（沈阳药科大学 辽宁 沈阳 110016）
【摘要】目的：将病毒滴度不同的狂犬病毒PV-2061株接种Vero细胞，收获连续传代培养的病毒液后脑内注射小鼠，通过小鼠的死亡情况确定细胞传代培养法对于该病毒的检测限度。方法：先采用小鼠脑内接种法测定狂犬病毒的病毒滴度，然后将10倍系列稀释的狂犬病毒接种Vero细胞，在细胞上连续传代3次后收获细胞培养物并脑内注射小鼠，观察小鼠的死亡情况。结果：小鼠脑内接种法检测狂犬病毒的病毒滴度为7.0lgLD50/ml，且不高于1LD50/ml的病毒无法致小鼠死亡。细胞传代培养法检测狂犬病毒的结果为：0.1LD50/ml的狂犬病毒检出率为5%～10%，0.01LD50/ml的狂犬病毒无法检出。结论：细胞传代培养法检测狂犬病毒PV-2061株的检测限度约为0.1LD50/ml，且灵敏度远高于小鼠脑内接种法。
【关键词】狂犬病毒PV-2061株；病毒滴度；细胞传代培养；检测限度；Vero细胞
【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）28-0095-02
Study on Cell subculture method to detect the rabies virus PV-2061 strain limit
Yao Yu,Zhang Jinghai,Li He,Xie Hua.
Shenyang Pharmaceutical University 110016,China
【Abstract】Objective The PV-2061 strain of rabies virus with different virus titers were inoculated into Vero cells. Continuous subculture virus solution were received and intracerebrally injected into mice. Detection limit of cell subculture method for Rabies virus was determined by dealth of mice. Methods The rabies virus titer was first determined by mouse intracerebral inoculation method. Then 10-fold dilution of the rabies virus was inoculated into Vero cells which were cultured and passaged three times. The cell cultures were harvested and inoculated into mice by intracerebral injection. Death of mice was observed. Results The rabies virus titer was 7.0 lgLD50/ml by mouse intracerebral inoculation method and the rabies virus was no higher than 0.1LD50/ml could not kill the mice. As the results of detection for rabies virus by cell subculture method: 5%～10% of the rabies virus was 0.1LD50/ml could be detected, the rabies virus was 0.01LD50/ml could not be detected. Conclusion The minimum detection limit of rabies virus is about 0.1LD50/ml by cell subculture method and the sensitivity is much higher than mice intracerebral inoculation method.
【Key words】Rabies virus PV-2061 strain;Virus titer;Cells passage culture;Detection limit;Vero cell
狂犬病毒属于弹状病毒科的狂犬病毒属，外形为子弹状，表面有包膜，内含单链RNA，是引起狂犬病的病原体，本文中所研究的狂犬病毒PV-2061株(以下均简称PV株)是Louis Pasteur固定毒株的Vero细胞适应株[1]。《中华人民共和国药典》三部（2015版）中的狂犬病毒灭活验证试验[2]即细胞传代培养法用于检测残留的狂犬病毒，但并未提及该检测方法的灵敏度和适用范围，本实验通过细胞传代培养法研究PV株的检测限度。
1.材料与方法
1.1 主要材料
狂犬病毒PV-2061株，原始毒株来源于ATCC。
145～149代Vero细胞，原始细胞来源于中国食品药品检定研究院细胞室。
昆明系SPF级小鼠，雄性，体重11～13g。
含10%新生牛血清的MEM细胞培养液。
1.2 主要设备
生物安全柜；二氧化碳培养箱；超低温冰箱；显微镜；移液器；混悬器。
1.3 病毒滴定
用细胞培养液将PV株进行10倍系列稀释，选择10-4～10-7连续4个稀释度的病毒液脑内注射10小鼠，0.03mL/只，逐日观察14天，以第4天后呈现典型狂犬病脑症状或死亡的小鼠进行计数，采用Reed-Muench法计算病毒滴度（lgLD50/ml）。
1.4 细胞培养
Vero细胞消化后于显微镜下计数，加入适量细胞培养液将细胞浓度调整为约105个/ml，每个75cm2的细胞瓶中接种30mL，然后置37℃，5%CO2条件下培养3～5天至长满单层备用。
1.5 病毒接种及细胞传代培养
用细胞培养液对PV株进行10倍系列稀释，将10-5～10-9共5个稀释度的病毒液各30ml分别接种至已长满单层Vero细胞的细胞瓶中，37℃，5%CO2条件下吸附60分钟，弃去瓶内液体后加10ml细胞培养液，置二氧化碳培养箱里培养作为第一代细胞；第一代细胞培养7天后置-70℃超低温冰箱中冻融，然后将冻融物全部接种于另一瓶已长满单层的Vero细胞上，同时补加20ml细胞培养液，吸附60分钟后弃去瓶内液体，补加10ml细胞培养液，置二氧化碳培养箱里培养作为第二代细胞；将培养7天的第二代细胞按上述操作进行冻融、接种、吸附、培养后作为第三代细胞；将第三代细胞培养7天后冻融后进行动物实验。同时取一份不加入病毒的细胞进行上述相同的操作，作为空白对照。
1.6 动物实验
将第三代细胞冻融后的培养物接种20只小鼠，每只脑内接种0.03ml，逐日观察14天，前3天内死亡的小鼠不计，观察接种后小鼠的发病及死亡情况。
2.结果
2.1 病毒滴度结果
PV株的病毒滴度结果见表1，3名实验人员共9组实验的平均值为7.0lgLD50/ml。
小鼠的死亡情况：稀释度为10-4的死亡率是100%，10-5的死亡率是50%～100%，10-6的死亡率是10%～40%，10-7和10-8的死亡率是0%。不高于1LD50/ml的病毒无法致小鼠死亡。
3.讨论
本实验对细胞传代培养法检测PV-2061株的检测限提供了科学依据，对研究其它狂犬病毒株在Vero细胞上的检测限度也有一定的指导意义，国内PV株、aG株、CTN-1株等生产用狂犬病毒存在的情况下[3]，采用本方法的检测限度可能并不完全相同。实验过程中采用多人实验的方式以为减少实验误差，检测结果具有一定的准确性和稳定性，但检验周期过长会对企业的大规模连续生产有着不利影响，所以能够替代动物实验[4]、实验周期更短、灵敏度更高的检测狂犬病毒的方法仍需要进一步研究和开发，更加快捷、准确、成熟的PCR检测法是未来狂犬病毒检测的发展方向[5]。
【参考文献】
[1] WHO.Report of a WHO consultation on transfer of technology for production of rabies vaccine[R]VP/87.7/Rev.l. Geneva,1987.
[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].三部.北京:化学工业出版社，2015:各论146-147.
[3] Wang XJ,Lang J,Tao XR, et al.Immunogenicity and safety of purified Vero)-cell rabies vaccine in severely rabies-exposed patients in china[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health,2000,31(2):287-294.
[4] Grune Barbara,Fallon Michael,Howard Carol.Report and recommendations of the international workshop"Retrieval approaches for information on alternative methods to animal experiments".ALTEX Alternatives to Animal Experimentation, 2004, Vol.21(3),pp.115-27.
[5] Sacramento D,Bourhy H,Tordo N.PCR technique as an alternative method for diagnosis and molecular epidemiology of rabies virus.Molecular and cellular probes,1991,Vol.5(3), pp.229-40.
论文作者:姚宇,张景海,李鹤,谢花
论文发表刊物:《医药前沿》2017年10月第28期
论文发表时间:2017/10/24
标签：细胞论文; 病毒论文; 狂犬论文; 小鼠论文; 培养液论文; 限度论文; 死亡率论文; 《医药前沿》2017年10月第28期论文;