 体膜基质，然后通过检测四苯膦的浓度来确定膜电 位，需要注意的是此法在检测过程中对溶液pH值的 稳定性要求较高，否则将影响实测值。膜片钳技术 是一种以记录通过细胞膜上的各种离子通道的离子 电流来反映细胞膜上单一或多个离子通道活动的技 术，其反映的电流特征可以用来评价线粒体功能。 全自动膜片钳技术效率高，是传统膜片钳技术的20～300倍，操作技术简单；缺点是仅适用于悬浮细胞的 检测[9]。线粒体膜是线粒体与周围环境联系、反应 的桥梁，膜磷脂含量与流动性的改变与疾病的发生、 发展密切相关。脂质过氧化作用可以导致膜磷脂的 减少，线粒体膜磷脂的检测对判断线粒体功能具有 重要意义[10]。
(5)胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）可破坏 线粒体的酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，进入恶性 循环状态。同时 ROS 还可攻击线粒体 DNA 产生氧化损伤，导 致线粒体 ATP 合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变 化，因此 ROS 增多也是线粒体功能障碍的表现之一[11，12]。 ROS 可采用荧光探针 DCHFDA 染料测定；用荧光探针 MitoSOX 检测线粒体活性氧。胞内ROS测定还包括化学发光法、电子自旋共振和分光光度法。
总结与展望
综上所述，线粒体是细胞能量的主要来源，对维持细胞正 常生理功能起着重要作用。线粒体功能的改变往往先于临床 症状出现。对线粒体结构及功能的检测可以及时察觉细胞功 能的改变并做相应的处理，可以阻止或延缓疾病的发生、发 展。虽然现在有多种方法可以用来检测线粒体的功能，但是由于多方面条件的限制，目前绝大多数方法仅局限于科研，距离 真正的临床实际应用仍然有很长的路要走。
参考文献
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论文作者:刘全,李毅
论文发表刊物:《医师在线》2018年1月下第2期
论文发表时间:2018/5/15
标签：线粒体论文; 损伤论文; 电位论文; 荧光论文; 细胞论文; 膜片论文; 功能论文; 《医师在线》2018年1月下第2期论文;