刘建杰[1]2004年在《猪传染性胸膜肺炎新型基因工程类毒素菌苗的研究》文中提出猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，APP)引起的猪的一种高度接触传染性呼吸道疾病，给世界各地的养殖业造成了巨大的经济损失。该病急性以肺部广泛出血为特征，慢性以肺部局灶性坏死和胸膜炎由为特征。由Pattison等于1957年首次报道，目前遍及世界各地。免疫接种是预防和控制该病的主要措施，目前我国用于预防PCP的主要疫苗是灭活疫苗。这种灭活疫苗对于同种血清型的感染可降低死亡率，但不能降低发病率和慢性感染，不能阻止肿部病变，更不能对异型菌提供交叉保护，临床上迫切需要更加安全、有效的疫苗来预防和控制该病的发生与流行。通过对胸膜肺炎放线杆菌毒力因子的研究，证实分泌毒素为其最重要的毒力因子，同时也是其最重要的免疫原性因子，加有类毒素的灭活疫苗保护力大为提高。鉴于此，本研究开展了APP类毒素菌苗的研究，旨在提高灭活疫苗的保护效力。主要研究内容包括： 1．APP7型菌生长曲线的测定 通过对比国内外培养胸膜肺炎放线杆菌常用的叁种培养基，发现胰蛋白酶大豆汤(TSB)最有利于APP的培养。利用浊度测定和细菌计数对APP 7型菌在TSB中的生长周期进行测定，发现其在7h～10h进入稳定期，世代间隔约为30min。而且，APP 7型菌在TSB中的生长具有明显的对数生长期(1h-4h)，在对数生长期其浊度和活菌量具有对应关系，可用于APP的攻毒试验。 2．Apx Ⅰ结构基因在大肠杆菌中的高效表达 根据Apx Ⅰ的结构特点，我们构建了原核表达Apx Ⅰ的质粒pET-Ⅰ CA和pET-Ⅰ A，在IPTG诱导下两种质粒均获得高效表达，表达的融合蛋白分子量均为110kDa，主要以包涵体形式存在。其中质粒pET-Ⅰ CA表达的Apx Ⅰ具有很好的溶血活性，Western blot检测证实表达产物具有良好的反应原性。 3．Apx Ⅰ表达产物免疫原性的研究 将大肠杆菌中表达的包涵体进行纯化与复性，和等量弗氏不完全佐剂乳化后免疫小鼠，同时免疫的还有天然毒素作和不经过纯化与复性的粗提包涵体。用APP 10型10×LD_(50)进行攻毒的结果显示，经过复性的表达产物和粗提包涵体都具有良好的免疫原性，可以取代天然毒素作为疫苗的添加成分。 4．基因工程类毒素菌苗对小鼠的保护效力研究 利用Apx Ⅰ、Apx Ⅱ和Apx Ⅲ的表达产物和我国最为流行的7型菌，和等量弗氏不完全佐剂乳化后制成类毒素菌苗免疫小鼠。利用天然毒素建立叁种毒素的ELISA检测方法，对小鼠抗体的检测发现，二次免疫后叁种毒素的抗体效价均显着升高。用5×LD_(50)的1型菌和7型菌进行攻毒，免疫小鼠对1型菌的保护力为83.3华中农业大学博士学位论文%(10/l2)，对7型菌的保护力为91.7%(11/12)。小鼠攻毒结果初步显示类毒素菌苗对于同型菌和异型菌都有很好的的保护效果，显示了良好的应用前景。5.类毒素菌苗对仔猪的效力研究 利用Apxl、ApxH和Apxln的表达产物和我国最为流行的7型菌，混合后和油佐剂乳化制成类毒素菌苗，间隔叁周两次免疫断奶仔猪，同时设叁价细菌灭活苗组和空白对照组。利用EUSA检测叁种毒素的抗体，利用间接血凝检测7型菌抗体。二次免疫两周后用3.2xl夕cFu的APPI型进行气管攻毒。类毒素菌苗组具有较高的毒素抗体和间接血凝抗体，但叁价细菌灭活苗只有间接血凝抗体。类毒素菌苗组攻毒后基本没有表现出临床症状，剖检肺部病变轻微;叁价细菌灭活苗组攻毒后体温升高，剖检肺部病变明显;空白对照组临床症状明显，剖检呈现典型的胸膜肺炎病变。抗体检测和攻毒结果显示类毒素菌苗对于强毒APP的感染保护效果优于叁价细菌灭活苗，能显着降低临床发病，减轻肺部病变，可以取代细菌灭活苗用于胸膜肺炎的免疫预防。攻毒结果还显示毒素抗体和保护力呈正相关。
周锐, 陈焕春, 黄红亮, 徐晓娟, 刘建杰[2]2005年在《猪传染性胸膜肺炎的诊断与防治技术研究》文中指出猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的一种猪的呼吸道传染病,每年给世界养猪业造成严重的经济损失。由于APP血清型众多,各国和各地区流行的优势血清型不尽相同,各血清型之间缺乏交叉免疫保护力,因此,该病的诊断与防制比较困难。APP分子生物学研究的不断深入为特异、敏感的诊断技术和新型疫苗的开发奠定了基础。本文简要总结了我们在该病的病原检测、血清学诊断、区分疫苗免疫与野毒感染动物的鉴别诊断、常规灭活疫苗和基因工程疫苗等方面的研究结果和进展。
黄红亮, 周锐, 陈美玲, 刘建杰, 徐晓娟[3]2005年在《胸膜肺炎放线杆菌毒素apxIVA基因的克隆与表达及间接ELISA方法的建立》文中认为参照APP血清 1型apxIVA基因序列合成了一对特异性引物 ,从本实验室分离鉴定的胸膜肺炎放线杆菌 (APP)血清 2型中扩增了apxIVA基因 5′端 2 4 4 5bp的片段。将该片段克隆到原核表达载体pET_2 8b的T7启动子下游 ,与 6×HisTag融合 ,再转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,在IPTG的诱导下表达大小约 90kD的蛋白。表达产物以包涵体的形式存在 ,且能与APP标准阳性血清发生特异性反应。将包涵体变性和复性后包被酶标板建立了间接ELISA方法 (ApxIVA_ELISA) ,特异性良好。用ApxIVA_ELISA检测猪胸膜肺炎叁价 (1、2和 7型 )灭活菌苗和基因工程类毒素菌苗免疫猪血清抗体均为阴性 ,而 1、2、7型APP活菌感染动物的血清抗体均为阳性。实验证明 ,ApxIVA_ELISA不仅可以用于检测所有血清型APP的抗体 ,而且还可以用于APP自然感染猪和灭活菌苗免疫猪的鉴别诊断。
林艺远[4]2006年在《致猪水肿病大肠杆菌ELISA抗体检测方法及基因工程亚单位疫苗的初步研究》文中认为猪水肿病(Porcine Edema disease，ED)是仔猪常见的一种急性致死性传染病，主要由某些特定血清型产类志贺毒素大肠杆菌(Shiga-like toxin Escherichia coli，SLTEC)引起的肠毒血症。以胃大弯、肠系膜及脑部水肿为特征，常伴有共济失调、麻痹或惊厥等神经症状，主要发生于断奶仔猪。采食量大、生长快、体况健壮的猪最为常见。发病率通常为10％～35％，病死率可高达90％。猪群水肿病血清抗体的检测对预防和控制该病的爆发具有十分重要的意义。类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)是直接导致猪水肿病发生的主要毒力因子，其是由一分子A亚基和5分子的B亚基共同组成的聚合体。A亚基是该毒素的主要毒力亚单位，为毒素的酶活性部位，具有细胞毒性作用。B亚基没有毒性而具有免疫原性，是水肿病毒素的主要保护性抗原。本研究是针对SLT-Ⅱe的B亚基，初步建立一种特异、敏感、能对所有血清型猪水肿病大肠杆菌做出检测的血清学检测方法，为新型疫苗的研究奠定基础。 1．SLT-ⅡeB、SLT-Ⅱe3B基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 参照国外报道的Escherichia coli S1191菌株(M21534)，设计了两对特异性引物，以本地分离的猪水肿病大肠杆菌鄂E(Ee)株基因组为模板，PCR扩增出去掉信号肽和跨膜区的类志贺毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)B亚基的序列，再利用限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ将SLT-ⅡeB基因融和串联起来，筛选得到一个叁拷贝SLT-ⅡeB基因。将单拷贝和叁拷贝SLT-ⅡeB基因克隆到原核表达载体pGEX-KG，构建重组质粒pGEX-SLT-ⅡeB和pGEX-SLT-Ⅱe3B。序列测定证实，SLT-ⅡeB基因全长204bp，编码68个氨基酸，未发生任何碱基突变，与NCBI上所发表的12个SLT-ⅡeB序列：AY368993、AY332411、X81417、X81416、X81415、AJ567999、AJ567998、AJ298298、AJ249351、AB252836、M36727、M21534核苷酸同源性都是100％。SLT-Ⅱe3B基因全长630bp，编码210个氨基酸，与GenBank中M21534的序列同源性达到99.9％，只有第536处的点突变，由C变成T(C→T)，相应的氨基酸序列由脯氨酸突变为亮氨酸(P→L)。原核表达载体pGEX-SLT-ⅡeB、pGEX-SLT-Ⅱe3B转化E．coli BL21(DE3)，在IPTG诱导下获得表达，大小与预期结果相符。表达产物均以包涵体形式产生，通过提取包涵体——十二烷基肌氨酸钠变性——透析复性的生化提纯步骤来获取有生物学活性的重组蛋白。Western blot检测证实表达蛋白与猪水肿病标准阳性血清反应，具有良好的免疫学活性。同时用表达产物免疫SPF昆明系小鼠能够诱导产生较高水平的抗体，为亚单位疫苗的研究奠定基础。 2．猪水肿病SLT-Ⅱe3B-ELISA诊断方法的建立 将经纯化、变性、复性等处理后的GST-SLT-Ⅱe3B蛋白作为抗原，包被ELISA
翟瑞东[5]2014年在《胸膜肺炎放线杆菌自转运粘附素Apa1/Apa2基因敲除菌株的构建及其生物学特性研究》文中指出胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）在全世界范围广泛分布，给养猪业造成了巨大的经济损失，由于各个国家及地区流行的优势血清型不相同，且该病原菌已经发现的15个血清型表现非常大的致病性与免疫原性差异，灭活疫苗不同血清型之间的交叉保护能力很弱，至今仍没有能提供完全保护的疫苗上市，给该病的防治带来很大困难。近来在病原菌新发现一种非菌毛粘附素—叁聚体自转运粘附素（Trimericautotransporter adhesins，TAAs），该家族蛋白广泛介导细菌对宿主的粘附与侵袭，促使细菌逃避吞噬及补体杀灭等多种生物学功能，尤其是诸如VtaA，DrsA，NadA等重组的TAAs蛋白可以诱发机体产生特异性免疫应答，产生的抗体能够有效抑制病原体的感染，是潜在的疫苗研究方向。本课题组在前期研究中，发现毒力较强的APP血清5b型L20菌株含有一个叁聚体自转运粘附素基因（GenBank：ABN73547.1，命名为Apa1）并且发现该粘附素影响细菌的致病性。通过对APP5b型L20菌株的全基因序列（GenBank：CP000569.1）进一步分析，发现该菌同时含有另一个自转运粘附素基因（GenBank：ABN73212.1），命名为Apa2。采用SignalP3.0，SMART，daTAA，Predicting Antigenic Peptides等软件对Apa2蛋白的结构与功能进行系统的生物信息学分析，预测Apa2为叁聚体自转运粘附素家族成员，并将Apa2蛋白N端的162-485aa及656-1070aa的YadA-like head样粘附基序分别命名为Apa2H1，Apa2H2，C末端3045-3154aa的YadA-like-C样锚定部基序命名为Apa2C。采用DNA重组技术原核表达Apa2H1基序，Apa2H2基序及Apa2C基序，分别获得His-Apa2H1重组蛋白，His-Apa2H2重组蛋白，HAT-Apa2C重组蛋白，同时运用正负向筛选标记的两步单交换同源重组方法构建了野生菌株的Apa1/Apa2双基因敲除菌株，即△Apa1/△Apa2菌株，比较△Apa1/△Apa2菌株与野生菌株在体外、体内的生物学特性差异，深入研究TAAs对APP血清5b型L20菌株生物学功能的影响，尤其是TAAs介导的细菌毒力变化。研究发现，His-Apa2H1重组蛋白粘附活性不强，但是对APP5b的保护率为70%，His-Apa2H2重组蛋白可以有效抑制APP5b对RAW264.7细胞和CRL2845细胞的粘附，并且具有良好的免疫原性，对APP5b的保护率为80%，具有成为潜在的疫苗成分的研究价值。HAT-ApaC重组蛋白以叁聚化的形式存在，证明Apa2为叁聚体自转运粘附素，ApaC区是转运区域。△Apa1/△Apa2菌株相对于野生菌株，体外培养条件下，菌体表面粗糙，细菌壁上有絮状物沉积，生物被膜形成能力降低，自凝能力下降，粘附与侵袭RAW264.7细胞及CRL2845细胞能力降低。动物实验时，本研究成功构建了APP经鼻腔接种进入呼吸道而感染小鼠的模型，采用腹腔接种与鼻腔接种两种方式感染小鼠评价△Apa1/△Apa2菌株的毒力，证实腹腔接种方式下，△Apa1/△Apa2菌株的LD850为2.93×10CFU，鼻腔接种方式下为8.36×107CFU，均高于野生菌株，此外，尽管采用同一接种方式下的相同感染剂量，不同菌株表现出相似的临床症状及肺组织病理学变化，但是△Apa1/△Apa2菌株在小鼠肺脏、脾脏的定殖能力弱于野生菌株。本研究明确了Apa2蛋白的粘附功能域及锚定区的生物学特性，证实Apa1和Apa2是细菌形态、自凝、被膜形成、粘附与侵袭及体内定殖不可缺少的结构。为进一步研究TAAs介导的APP感染机制及预防APP感染提供一种新的研究思路。
汤细彪[6]2010年在《猪源多杀性巴氏杆菌的分子流行病学与致病性研究》文中研究表明多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一种重要的病原菌,对多种动物和人均有致病性,可引起猪发生肺炎和萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis,AR),也是猪呼吸道疾病综合征(porcine respiratory disease complex,PRDC)的重要致病因子之一。Pm现已流行于世界养猪业发达的各个国家和地区,该病原菌可与多种病原协同感染,从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和死亡率,并造成严重的经济损失。本研究对Pm的病原流行病学、分离菌株的生物学特性、分子多样性、耐药现状、毒力和免疫原性基因进行研究,为我国Pm的流行病学研究提供理论依据,为临床上猪巴氏杆菌病的诊断、有效防控和相关的基础研究奠定基础。主要研究内容如下：1.多杀性巴氏杆菌在我国部分地区猪群中的流行现状2003-2007年对我国部分地区规模化猪场健康猪群和有肺炎与萎缩性鼻炎疑似症状猪的临床样品进行检测,结果从湖北等16个省、市、自治区2,912份有发病症兆猪的鼻拭子、肺脏、胸腔积液、心血和颈部水肿组织中分离出233株Pm,未能从725份健康猪棉拭子中分离出Pm。在我国猪群中,2003-2007年间Pm的总分离率为8.0%；不同年份Pm的总分离率介于6.4-10.2%之间。应用PCR方法对分离的Pm进行荚膜分型,结果证实,分离株中有92株(39.5%)属A型Pm,128株(54.9%)属D型Pm,1株(0.4%)属B型Pm,12株(5.2%)为未定型分离株。同时对分离的49株Pm进行致病性试验,结果高致病株、中致病株和低致病株分别占受试菌的36.7%(18/49)、49.0%(24/49)和14.3%(7/49)；对分离Pm的产毒素能力进行鉴定,结果11株产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenic Pasteurella,multocida,T+Pm)均为高致病菌株,占61.1%(11/18)。2.猪源多杀性巴氏杆菌耐药表型与基因型的研究对分离的233株Pm菌株进行20种临床常用抗生素的最小抑菌浓度(MICs)试验,结果表明,分离菌株对阿莫西林、林可霉素、克林霉素、四环素和磺胺类药物不敏感,对大观霉素、卡那霉素、庆大霉素和阿米卡星等氨基糖苷类药物中度敏感；而头孢菌素类、氟苯尼考和氟喹诺酮类药物对Pm分离株表现出很高的活性,能有效抑制该类菌群。多重耐药性分析表明,有217株(93.1%)Pm具有多重耐药性；5耐以上的菌株有127株,占54.7%；流行最广的Pm耐药表型为：AMX+LIN+CLI+ TET+SDM+STX。18种耐药基因的PCR检测证实：耐阿莫西林Pm携带blaTEM的阳性率为80.7%；耐林可酰胺类药物Pm携带ermA、ermC和lnuA的阳性率分别为36.7%、49.8%和24.0%；耐甲氧苄啶类Pm携带dfrA5、dfrA7和dfrA13的阳性率分别为18.5%、32.9%和29.5%；而四环素抗性主要由tet(H)、tet(B)和tet(G)介导；磺胺类抗性主要由sull和sul2介导。分析耐药表型与基因型关系表明,同一种抗生素可由不同的耐药基因介导,多数菌株携带有不同的耐药基因,并显着的具有多重耐药性(P<0.01)。3.猪源多杀性巴氏杆菌的毒力基因型与分布特征研究对Pm的19种毒力相关基因进行PCR检测,结果证实,粘附因子ptfA(93.6%)、fimA(99.1%)、hsf-2(99.1%),转铁蛋白exbB(99.1%)、exbD(99.1%).tonB(97.9%)、hgbA(96.6%)、fur(92.7%),唾液酸酶nanH97.0%)和外膜蛋白ompA(100%). ompH(93.1%)、oma87(94.4%).plpB(99.1%)的流行与检出率较高,几乎所有的猪源Pm均携带这些毒力因子；而毒力因子pfha,tadD,toxA和pmHAS在猪源Pm菌株中的检出率均低于50%。不同的毒力因子与荚膜血清型具有一定的相关性,如tadD显着的分布于A型Pm(P<0.001)；hsf-1和nanB显着的分布于D型Pm(P<0.001)；hgbA和fur主要分布于A型和D型Pm(P<0.01)；pfha和pmHAS显着的分布于A型和未定型Pm(P<0.001)；且试验中不同地区分离的11株T+Pm的毒素toxA基因也仅分布于D型。4.猪源多杀性巴氏杆菌分离株的分子多样性研究采用RAPD,(GTG)5-PCR和Eric-PCR分析方法,对从我国不同地区分离的233株猪源Pm进行核酸分子分型和多样性分析。DNA指纹谱型表明RAPD方法的分辨率为39.48%,多态性条带的百分率为73.96%,可将受试的Pm分为92个基因型,其中有11个(比例为12.0%)为优势谱型。在相似系数为60%时,Pm分离株可被分为32个簇,其中最大的1簇含有A型Pm 20株,D型Pm 22株,B型和未定型Pm各1株,且遗传背景相关的16株海南省分离菌聚集在该簇;11株T+Pm也聚集在该簇。(GTG)5-PCR的分辨率为49.36%,多态性条带的百分率为88.13%,可将受试的Pm分为115个基因型,其中优势谱型有7个(比例为6.08%)。在相似系数为60%时,Pm分离株可被分为68个簇。Eric-PCR指纹分析方法的分辨率为24.46%,多态性条带的百分率为73.46%,可将受试的Pm分为57个基因型,其中优势谱型有11个(比例为19.03%)。在相似系数为60%时,Pm分离株可被分为36个簇。综上分析表明,我国不同地区分离的猪源Pm的核酸基因组存在显着的多样性,同时证明了(GTG)5-PCR和RAPD扩增的DNA指纹比Eric-PCR图谱具有更强的多样性。5.猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因的分子特征与致病性研究为分析我国产毒多杀性巴氏杆菌T+Pm地方分离株的分子特征、遗传背景及毒力特性,对分离的11株T+Pm的毒素toxA基因进行了克隆和测序。结果表明,toxA基因编码的毒素PMT是一个高度保守的蛋白,其核苷酸间的同源性达99%以上,其氨基酸的同源性达98.5%以上,且该基因在911-912和2323-2324核苷酸位点发生点突变的频率较高,达到23.8%(5/21)。对toxA基因的分子进化树分析表明,我国地方T+Pm分离株可分为2个亚群,且菌株间的亲缘关系或遗传背景较近,表现出区域相关性,与韩国、台湾、美国等分离株同属一个进化分支。对小鼠的LD5o试验证实,T+Pm对小鼠具有高致病性,且分离株HN-13表现为强毒力,其对小鼠的LDso为4.25×103CFU。将HN-13株人工感染试验猪,建立T+Pm的感染模型,结果HN-13不但可复制出PAR的临床症状,且该菌株可引起猪肺炎。免疫组织化学分析证实,HN-13株感染猪的急性期,机体中大量的嗜中性白细胞发生局部聚集,以抵抗病原菌的侵入,在肺泡内同时也出现了巨噬细胞吞噬感染的T+Pm,并造成巨噬细胞的坏死和髓样病变。6.毒素PMT的N-端和C-端蛋白的生物学活性及免疫原性研究将5个toxA基因片段N1518、C2345、N3172、N3388和C2115分别克隆到合适的原核表达载体pET-28a(b,c)系统,其中pET28a-N1518和pET28b-C2115在大肠杆菌成功表达,获得大小分别为57kDa和78kDa的融合蛋白rPMT-N和rPMT-C,Western blot检测证实这两种表达产物均具有反应原性。分别以200μg rPMT-N和rPMT-C对小白鼠进行体内生物学活性试验,结果两种表达蛋白均不能致死小白鼠；体外细胞毒性试验证实896ng/ml的rPMT-N能使Vero细胞发生病变,而rPMT-C对Vero细胞无明显毒性作用。将rPMT-N和rPMT-C制成亚单位疫苗,同时设天然PMT及无菌PBS对照组,间隔2周分2次免疫小白鼠和仔猪。结果表明rPMT-N、rPMT和天然PMT试验组能诱导小鼠产生较高滴度的毒素抗体,而rPMT-C诱导的毒素抗体滴度较低；对仔猪免疫效力试验证实,rPMT-N、rPMT、rPMT-C和天然PMT均能诱导机体产生针对PMT的毒素抗体,但用1×1010CFU的HN-13株对各组试验仔猪进行鼻腔感染试验后,rPMT-C提供的保护力较rPMT-N、rPMT和天然PMT组低。综上试验表明,rPMT-N具有良好的生物学活性和免疫原性,可作为PAR疫苗添加成分,显示了良好的应用前景。
参考文献：
[1]. 猪传染性胸膜肺炎新型基因工程类毒素菌苗的研究[D]. 刘建杰. 华中农业大学. 2004
[2]. 猪传染性胸膜肺炎的诊断与防治技术研究[C]. 周锐, 陈焕春, 黄红亮, 徐晓娟, 刘建杰. 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集. 2005
[3]. 胸膜肺炎放线杆菌毒素apxIVA基因的克隆与表达及间接ELISA方法的建立[J]. 黄红亮, 周锐, 陈美玲, 刘建杰, 徐晓娟. 生物工程学报. 2005
[4]. 致猪水肿病大肠杆菌ELISA抗体检测方法及基因工程亚单位疫苗的初步研究[D]. 林艺远. 华中农业大学. 2006
[5]. 胸膜肺炎放线杆菌自转运粘附素Apa1/Apa2基因敲除菌株的构建及其生物学特性研究[D]. 翟瑞东. 吉林大学. 2014
[6]. 猪源多杀性巴氏杆菌的分子流行病学与致病性研究[D]. 汤细彪. 华中农业大学. 2010
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