1.承德市中医院 河北承德 067000；
2.丰宁县第二医院 河北承德 067000
【摘 要】目的：了解医院环境监测细菌计数时直接表面接种和倾注法检测结果的差别，为准确做好院感环境检测提供简单、可靠的方法。方法：用兼性厌氧的大肠埃希菌、专性需氧的铜绿假单胞菌和物体表面常见细菌的菌液，以表面定量接种和倾注法做菌落计数。结果：培养皿表面定量接种培养约24小时后，大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌落生长都很典型检测结果为170和205。培养48小时数量没变化菌落略大。倾注法定量接种培养约24小时后，大肠埃希菌菌落生长典型的为13，不典型菌落158；培养48小时候变为52,119；铜绿假单胞菌菌落生长典型的为8，不典型菌落192；培养约48小时后，生长典型的为26，179。随机擦拭100cm2消毒前物体表面到5毫升生理盐水中，直接表面接种50ul培养24小时后测得细菌数量为15cfu/cm2，倾注法得到10cfu/cm2；48小时后分别为15cfu/cm2和 13cfu/cm2。结论：定量表面直接接种法更适合物体表面和各种液体标本中的细菌计数。
【关键词】环境监测；细菌；菌落计数
【中图分类号】R115 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）8-0442-02
为了提高医疗安全，医院环境细菌学监测内容越来越得到重视，其中消毒液染菌量、透析液中细菌含量及各类物体表面细菌数量监测是最常见的检测内容。这类监测一般采用琼脂倾注法[1]检测，在实际工作中发现倾注法检测结果偏低切菌落计数时菌落辨认常常比较困难。为此我们采用了琼脂表面直接接种法，结果收到良好效果。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆
1 材料
1.1 菌株 大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC25923
1.2 营养琼脂 杭州天和出品
2 方法
2.1 菌液配制 上述不同细菌的纯培养菌落配成0.5麦氏单位菌液，按细菌数量为每毫升108计算进行稀释，将细菌含量稀释到每毫升约5000后用于实验。
2.2 直接接种 每种细菌各取100ul、50ul、25ul、10ul分别接种配制好的营养琼脂表面，用接种环密涂后，送36℃；空气条件下培养。
2.3 倾注接种 每种细菌各取100ul、50ul、25ul、10ul分别加入无菌的90mm空皿中，将高压灭菌后冷却到约50℃的营养琼脂适量20-25ml倾入培养皿，按一个方向轻轻旋转使菌液和营养琼脂混合均匀，待琼脂凝固后送入培养箱培养。
2.4 菌落计数 培养约24小时取出平皿计数各自的菌落数，计数完毕立即送回培养箱继续培养隔夜后再计数一次。计数结果分易辨认和不易辨认分别计入。以没有菌落融合且可以分辨菌落较多平板作为计数用。
3 结果
培养皿表面定量接种培养约24小时后，大肠埃希菌和铜绿假单胞菌菌落生长都很典型检测结果为170和205。培养48小时数量没变化菌落直径略大。倾注法定量接种培养约24小时后，大肠埃希菌菌落生长典型的为13，不典型菌落158；培养48小时候变为52，119；铜绿假单胞菌菌落生长典型的为8，不典型菌落192；培养约48小时后，生长典型的为26，179。经统计学处理两种检测方法大肠埃希菌计数无显著性差别p>0.05；铜绿假单胞菌差别显著P<0.001。随机擦拭100cm2消毒前物体表面并转到5毫升生理盐水中，直接表面接种50ul培养24小时后测得细菌数量为15cfu/cm2，倾注法得到10cfu/cm2；48小时后分别为15cfu/cm2和 13cfu/cm2。两种方法存在显著性差别P<0.001。
4 讨论
细菌计数是细菌学检验经常遇到的常规工作【2，3，4，5】。细菌计数方法一般采用生长菌落计数法，生长菌落计数法中一般采用琼脂表面直接密涂接种和倾注接种法两种。密涂法接种优点是只要有制备好的培养基可随时立即接种，不仅方便还省时省力；缺点是接种的液体量不能过大，一般直径90mm平皿超过100ul液体标本，琼脂表面干燥变得困难。倾注法优点是液体标本接种量可以比较大，适合液体中细菌比较少的标本；缺点是培养基一般要现用现配不仅操作繁杂，温度控制也必须很严格才不至于把接种的细菌烫死和琼脂温度过低而无法和标本充分混均影响计数。
从本文结果看表面直接接种不仅菌落典型、操作方便、计数也很准确。理论上象铜绿假单胞菌这类的需氧菌倾注法计数应该低于直接表面接种，可能是通常琼脂厚度不算厚未有能明显阻止其生长。既然表面接种优点多，如何克服其接种量少和细菌不均匀成了主要问题。
物体表面细菌数要求最严格的一类环境为小于等于5cfu/cm2,采集100cm2面积，转入5毫升盐水或中和液中，如果接种50ul，细菌生长的数量为每平方厘米物体表面的细菌数。消毒液染菌量和这个差不多，也能满足需要。其实如果真的需要做更精密的计数可以通过离心沉淀浓缩后接种或增加采样面积或适当减少中和液体积即可。
表面接种相应手续简单，污染的风险小，选择的成品营养琼脂还可以通过无菌试验对培养基进行控制。倾注法由于必须实验前配制营养琼脂，配制出的琼脂是否无菌及空培养皿无菌状态都不容易被了解，因此相对直接接种存在较大的错误结果概率。
环境监测尤其是物体表面细菌常常是兼性厌氧菌和需氧菌，表面接种更有利于此类细菌生长。倾注法则使更多的细菌存在于相对大气的低氧环境，对通常的兼性厌氧菌生长都会引起生长不良的影响，对专性需氧菌影响就更大甚至不生长。
5 结论
定量表面直接接种法更适合物体表面和各种液体标本中的细菌计数。
参考文献：
[1]2012《医疗机构消毒技术规范》
[2]王冰，任伍爱. 未采用紫外线空气消毒的无菌室空气培养结果分析.中华医院感染学杂志2006，16（1）：95
[3]邓艳林，王珏琦，王丽莉.医院不同科室空气培养结果评估《中国保健》医学研究版2007，15（4）96
[4]郑燕红 层流净化空气的无菌物品存放室空气培养结果 中国消毒学杂志2008，25（2）：217
[5]郭容娣，钟伟平，黄榕水.医院空气培养调查与结果分析 国际医药卫生导报 2003,9（11）38
[6]贾俊英 ，杨晓.空气培养培养皿细菌超标的原因分析及预防措施.中国民康医学2011， 23（12）1571
基金项目：
河北省承德市科学技术研究与发展计划项目（编号20123137）
论文作者:韩静1,张景旭1,李岩2
论文发表刊物:《中医学报》2015年8月
论文发表时间:2015/12/10
标签：菌落论文; 细菌论文; 琼脂论文; 表面论文; 铜绿论文; 生长论文; 典型论文; 《中医学报》2015年8月论文;