竺可青[1]2003年在《低浓度烷化剂MNNG对MAPK信号通路的作用》文中研究表明遗传不稳定(genetic instability)可表现为基因水平的微卫星不稳定(microsatellite instability，MIN)和染色体水平的染色体不稳定(chromosomal instability，CIN)。其发生机制包括DNA复制保真度降低(DNA聚合酶)，DNA修复系统障碍(包括BER、NER、MMR、HR、NHEJ)，细胞周期DNA损伤校正点缺陷(P53，DNA-PK，ATM等)，端粒酶和端粒改变，以及外遗传机制(epigenetic mechanism)如甲基化。在一系列家族癌综合症中，这些机制多有较深入的研究。如遗传性非息肉病性结直肠癌(Hereditary non polyposis colorectal cancer，HNPCC)中MMR途径hMSH_2，hMLH_1，hPMS_1和hMPS_2基因突变；着色性干皮病(xeroderma pigmentaosa)患者DNA切除修复系统遗传性缺陷；毛细血管扩张性共济失调(ataxia telangictasia)中，细胞周期DNA损伤校正点信号传导蛋白ATM突变；以及多种肿瘤抑制基因启动子区甲基化所致表基因沉默。遗传不稳定不仅成为肿瘤生物学和临床医学的研究热点，在遗传学和遗传毒理学也已积累了大量资料。环境致突变／致癌物除了通过直接损伤DNA外，还可通过诱发细胞内遗传不稳定状态而导致突变事件发生。细胞在受到离子辐射、致癌物(如烷化剂)攻击后，可产生细胞延迟发生的遗传不稳定，包括延迟发生的增殖性死亡、克隆能力的下降，延迟发生的染色体重排、畸变以及延迟发生的点突变。即DNA损伤剂除了能直接作用于细胞遗传物质而造成损伤部位的定标性突变(targeted mutation，TM)外，还可能通过诱导某些基因的表达或功能改变导致DNA复制差错，从而在未损伤部位形成非定标性突变(non targeted mutation，NTM)。非定标性突变是外源性DNA损伤剂造成基因组遗传不稳定的结果。 余应年等曾以穿梭质粒为探针，用DNA损伤剂甲基亚硝基胍(MNNG)在猴肾Vero细胞中诱导了非定标性突变。并在国家自然科学基金连续资助的工作基础上提出有关以非定标性突变为特征的遗传不稳定的发生机制模式。即化学致癌物→DNA损伤和非DNA 浙江大学博士研究生论文损伤性应激一细胞信号转导途径激活一基因表达改变一DNA聚合酶谱改变一DNA复制保真度降低一细胞遗传不稳定一基因非定标突变形成。本论文即重点探讨低浓度化学致癌物MN’NG通过DNA损伤和／或非DNA损伤途径，对信号转导途径的影响。由于我们所用的低浓度化学致癌物刺激所造成的细胞反应更接近现实环境中的化合物刺激，因而更具有实际意义。 由于非定标性突变不是DNA直接受攻击的结果，在损伤部位到突变部位之间必然存在特定的联系。这种联系是否属于常见的蛋白质磷酸化级联反应，是何种类型的磷酸化反应？余应年等发现可激活分裂原激活的蛋白激酶（Mitogen activated protein klnase，MAPK）的蛋白合成抑制剂放线菌酮（CHM）不仅不抑制MNNG诱发的非定标性突变，反而促进发生。采用产P］体内预标记及凝胶双向电泳方法差异显示蛋白斑点的分子量和印迹杂交试验结果，认为所见蛋白斑点可能为丝／苏氨酸磷酸化蛋白，且可能为MAPK成员。 不同应激原如何启动MAPK家族信号转导通路也有待证明。多种应激原，如紫外线 （UV）、X线、烷化剂、抗肿瘤药等都能造成 DNA损伤，由此引出的问题是，激活 MAPK等信号转导通路的信号是直接来自膜上？还是由核内损伤部位发出的信号返回膜上？ 结合以上工作，本论文着重研究探讨以下3个问题：①MAPK超家族中JNK／SAPK和 P38 MAPK对非定标突变的贡献。②JNK／SAPK、P38 MAPK信号转导通路的信号源是直接来自膜上？还是由核内损伤部位发出的信号返回膜上？MNNG如何启动MAPK家族信号转导通路。③如果＊＊＊K通路激活依赖于核内事件，则低浓度MN’N G能否造成＊＊A损伤？其损伤信号的介导与MAPK 的关系以及最终对细胞周划的影响怎样？l．MNNG对哺乳类细胞 JNK／SAPK及 P38 MAPK信号通路的作用及其信号源研究 为了评估低浓度MN’NG处理猴肾Wro细胞引起的胞内 川HSAPK通路和 P38MAPK通路反应的情况．我们用诱导非定标突变相同剂量0．ZpM MN’NG和相同时间2．5小时，刺激 Vero细胞，发现 eKjSAPK通路明显抑制（活性为对照 DMSO组的 0．引倍）：P38 MAPK在相同条件刺激下被激活（活性为对照 DMSO组的 1．47倍）。 为了判断 JNK／SMK、P38 MAPK信号转导通路的可能信号源，我们检测了相同条件处理下的脱核细胞反应。脱核细胞经Giernsa染色证实至少95％的细胞已被有效去核。实验发现在无核细胞中，MNNG引起的JNK抑制一如在完整细胞。JNK／SAPK在MN’NG处理后活性为对照DMSO组的0．45倍。说明MNNG对川K途径的抑制并不需要核物质 4 浙江大学博土研究生论文的参与。但是否能完全排除基因组DNA损伤作为JNK途径起源的可能，尚值得进一步研究。至少在Vero细胞，在MN’NG作用2．sh这个时间点上，JNK的抑制不需要核内信号。当然，该实验结果不能排除MN’NG对线粒体DNA损伤引起的反应，但至少说明该作?
赵继敏[2]2009年在《PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路调控DNA polβ表达在食管癌中的作用》文中研究说明癌基因、抑癌基因和DNA修复基因并称为叁大肿瘤相关基因。DNA修复基因突变、功能的异常和表达水平的改变可以引起前两者DNA损伤修复的异常,而癌基因、抑癌基因突变的积累最终可导致肿瘤的发生。DNA聚合酶β(DNApolymeraseβ,DNA polβ)是参与DNA碱基切除修复的主要聚合酶之一,高表达的polβ还具有参与DNA复制、基因重组、跨损伤合成等功能,但是polβ缺乏3′-5′的校读功能,在DNA复制中保真度最低,造成基因组的不稳定性。polβ的改变与肿瘤发生发展的关系已在一些肿瘤和研究中得到证实。我们的前期研究发现食管癌组织中存在polβ基因的突变和高表达。肿瘤细胞中存在信号转导途径的异常,一些信号分子的过度表达或组成型激活,这将导致这些信号分子下游信号途径的增强,引起细胞的转化、增殖、抵抗细胞凋亡、促进细胞存活,与肿瘤的发生、发展密切相关。研究显示polβ的高表达是转录因子的活化和调节完成的,polβ基因启动子中含有cAMP反应元件(Cyclic-AMP response element,CRE),转录因子CREB/ATF家族成员(包括CREB、ATF1/2,CREM-1等)能识别CRE基序,促进polβ基因的转录表达。转录因子的激活既是基因表达调控的一个主要事件,又是细胞内信号通路中信号传递过程的重要环节。因此研究参与polβ表达的信号通路,探讨其在肿瘤发生、发展中的作用,寻找可能的肿瘤治疗的新靶点将具有重要价值。互隔交链孢霉是河南省食管癌的重要发病因素,其主要代谢物互隔交链孢酚(alternariol,AOH)(又称链格孢酚)具有致癌性。研究显示AOH能够损伤DNA。一般而言,DNA损伤作为一种信号,将诱导细胞应激反应,激活DNA修复系统基因,使表达增高,以修复损伤。AOH能否激活一定的细胞信号系统,上调polβ表达,尚不清楚。由于伦理学问题使正常食管上皮取材困难,再加上正常食管上皮原代细胞扩大培养的难度的限制,故本课题选取毒理学实验中常用的NIH3T3细胞为靶细胞,拟从观察AOH对NIH3T3细胞的毒性和DNA损伤作用及转化能力入手,寻找AOH激活NIH3T3细胞中DNA polβ表达增高的信号转导通路。在此基础上,进一步研究食管癌EC9706细胞中这些信号通路的状态,探讨在食管癌细胞中这些信号通路与polβ表达的关系。然后利用阻断信号通路的方法,降低相关信号分子的活化、减少polβ表达,观察对食管癌EC9706细胞生物学特性的影响和对化疗药物顺铂的敏感性的改变,为食管癌的治疗提供新的思路。第一部分AOH对NIH3T3细胞生物学特性的影响和激活DNA polβ表达的信号通路研究第一章AOH对NIH3T3细胞生物学特性的影响和诱导DNA polβ表达方法1.以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH分别作用NIH3T3细胞24 h和48 h,MTT法观察不同浓度的AOH对细胞增殖的影响;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞4 h,单细胞凝胶电泳实验观察AOH对DNA损伤程度;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞24 h,流式细胞术(FCM)检测AOH对NIH3T3细胞周期的影响;以1.0,2.0,10.0,20.0,50.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞48 h,将存活细胞传代后,重复刺激48 h,将细胞接种在六孔板中(150个/孔),克隆形成率实验观察AOH对NIH3T3细胞的转化作用。2.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞16 h,采用RT-PCR、免疫细胞化学法和Western Blotting检测不同浓度的AOH对NIH3T3细胞中polβmRNA和蛋白水平表达的影响。结果1.一定浓度的AOH抑制NIH3T3细胞增殖1.0μmol/LAOH作用24 h和48 h吸光度值与对照组相比无统计学差异(P＞0.05);2.0μmol/L以上各浓度组24 h和48 h的吸光度值均较对照组降低,差异有统计学意义(P＜0.05),显示明显的浓度依赖关系。2.AOH损伤NIH3T3细胞DNA计算出各组细胞的尾部DNA含量,发现1.0,2.0μmol/L AOH剂量组与对照组无明显差异,10.0,20.0,50.0μmol/L AOH组均高于对照组(P＜0.05),且50.0μmol/L组高于10.0,20.0μmol/L组,说明AOH可造成DNA损伤,且存在浓度依赖性。3.AOH引起NIH3T3细胞周期G2/M期阻滞1.0μmol/L和2.0μmol/L组细胞周期与对照组相比,无明显变化。随着AOH浓度的增加,G2/M期细胞百分比逐渐增大,而G0/G1期细胞百分比降低,且呈浓度依赖性,与对照相比差异均有统计学意义(P＜0.05),表明细胞被阻滞于G2/M期。4.AOH处理的NIH3T3细胞克隆形成率提高克隆形成实验结果显示,随着AOH浓度的增大,平均克隆率逐渐增高(P＜0.05),但是50.0μmol/L AOH组克隆形成率降低了。5.AOH诱导NIH3T3细胞中polβ表达增高RT-PCR、免疫细胞化学和Western Blotting结果表明,2.0,10.0,20.0μmol/LAOH作用NIH3T3细胞16 h后,polβ表达增高,具有浓度依赖性。第二章AOH激活NIH3T3细胞中PKA-CREB和p38MAPK-ATF2信号通路方法1.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞1 h,检测NIH3T3细胞中PKA的活化水平;作用2 h,检测CREB的活化水平。20.0μmol/L AOH作用细胞0,30,60和120 min,检测NIH3T3细胞中PKA和CREB的活化水平。PKA特异性抑制剂H89预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/LAOH作用1 h,检测PKA活性变化;作用2 h,检测CREB的活性变化。2.分别用2.0,10.0,20.0μmol/L AOH作用NIH3T3细胞2 h,Western Blotting方法检测细胞中p38和ATF2的磷酸化水平;20.0μmol/L AOH作用细胞0,1,2和4h,检测p38和ATF2的磷酸化水平;利用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用2 h,检测p38和ATF2磷酸化水平的变化。3.JNK特异性抑制剂SP600125预处理细胞1 h后,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞2 h,同时设20.0μmol/L AOH直接作用组,Western Blotting检测AOH对NIH3T3细胞中JNK1/2的磷酸化作用和对ATF2磷酸化水平的影响。4.p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞2h,Western Blotting检测细胞中磷酸化CREB表达水平的变化。结果1.AOH激活NIH3T3细胞中PKA-CREB信号通路1.1 AOH诱导PKA激活并发生核转位Western Blotting的结果表明,2.0μmol/L AOH对PKA的活化作用不明显(P＞0.05),而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活PKA,与对照组相比差异有显着性(P＜0.05),显示浓度依赖关系。免疫细胞化学法检测结果与之一致。免疫荧光结果表明,PKA活化并转位入核。20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,PKA的活化水平逐渐增高,在60 min时达到高峰,显示时间依赖关系。抑制实验的Western Blotting结果显示,H89预处理组活化的PKA的表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05),免疫细胞化学法和免疫荧光检测结果与之一致。1.2 AOH诱导转录因子CREB激活Western Blotting的结果表明,2.0μmol/L AOH对CREB磷酸化水平增加不明显(P＞0.05),而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活CREB,与对照组相比差异有显着性(P＜0.05),显示浓度依赖关系。免疫细胞化学法、免疫荧光检测结果与之一致。20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,CREB的磷酸化水平逐渐增高,在2 h达到高峰,显示时间依赖关系。抑制剂H89预处理细胞后,Western Blotting的结果表明,H89部分阻断AOH诱导的CREB的活化,H89预处理组磷酸化CREB的表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05),免疫细胞化学法和免疫荧光检测结果与之一致。提示AOH处理细胞后,CREB的磷酸化一定程度上依赖于上游PKA的激活。2.AOH激活NIH3T3细胞中p38MAPK-ATF2信号通路2.1 AOH诱导p38MAPK激活Western Blotting的结果表明,2.0,10.0,20.0μmol/L的AOH均能够增加p38的磷酸化水平,与对照组相比差异有显着性(P＜0.05),并显示浓度依赖关系。20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,p38的活化水平逐渐增高(P＜0.05),在2 h时达到高峰,显示时间依赖关系。用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,Western Blotting的结果表明,SB203580明显抑制AOH诱导的p38的活化,SB203580预处理组p38的磷酸化水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。2.2 AOH诱导转录因子ATF2激活Western Blotting的结果表明,2.0μmol/LAOH对ATF2磷酸化水平增加不明显(P＞0.05),而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活ATF2,与对照组相比差异有显着性(P＜0.05),显示浓度依赖关系。20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,ATF2的活化水平逐渐增高(P＜0.05),在2 h时达到高峰,与p38的磷酸化一致,并显示时间依赖关系。用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,Western Blotting的结果表明,SB203580明显抑制AOH诱导的ATF2的活化,SB203580预处理组ATF2的磷酸化水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。提示AOH处理细胞后,ATF2的磷酸化依赖于上游p38MAPK的激活。3.JNK通路未被AOH激活JNK是MAPK家族成员之一,介导多种刺激引起的细胞应激反应。WesternBlotting方法检测DNA损伤剂AOH能否激活JNK通路,结果显示,AOH未能增加NIH3T3细胞中的JNK磷酸化水平,JNK抑制剂未能降低AOH对ATF2的激活作用。4.在AOH诱导下,p38MAPK促进CREB的磷酸化Western Blotting结果显示,p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞后,结果显示,与AOH激活组相比,SB203580预处理组中磷酸化CREB的水平降低(P＜0.05)。第叁章AOH诱导NIH3T3细胞中DNA polβ表达依赖PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路的激活方法1.PKA特异性抑制剂H89预处理NIH3T3细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,免疫细胞化学法和Western Blotting检测polβ的表达,同时设20.0μmol/LAOH直接作用组和溶剂对照组。2.p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测polβ的表达,同时设20.0μmol/LAOH直接作用组和溶剂对照组。3.H89和SB203580共同预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测PKA和p38MAPK双通路阻断对AOH诱导的NIH3T3细胞中polβ表达的影响。4.JNK特异性抑制剂SP600125预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测AOH诱导的polβ表达,观察JNK信号通路在DNA polβ基因表达中的作用。结果1.PKA特异性抑制剂H89部分降低AOH诱导的polβ表达为探讨AOH诱导的DNA polβ蛋白表达增加是否通过PKA-CREB信号通路,我们应用PKA特异性抑制剂H89预处理细胞,再用Western Blotting方法检测AOH对DNA polβ蛋白表达的影响。结果显示,H89可以部分抑制AOH诱导的DNA polβ蛋白表达,H89预处理组polβ表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。2.p38特异性的抑制剂SB203580部分抑制AOH诱导的polβ表达为探讨AOH诱导的DNA polβ蛋白表达增加是否通过p38-ATF2信号通路,应用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,再用Western Blotting方法检测AOH对DNA polβ蛋白表达的影响。结果显示,SB203580可以部分抑制AOH诱导的DNApolβ蛋白表达,SB203580预处理组polβ表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。3.PKA和p38MAPK双通路阻断明显降低polβ表达Western Blotting结果显示,与单独使用H89和SB203580预处理组相比,H89、SB203580联合作用明显降低AOH诱导的polβ表达(P＜0.05)。4.JNK通路未在NIH3T3细胞中AOH诱导的polβ表达中起作用JNK是MAPK家族成员之一,介导多种刺激引起的细胞应激反应。WesternBlotting方法检测DNA损伤剂AOH能否激活JNK通路参与polβ表达。结果表明,JNK抑制剂未能降低AOH诱导的polβ的表达,提示JNK通路未参与AOH诱导的polβ表达。第二部分PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路激活调节DNA polβ表达在食管癌细胞EC9706中的作用第一章食管癌EC9706细胞中PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路激活调节DNA polβ表达方法1.利用免疫细胞化学和Western Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中PKA催化亚基、CREB的磷酸化状态,同时用PKA特异性的抑制剂H89处理细胞2 h,观察活化的PKA、CREB的改变。2.利用免疫细胞化学和Western Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中p38MAPK、ATF2的磷酸化状态,同时用p38抑制剂SB203580处理细胞2 h,观察活化的p38、ATF2的改变。3.PKA特异性的抑制剂H89和p38抑制剂SB203580单独和联合处理EC9706细胞16 h,利用免疫细胞化学和Western Blotting方法观察DNA polβ表达的变化。4.提取未处理EC9706细胞、H89和SB203580分别处理16 h的EC9706细胞的核蛋白,经凝胶电泳阻滞实验(EMSA),分析EC9706细胞中活化的CREB、ATF2与DNA polβ启动子中CRE元件的结合活性。结果1.EC9706细胞中PKA-CREB通路处于激活状态Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的PKA和CREB,H89可以降低其磷酸化水平。2.EC9706细胞中p38-ATF2通路处于激活状态Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的p38和ATF2,抑制剂SB203580可以降低其磷酸化水平。3.EC9706细胞中激活状态的PKA和p38MAPK通路参与调节DNA polβ的表达为证实EC9706细胞中PKA、p38MAPK通路的激活与DNA polβ的表达存在一定的关系,我们采用阻断信号通路的方法,分别单独和联合使用PKA抑制剂H89和p38抑制剂SB203580作用EC9706细胞16 h,观察DNA polβ的表达的变化。免疫细胞化学和免疫印迹实验结果显示,未处理的EC9706细胞中有一定水平的DNA polβ的表达,H89和SB203580可以部分降低细胞中polβ的表达,两者联合使用,polβ的表达降低更明显。EMSA结果显示,EC9706细胞中活化的CREB、ATF2与polβ启动子中的CRE元件有较强的结合活性。第二章阻断DNA polβ表达的信号通路对食管癌EC9706细胞生物学特性和对顺铂敏感性的影响方法1.PKA特异性抑制剂H89和p38MAPK特异性抑制剂SB203580单独和联合处理EC9706细胞24 h,用倒置显微镜观察细胞形态学变化;用Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;水溶性四氮唑(WST-8)测定抑制剂作用24和48 h细胞增殖改变。2.在EC9706细胞中加入H89和SB203580单独和联合预处理1 h,再加入顺铂培养24 h,用倒置显微镜观察细胞形态学变化;用Annexin V-FITC和PI双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率;WST-8测定抑制剂作用24和48 h细胞增殖改变。结果1.阻断PKA和p38信号通路、降低DNA polβ表达对食管癌EC9706细胞生物学特性的影响H89和SB203580单独作用EC9706细胞,部分细胞出现细胞形态缩小,细胞增殖减慢;当H89和SB203580联合作用,EC9706细胞出现细胞形态缩小,胞质凝缩,细胞漂浮数明显增加,细胞数量下降,增殖受到抑制。细胞增殖实验结果显示,与对照组相比,H89组和SB203580组细胞的24 h、48 h存活率均下降(P＜0.05),当H89与SB203580共同作用于细胞时,细胞存活率进一步下降(P＜0.05)。Annexin V-FITC和PI双染色,细胞凋亡检测结果显示,EC9706在H89和SB203580单独作用24 h,均表现为促进细胞凋亡;当H89和SB203580联合使用时,促进细胞凋亡和坏死作用更加显着。2.阻断PKA和p38信号通路、降低DNA polβ表达增加食管癌EC9706细胞对顺铂的敏感性化疗药顺铂单独作用EC9706细胞,出现细胞形态缩小,漂浮细胞数量增加,细胞增殖较慢;当H89和SB203580分别与顺铂联合作用,EC9706细胞出现细胞形态缩小,胞质凝缩,细胞漂浮数明显增加,细胞数量下降,增殖明显受到抑制,而H89、SB203580共同联合顺铂使用时,这种变化尤为明显。细胞增殖实验结果显示,与单用顺铂相比,当H89或SB203580与顺铂联合作用于细胞时,细胞存活率下降,细胞的增殖受到抑制(P＜0.05),增加了对顺铂的化疗敏感性;当叁者联合,抑制更明显。细胞凋亡检测结果显示,与单独使用顺铂的对照组相比,当H89或SB203580联合顺铂使用时,细胞总凋亡率增加(P＜0.05);尤其是H89、SB203580和顺铂叁者联合时更明显。结论1.一定浓度的AOH能够产生抑制细胞增殖、引起细胞周期阻滞、造成DNA损伤等急性反应和和克隆形成率增加,并能够诱导DNA polβ表达增高。2.AOH诱导NIH3T3细胞中的PKA-CREB信号通路和p38MAPK-ATF2信号通路激活,上调DNA polβ基因表达。3.在食管癌细胞EC9706中PKA-CREB信号通路和p38MAPK-ATF2信号通路处于激活状态,两者共同促进DNA polβ的表达。4.阻断PKA和p38MAPK信号途径,降低DNA polβ表达,改变EC9706细胞生物学特性,增加对化疗药顺铂的敏感性,有可能成为食管癌治疗的辅助治疗方法。
李旭峰[3]2017年在《叶酸在MNNG致哈族DNMT1高表达细胞DNA损伤及相关信号通路中作用的研究》文中进行了进一步梳理目的:DNMT1高表达在DNA甲基化模式的转变和肿瘤的发生、发展中起促进作用。在前期已建立的哈萨克族食管上皮永生化细胞系的基础上,利用TALE技术构建DNMT1高表达的哈萨克族食管上皮细胞株,分析叶酸在MNNG致哈族食管上皮细胞DNMT1高表达细胞DNA损伤及相关信号通路调控机制中的作用,探讨叶酸对MNNG致细胞损伤过程中的干预作用,为食管癌预防和治疗提供理论依据。方法:将哈族食管上皮细胞及哈族食管上皮DNMT1高表达细胞分别分为叁组,使用MNNG进行染毒并分别施以低浓度叶酸、中等浓度叶酸及高浓度叶酸干预,使用倒置荧光显微镜观察各组细胞生长情况;应用单细胞凝胶电泳实验(彗星实验)检测各组细胞DNA损伤情况;应用RT-PCR方法检测各组细胞PI3K-AKT通路中PP2A、PTEN、AKT基因mRNA表达水平;应用Western blot法检测各组细胞PI3K-AKT通路中PP2A、PTEN、AKT的蛋白表达水平。结果:(1)两种哈族食管上皮细胞形态损伤情况随染毒时间延长而加重,且在相同干预情况下,DNMT1高表达细胞较非高表达细胞受MNNG影响更为严重,但高浓度叶酸组细胞较同类型同时期低、中浓度叶酸组生长情况良好,细胞死亡率低,细胞排列整齐,形态正常,细胞镜下形态最接近于同类同时期对照组细胞;(2)两种食管上皮细胞DNA损伤情况随染毒时间延长而加重,且哈族食管上皮DNMT1高表达细胞较哈族食管上皮细胞DNA损伤情况更为严重,表现为尾长在染毒早期、中期、晚期时高于正常细胞组,差异有统计学意义(t早=2.043,P=0.004;t中=2.217,P=0.030;t晚=2.418,P=0.016),DNMT1高表达细胞组Olive尾矩长度在早期、中期及晚期时高于正常细胞组,差异有统计学意义(t早=2.471,P=0.020;t中=2.412,P=0.016;t晚=2.047,P=0.004)。但高浓度叶酸组细胞较同类型同时期低、中浓度叶酸组DNA损伤情况较轻,Tail DNA%含量、尾长、Olive尾矩均低于低、中浓度叶酸组(P<0.05);(3)两种食管上皮细胞PP2A、PTEN基因mRNA表达水平及蛋白表达水平随染毒时间延长而降低,且DNMT1高表达细胞表达水平低于同时期同叶酸浓度哈族食管上皮细胞(P<0.05),而AKT基因mRNA表达水平及蛋白表达水平随染毒时间延长而上升,且DNMT1高表达细胞AKT基因mRNA表达水平及蛋白表达水平高于同时期同叶酸浓度哈族食管上皮细胞(P<0.05)。但高浓度叶酸组细胞较同类型同时期低、中浓度叶酸组PP2A、PTEN基因mRNA表达水平及蛋白表达水平较高,AKT基因mRNA表达水平及蛋白表达水平较低(P<0.05)。结论:哈族DNMT1高表达细胞较哈族食管上皮细胞更易受到MNNG影响,且随染毒时间延长细胞损伤程度加重,表现为形态改变、DNA损伤,以及导致PI3K-AKT通路中PP2A、PTEN基因mRNA及蛋白表达下调,AKT基因mRNA及蛋白表达上调;但高浓度叶酸可降低MNNG对细胞的损伤,保护PI3K-AKT通路中PP2A、PTEN、AKT基因的正常表达,保持充足的叶酸摄入对食管癌的发生发展可起到一定的保护作用。
朱慧芳[4]2009年在《Y家族DNA聚合酶对化学致癌物MNNG应答的转录调控研究》文中研究表明单功能烷化剂N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)是一种在实验室中普遍使用的模式化学诱变剂和致癌剂,用于研究环境中广泛存在的N-亚硝胺类化学物质的致突变致癌机制。MNNG能与DNA及蛋白质等生物大分子形成加合物,引起突变和其它损伤。本实验室长期致力于MNNG等环境化学污染物引起细胞损伤机制的研究,并对MNNG等诱发非定标性突变以及细胞遗传不稳定的机制提出了以下假设:致突变致癌物经由DNA损伤和非DNA损伤途径诱发一系列信号转导通路的激活,引起相关基因表达发生改变,包括DNA聚合酶表达谱改变,致使DNA复制保真度下降,最终可导致非定标性突变和细胞遗传不稳定的形成。为深入探讨MNNG引起DNA复制保真度下降的机制,我们对具有低复制保真度特点、参与跨DNA损伤合成的Y家族聚合酶Polη、Polι和Polκ的启动子及其对MNNG应答的转录调控机制进行了研究。主要研究方法和结果:a.应用生物信息学软件结合进化足迹法对POLH、POLI和POLK启动子及其转录因子结合位点进行预测,并对它们共同的转录因子和可能的信号通路进行分析,推测E2F和STAT等相关信号通路可能在POLH、POLI和POLK的转录调控中起一定作用。应用报告基因技术分析POLH、POLI和POLK启动子截短体的转录活性,对叁个聚合酶的最小启动子区、转录激活区和抑制区进行了定位。b.定量RT-PCR和/或免疫印迹试验检测发现10μM MNNG可以引起POLH、POLI和POLK转录上调。应用突变、报告基因和转录表达分析等技术发现:(1)过表达IRF1上调Polη表达;将POLH启动子区-898位或-590位IRF1结合位点突变后,过表达IRF1不能引起其转录上调,也抑制了MNNG引起的POLH启动子的活性增加,说明IRF1与-898位和-590位结合,参与调控MNNG诱导的POLH的转录上调。(2)MNNG引起POL1的转录激活,Sp1在MNNG诱导POLI的转录调控中起一定作用。(3)MNNG可能通过多个转录因子的协同作用调节POLK的表达,而起主要调控作用的转录因子有待于进一步研究。c.为了研究调控基因表达的“转录因子组”,我们初步建立了DNA pulldown-质谱检测方法,为下一步研究基因的转录调控机制提供有力的工具。主要结论:(1)首次系统研究了Y家族DNA聚合酶POLH和POLI启动子的活性,发现POLH和POLI启动子上的多个反应元件参与基因的转录调控,有的是正向调控,有的则是负向调控;(2)首次证明了IRF1和Sp1分别参与了MNNG诱导的POLH和POLI的转录激活调控;(3)初步建立的DNA pulldown-质谱检测方法可用于鉴定与基因启动子序列结合的多个转录因子。本课题的研究有助于进一步阐明Y家族聚合酶在DNA损伤应答过程中的转录调控机制,为探索化学致突变致癌物的作用机制及干预的新途径提供了新的实验依据。
竺可青, 朱建伟, 章锁江[5]2005年在《GSH减少可加强MNNG对P38 MAPK磷酸化》文中研究表明目的:了解低浓度N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)对P38 MAPK的影响,以及谷胱甘肽(GSH)在该信号通路中的调节作用。方法:用L-丁硫氨酸-S,R-磺基(L-buthionine-S,R-sulfoximine)减少细胞谷胱甘肽含量后,采用Western印迹法比较MNNG处理组和对照组P38MAPK磷酸化状态,观察MNNG对P38磷酸化状态的影响。用光密度扫描仪测定各蛋白质条带吸光值。“P”为磷酸化P38MAPK的吸收值,“T”为总P38MAPK吸收值。在各时点以对照组磷酸化率P/T为1·0,计算MNNG组的相对磷酸化率。结果:BSO预处理24h后,MNNG处理2·5h的相对磷酸化率为0·84,2·5h处理后换DMEM全培养基3h的相对磷酸化率2·19。结论:细胞内GSH含量降低可促进P38MAPK的活性。
参考文献：
[1]. 低浓度烷化剂MNNG对MAPK信号通路的作用[D]. 竺可青. 浙江大学. 2003
[2]. PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路调控DNA polβ表达在食管癌中的作用[D]. 赵继敏. 郑州大学. 2009
[3]. 叶酸在MNNG致哈族DNMT1高表达细胞DNA损伤及相关信号通路中作用的研究[D]. 李旭峰. 新疆医科大学. 2017
[4]. Y家族DNA聚合酶对化学致癌物MNNG应答的转录调控研究[D]. 朱慧芳. 浙江大学. 2009
[5]. GSH减少可加强MNNG对P38 MAPK磷酸化[J]. 竺可青, 朱建伟, 章锁江. 中国病理生理杂志. 2005
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