合成多肽药物中三氟乙酸检测方法研论文_张莲莲 杜开峰

摘 要：三氟乙酸（TFA）是多肽药物的一项重要控制项目，目前报道较多的检测方法是离子色谱法（IC） 与高效液相色谱法（HPLC）。本文分别对 IC 及 HPLC 法进行研究：结果表明 IC 法 TFA 定量限为 2.4ng，推算检出限为 0.8ng，且在 0.12088μg/mL～6.044μg/mL 范围内呈良好的线性关系（r = 0.9999）；HPLC 法定量限为 6ng，检出限为 1.5ng，且在 0.3023μg/mL～15.115μg/mL 范围内呈良好的线性关系（r = 0.9998），加标回收率为 99.3%～101.7%，精密度（n=6）为 0.192%～0.200%，RSD5=1.4%。结论：IC 法与 HPLC 法相比，在灵敏度，线性及重复性等方面差异不大，均能满足准确检测相关多肽样品中 TFA 含量要求，但 HPLC 法适用范围更广，且能同时检测多肽药物中醋酸（HAC）及三氟醋酸（TFA）含量，达到简单易行、结果准确、灵敏度高、降低成本、提高效率的研究目的。关键词：离子色谱法，高效液相色谱法，多肽，三氟乙酸，含量检测中图分类号：文献标识码：AAbstract：Trifluoroacetic acid (TFA) is an important control item of polypeptide drugs. Ion chromatography (IC) and high performance liquid chromatography (HPLC) are commonly used in the detection of TFA. In this paper, IC and HPLC methods are studied respectively.The results showed that the quantitative limit of TFA by IC method was 2.4 ng, the detection limit was 0.8 ng, and the linear relationship was good in the range of 0.12088 ug/mL to6.044 ug/mL (r=0.9999);the quantitative limit of HPLC was 6 ng, the detection limit was 1.5 ng, and the linear relationship was good in the range of 0.3023 ug/mL to 15.115 ug/mL (r = 0.9998). The recovery was 99.3% ~ 101.7%, the precision (n = 6) was 0.192% ~ 0.200%, RSD5 = 1.4%.CONCLUSION: Compared with HPLC, IC method has little difference in sensitivity, linearity and repeatability, and can meet the requirement of accurate determination of TFA content in related polypeptide samples. However, HPLC method has a wider application range and can simultaneously detect the contents of HAC and TFA in polypeptide drugs.The HPLC method is simple, accurate, sensitive, low cost and efficient.Key words：Ion chromatography ;HPLC; Peptide ;Trifluoroacetic acid; Content determination 1前言三氟乙酸（TFA）普遍用于合成多肽的工艺中作为切割剂及脱保护剂，临床使用存在毒性。目前中国药典将其纳入需控制的溶残，归为四类溶剂，但对其控制限度尚无明确规定，通常按三类溶剂的限度 0.5%限定。多肽药物固相合成中，对于合成含有半胱氨酸、组氨酸、精氨酸等带侧链功能基的氨基酸的肽来说，为了避免由于侧链功能团 所带来的副反应，一般需要用适当的保护基 将侧链基团暂时保护起来。保护基的选择既 要保证侧链基团不参与形成酰胺的反应，又 要保证在肽合成过程中不受破坏，同时又要保证在最后肽链裂解时能被除去。因使用TFA 将肽链从树脂上切下的同时能对 R 侧 链的保护基进行脱保护，且不同侧链对应的不同保护基，基本都能用 TFA 进行去保护， 故目前几乎所有固相合成工艺均会在工艺中使用 TFA。同时由于 TFA 与多肽的结合很稳定，冻干或旋蒸步骤都无法将其完全去除，故需对固相工艺合成的多肽药物进行检测及控制。因此，TFA 含量测定是合成多肽药物的一项重要检测项目。对比已有文献中 TFA 不同的检测方法，根据品种实际情况来选择 合适的方法，达到简单易行、结果准确、灵 敏度高、降低成本的要求，是本次研究的主 要目的。2三氟乙酸检测方法概述TFA 检测方法，包括气相色谱法[1]、气 相色谱-质谱法[2]、高效液相色谱法[3-4]、毛细管电泳法[5]以及离子色谱法[6-9]等。总结相关资料，目前发表的文献中，较多采用的是离子色谱法及高效液相色谱法。从文献总结的研究结果来看，离子色谱法与高效液相色谱法均具有较高的灵敏度，线性，回收率， 重复性等也符合要求。故本次研究主要考察离子色谱法及高效液相色谱法。2.1离子色谱法概述相关文献中离子色谱检测法大同小异， 均采用采用离子色谱仪；使用阴离子交换柱以及离子抑制器；流速基本在 0.7mL/min～1.3mL/min 范围内（根据其不同品种特性选择）。各文献中最大的差异在于淋洗液的选择，淋洗液主要分为两种：一种是以氢氧化钠（NaOH）或氢氧化钾（KOH）水溶液溶液为淋洗液；另一种是以碳酸钠（Na2CO3）/ 碳酸氢钠（NaHCO3）混合溶液作为淋洗液进行检测。检测方法中，还考虑了淋洗液浓度及PH，流速，柱温等对检测结果的影响[10]。2.2高效液相色谱法概述高效液相色谱法均采用高效液相色谱仪，普通 C18 柱，流速均为 1.0mL/min，柱温 30℃～35℃，流动相均为 0. 07 %～0.08% 磷酸溶液-甲醇混合液。3IC 法与 HPLC 法对比研究3.1对 IC 研究仪器与试剂离 子 色 谱 仪 为 Metrohm883 Basic IC Plus（瑞士万通，配离子抑制器）；色谱柱为 Metrosep A Supp 5-250/4.0 阴离子分析柱（瑞士万通）；电子天平为 Analytical Balances ML204T/00 及 MS105（METTLERTOLEDO 公司）等。三氟乙酸钠：基准试剂，Sigma-Aldrich， 含量≥99.0%；氢氧化钠：AR，成都金ft化学试剂，含量≥96.0%。色谱条件淋洗液为 10mmol/l 氢氧化钠溶液；流速 0.7mL/min；进样量 20μl；柱温 30℃；色谱柱为 Metrosep A Supp 5-250/4.0 阴离子分析柱。方法研究在对该方法考察过程中，首先进行了淋洗液的对比，分别以 NaHCO3（1.0mmol/l）+ Na2CO3（3.2mmol/l）的混合溶液作为淋洗液（淋洗液 1）及以 10mmol/l 氢氧化钠溶液作为淋洗液（淋洗液 2），考察图谱情况。结果发现淋洗液 1 进行检测时，目标峰三氟乙酸出峰处有杂质峰干扰，且该杂质的出现无规律，导致目标峰无法准确积分；而使用淋洗液 2，目标峰处无干扰，且进行流速变化， 淋洗液浓度变化等考察发现，除目标峰保留时间有变化，其响应值及最终计结果基本一致。最终选择淋洗液 2 进行研究，并根据保留时间、色谱柱承受能力及系统压力选择适宜的浓度及流速。后进行检测限、定量限及线性考察，也均符合要求。考察数据见下表 1 及表 2： 表 1 TFA 定量限重复性考察（IC） Table 1 Repeatability of TFA quantitation limit (IC)重复性/针123456峰面积RSD%0.00570.00570.00570.7%0.00570.00570.0058表 2 TFA 线性考察（IC） Table 2TFA linearity (IC)TFA 浓度μg/mL0.120880.181320.377750.75551.5113.0226.044TFA 峰面积0.00570.00870.020.0390.0790.1680.329线性方程y = 0.0548x - 0.0013r = 0.9999 总结：因检测限无法根据信噪比准确计算， 故根据线性推算其能准确检测的最低浓度。根据结果可知离子色谱法检测 TFA，定量限 为 0.12088μg/mL ； 且 在 0.12088μg/mL ～6.044μg/mL 范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系，y = 0.0548x - 0.0013，r = 0.9999。 3.2高效液相色谱法研究仪器与试剂高效液相色谱仪为岛津 SPD-20AT；色谱 柱 为 Welch Ultimate AQ-C18, 250*4.6mm5um ； 电 子 天 平 为 Analytical Balances ML204T/00 及 MS105（METTLERTOLEDO 公司）, PH 计为 FE20（METTLERTOLEDO 公司）等。

期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆三氟乙酸钠：基准试剂，Sigma-Aldrich， 含量≥99.0%；磷酸：分析纯（AR），成都金ft化学试剂，含量≥85.0%；甲醇：色谱纯（HPLC），SK Chemical Sky Stltech，纯度≥99.99%；氢氧化钠：AR，成都金ft化学试剂，含量≥96.0%。色谱条件以磷酸溶液（在 1000mL 水中加磷酸 0.7mL，用 0.42%氢氧化钠溶液调节 pH 值至3.0)- 甲 醇 （ 95:5 ） 为 流 动 相 ； 流 速 为1.0mL/min；检测波长为 210mn，柱温为 30℃。方法研究各文献中高效液相色谱法基本一致。中国药典四部通则 0872 合成多肽中醋酸测定法，与文献中各方法也基本一致，且该方法可检出多肽样品中醋酸含量，若同时能将三氟乙酸准确检出，可使检验操作更简单，节省成本，提高效率。HPLC 方法研究中，先进行 TFA 定性考察，确定 TFA 保留时间为 5min（见下图 1）。且 HAC 峰与 TFA 峰分离度良好，TFA 出峰处无其他杂质及空白溶剂干扰，系统适用性良好。 图 1TFA 定位图2TFA 定量限重复性Fig. 1TFA positioningFig. 2Repeatability of TFA quantitation limit 检测限及定量限研究检测限：精密称取三氟乙酸钠对照品适量，用流动相溶解并稀释至 0.1511μg/mL， 进行测定，测得信噪比为 3。定量限：精密称取三氟乙酸钠对照品适 量，用流动相溶解并稀释至 1.0077μg/mL， 进行测定，测得信噪比为 13。对定量限进行重复性考察，记录色谱图（见上图 2），结果见下表 表 3TFA 定量限重复性考察（HPLC） Table 3 Repeatability of TFA quantitation limit (HPLC)线性考察取三氟乙酸对照品适量，精密称定，加流动相溶解并分别稀释制成 0.3、1.0、3.0、5.0、8.0、10.0、12.5、15.0 μg/ mL 的溶液，依次进样 20 μl，记录色谱图（见下图 3）。以峰面积(Y) 为纵坐标，浓度 (X, g/mL) 为横坐标，进行线性回归。回归方程：Y = 467.53x-26.4，r=0.9998（见下图 4），线性范围为 0.3023～15.115μg/mL。结果见下表 4： 表 4 TFA 线性考察（HPLC） Table 4 TFA linearity (HPLC)C（μg/mL）0.30231.00773.0235.0388.06110.07712.59615.115RT/min5.0935.0895.0865.0835.0815.0765.0755.071A线性方程15648113612480Y=467.53x-26.43673r=0.9998472759177028 图 3 TFA 线性图谱（HPLC） Fig. 3 TFA linear map (HPLC) 图 4 TFA 线性图及方程（HPLC） Fig.4 TFA linear graph and equation (HPLC) 回收率及精密度考察配制 0.5mg/mL 供试品溶液，含 TFA 约0.02%，即浓度为 1μg/mL。以 10μg/mL 为100%浓度，分别配制 80%，100%，120%浓度的对照品溶液各三份，分别称取供试品约50mg，共 9 份平行样，用配制的 80%，100%， 120% 浓 度的 对 照 品溶 液 溶解 并 稀释 至10mL（每个浓度 3 份），即得目标溶液。按要求进样，结果见下表 5。分别精密称取适量供试品 5 份，配制成0.5mg/mL 供试品溶液，按要求进样，考察样品精密度。结果见下表 6。 表 5TFA 回收率（HPLC） Table 5TFA recovery (HPLC)加标量对照浓度测得峰面积供试峰面积测得浓度回收率平均值（μg/mL）（μg/mL）42164428.129100.84%80%8.06142844818.190101.60%101.70%43334918.274102.64%526247410.297102.18%100%10.077513543510.110100.33%100.66%512746710.02399.46%625043912.48599.12%120%12.596630644912.58399.90%99.26%623944812.44298.78%表 6TFA 精密度考察（HPLC） Table 6TFA precision (HPLC)平行样样 1样 2样 3样 4样 5样 6TFA 峰面积445445484471418463TFA 含量%RSD%0.1960.1960.2001.4%0.1980.1920.197 4总结通过对比考察 IC 法与 HPLC 法对 TFA的检测，得出以下结论：（1）检出限及定量限对比：根据研究结果可计算出 IC 法的定量限为 2.4ng，推算检出限为 0.8ng 左右。HPLC 法的定量限为20ng（按 S/N 计算），检出限为 1.5ng（按S/N 计算）。但根据线性数据，可判断能准确检测的最低浓度为 0.3023ug/mL，即定量限为 6ng。总体来说，在灵敏度方面 IC 法与HPLC 法相差不大，均能满足目前几个多肽药物的检测要求。（2）适用范围对比：IC 法流动相体系一般使用水相系统，遇到难溶于水相的多肽 品种，则可能因溶解度问题导致检测不准确， 或必须增加样品前处理步骤（如萃取等）[11]，费时费力且无法完全保证准确度；而 HPLC 法无论水相系统或有机相系统均可用，对难 溶于水相系统的多肽药物来说更适用。从这 方面来看，HPLC 法适用范围更广。（3）简单易行，检测成本对比：目前大部分多肽品种，均需要控制 HAC 含量， 且一般用 HPLC 法进行控制。若 TFA 也采用 HPLC 法进行检测，则能同时检测出样品中 HAC 与 TFA 的含量，节约成本，提高效率。HPLC 法用来进行 HAC 检测，已通过方法学验证；该方法进行 TFA 检测，根据本文中定量限，检测限，回收率与重复性等考察结果可判定，适合于目前几种多肽药物的检测。HPLC 法适用范围更广，且能同时检测多肽药物中醋酸（HAC）及三氟醋酸（TFA）含量，达到简单易行、结果准确、灵敏度高、降低成本、提高效率的研究目的。参考文献[1]Thomas M． Cahill，Jody A． Benesch，Mae S． Gustin，et al． Simplified method for traceanalysis of trifluoroacetic acid in plant，soil，and water samples using headspace gas chromatography．AnalChem，1999，71: 4465[2]项徐伟,沈志群,郑刚,吴鹏.气相色谱-质谱法测定水体中三氟乙酸[J]. 理化检验 2010, （3）.[3]杨小明,赵冬梅.高效液相色谱法测定比伐卢 定中三氟乙酸含量[J]. 中国Th 化药物杂志Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2010 31（2）：126-127.[4]于伟,隽海龙.高效液相色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留[J]. 中国实用医药(China Prac Med), 2013, 8（36）：13-14.[5]Kanthi Hettiarachchi，Shane Ridge．Capillary electrophoretic determination of acetic acid andtrifluoroacetic acid in synthetic peptide samples. J Chromatogr A，1998，817( 1－2) : 153[6]Fang Wang，Greg W．Dicinoski，Yan Zhu，et al.Simultaneous determination of monofluoroacetate ， difluoroacetate and trifluoroacetate in environmental samples by ion chromatography．J Chromatogr A，2004， 1032( 1－2) : 31.[7]陈磊, 马明扬.合成多肽药物中三氟乙酸残留物分析[C]. 第十二届全国离子色谱学术报告会论文集.福建, 2008.11.5-8 ,375-377.[8]冯顺卿,李咏华.离子色谱法测定酒石酸长春瑞滨中三氟乙酸残留[J]. 药物分析杂志(Chin J Pharm Anal) 2013，33( 2):289-291.[9]郭兴辉,黄永丽.淋洗液在线发Th_离子色谱法测定塞来昔布中三氟乙酸残留[J]. 药物分析杂 志 (Chin J Pharm Anal)2014 ，34(6):1077-1079.[10]敖雪桔.离子色谱分析中淋洗液条件选择的探 讨 [J]. 黑 龙 江 环 境 通 报 (Heilongjiang Environmental Journal) 2009,33(3)33:27-29.[11]周长朋,王东武.离子色谱/直接电导法测定利格列汀药物中三氟乙酸残留[J]. 分析测试学报 2015,34(12):1425-1429.

论文作者:张莲莲 杜开峰

论文发表刊物:《药物与人》2018年8月

论文发表时间:2018/11/23

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