关键词：LUAD；miRNA-1205；APC2
1 前言
肺癌作为最常见的恶性肿瘤之一，已成为全球癌症相关死亡的主要原因[1,2]。大约80%的肺癌类型属于非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)[3]。非小细胞肺癌可分为两大类:肺鳞癌(Lung Squamous Carcinoma，LUSC)和肺腺癌(LUAD)[4]。目前，LUAD的发生率已经超过了LUSC，已成为NSCLC患者死亡的主要原因[5]。近年来，精准医疗和分子靶向治疗技术取得了很大进展，但LUAD患者的5年生存率仍不容乐观[6]。因此，寻找LUAD诊断的标志物和有效的治疗靶点至关重要。miRNA是由21-25个核苷酸组成的小RNA，具有负的转录后调控作用[7]。越来越多的证据表明，miRNA在多种癌症中经常失调，可能是调节癌症增殖和转移的一个关键性因素[8-10]。miRNA在肺癌增殖、上皮-间质转化和治疗反应中起着重要作用[11]。MiR-4735-3p通过调节非小细胞肺癌FBXL3基因抑制细胞增殖和迁移[12]，miRNA-19通过抑制CBX7基因表达促进非小细胞肺癌细胞增殖[13]。PVT1是位于8q24号染色体c-myc下游的一个位点，产生多种非编码RNA，许多研究表明PVT1基因区与肿瘤生物学有关，作为PVT1区域的一员，microRNA-1205 (miR-1205)尚未得到很好的研究[14]。有学者研究了骨肉瘤细胞中miR-1205 及APC2的关系[15]，然而，miR-1205是否参与LUAD进展的研究尚未见报道。腺瘤息肉病大肠杆菌蛋白2 (APC2)，一个著名的同族体腺瘤息肉病杆菌(APC)的肿瘤抑制基因，研究发现APC1和APC2可调节Wnt /β-catenin负面信号通路[16-18]。Zhang等人[19]发现G9a通过作用于NSCLC中HP1α和APC2基因的表达来抑制其生长和Wnt信号通路。尽管如此，但是关于APC2及其与LUAD中miRNA的关系还知之甚少。miR-1205与APC2之间的关系，以及它们的表达和生物学功能，在LUAD中尚未被探索。本研究的结果证实了肺腺癌组织中miRNA-1205与APC2的表达的相关性，及其与肺腺癌患者预后的相关性。
2 患者与方法
2.1 患者收集
收集2012年以来中国医科大学附属第四医院病理科的54对LUAD患者肿瘤组织及癌旁组织。本研究经中国医科大学附属第四医院伦理委员会批准。标本在-80℃超低温冰箱中保存。
2.2 互补脱氧核糖核酸（cDNA）合成及实时定量聚合酶链反应（qPCR）
采用RNA提取试剂盒(志贺大津，日本)提取互补脱氧核糖核酸(cDNA)合成及实时定量聚合酶链反应（qPCR）总RNA。逆转录反应采用转录试剂盒 (志贺大津，日本)进行。快速聚合酶链反应采用预混的ExTaq RR420A试剂(志贺大津，日本)进行定量检测。实验所用引物购买于上海生物工程公司。mRNA的特异性引物和内部控制如下：miR-1205:F: TAGCCTGCTTGGGTGGAA R:TATGGTTTTCACGACTGTGTGAT APC2：F:CTGTACCGGGTCTCTGCAGTGTTA R:TACGCCGGACAGATGGCTTTA；GAPDH：F:AAGGTGAAGGTCGGAGTCA R: GGAAGATGGTGATGGGATTT。采用GAPDH作为APC2 mRNA的内参。扩增结果采用ABI 7300实时聚合酶链反应系统(BD生物学，美国富兰克林湖)进行检测。所示的结果相对2-ΔΔCT表达式计算的方法。
2.3统计分析
所有数值均用平均值±标准差表示。通过非配对t检验比较不同实验组的均数。如果概率<0.05，则差异有统计学意义（p<0.05）。所有分析均使用GraphPad Prism软件（加利福尼亚州，美国）进行。
3 研究结果
3.1 LUAD中miR-1205的上调
qPCR结果显示LUAD组织中miR-1205的含量高于邻近癌旁组织，组间差异有统计学差异（图1A）。
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3.2 LUAD中APC2的下降
qPCR结果显示APC2在LUAD组织中的表达明显低于癌旁组织组间差异有统计学差异（图2A）。
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图2.A.APC2 mRNA表达水平采用qPCR检测LUAD组织及邻近组织，提示APC2在LUAD组织中低表达。3.3 miR-1205和APC2表达谱呈负相关
根据miR-1205和APC2表达情况，我们进行分析，结果显示患者miR-1205和APC2表达谱呈负相关。
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图3A. LUAD肿瘤样本的miR-1205表达与APC2呈负相关关系。3.4 miR-1205及APC2的表达与肿瘤大小和TNM分期相关
根据miR-1205中位水平，我们将54名患者分为高表达组和低表达组，以探讨临床病理特征与miR-1205表达之间的相关性（图1A）。miR-1205的表达与肿瘤大小和TNM分期显著相关，而与性别、年龄、远处转移或淋巴结转移无关（表1）。APC2的表达也与肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期密切相关，而与性别、年龄和远处转移无明显差异（表1）。同时，miR1205低表达患者的预后优于高表达患者（图1B）。
图4 A. miR-1205的折叠变化(log2变化)，检测54对LUAD及邻近癌旁组织水平，按照miR-1205中位水平分为低表达组(27对)高表达组(27对)。B. LUAD患者之间的存活率高低分组。数据用均数±标准差表示。(**p<0.01;*** p<0.001)。.png)
表1. miR-1205、APC2表达相关性
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*表示p<0.05(卡方检验)。
4 讨论
NSCLC作为死亡率最高的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均呈上升趋势[20]。在我国，肺癌的死亡率已位于所有恶性肿瘤中的首位[21]。近年来，精准医学和靶向治疗已成为肺癌个体化治疗研究的热点[22]。大量研究表明，miRNA在肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭转移等方面具有重要作用[23]。且在治疗方面，miRNA也扮演着重要角色。在放疗方面，Sun等人[24] 通过11例晚期NSCLC患者Ⅱ～Ⅲ期接受局部放疗的血清miRNA表达图谱检测，发现可以通过高剂量和标准剂量治疗，有效的预测以后患者的总生存率。Shi等人[25]发现高表达miR-145、低表达miR-25以及miR-210的培美曲塞来维持治疗人群均具有较长的无进展生存期。在靶向药物治疗方面，Shen等人[26]发现miR-21可以作为吉非替尼治疗效果的预测因子，经过吉非替尼治疗可以降低miR-21的表达，从而使患者获得更长的总生存率。已经有文献表明，miR-197、miR-34NA家族以及miR-200家族在NSCLC细胞中与PD-L1均有一定相关性[27]。
有学者研究表示， miR-1205是PVT1区的一员，在Wnt/β-catenin通路中起作用，并证明了miR-1205调节APC2的表达[15]。在本次研究中，我们确定miR-1205在LUAD组织中的高表达，并且miR-1205低表达患者的预后优于高表达患者。据我们所知，这是首次发现miR-1205与LUAD肿瘤细胞增殖和预后相关的一项研究。
APC2在多种癌症中起抑癌作用。MiR-4326通过调节肺癌细胞中APC2的表达促进细胞增殖[28]。MiR-939通过抑制APC2的表达促进人卵巢癌细胞的增殖[29]。APC2与肺发育和肺肿瘤进展的多个方面密切相关[30]。在这项研究中我们发现APC2在LUAD组织和细胞中的低表达。
近年来，miRNA与目标mRNA的3′-UTR结合并导致mRNA的翻译抑制或降解已被广泛研究，这可能是研究miRNA对肿瘤影响的一个重要途径[31]。一些研究发现[32]miR-582-5p通过作用于MAP3K2基因在NSCLC中发挥抑癌作用，miRNA-758的高表达通过负调控HMGB基因抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭[33]。本实验中miR-1205与APC2存在着明显的负相关性，因此，我们猜测miR-1205可能通过作用于APC2的3'-UTR来降低蛋白表达。
5 结论
miR-1205在LUAD组织中高表达，可作为LUAD总生存率的独立预测因子。我们实验的结果显示miR-1205在LUAD中可以作为一种肿瘤促进因子，有可能作为LUAD的预后标志物和可能的治疗靶位点。关于miR-1205和APC2的作用关系，还需要进一步进行机制研究。
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论文作者:1马明哲,2通讯作者：王赞峰
论文发表刊物:《中国医学人文》2020年4期
论文发表时间:2020/4/15
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