智星[1]2004年在《大鼠肝移植急性排斥模型的建立及CTLA4-Ig抗排斥和诱导免疫耐受的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:建立稳定的大鼠肝移植急性排斥反应模型,探讨CTLA4-Ig抗排斥反应和诱导免疫耐受的作用。 方法:采用“二袖套管法”,通过建立Wistar→Wistar大鼠肝移植模型熟练建立大鼠肝移植模型的技能。继而对照研究Wistar→SD、SD→Wistar、Wistar→Wistar配对组合的肝移植后排斥反应,选取排斥反应强烈、稳定的组合建立排斥反应模型,于术后第2天腹腔内注射CTLA4-Ig,与未给药的相同组合的排斥反应模型鼠对照研究,观察术后7天各组症状体征、肝功能变化、移植肝病理特征、细胞因子等的变化,以及术后4月用药组的上述情况,判断CTLA4-Ig抗排斥及诱导免疫耐受的作用。 结果:(1)Wistar→SD肝移植后大多于6～16天内相继因排斥反应死亡,SD→Wistar肝移植术后生存期较Wistar→SD稍长,而Wistar→Wistar可长期存活,几乎无排斥反应。(2)Wistar→SD肝移植模型鼠,用CTLA4-Ig后,于术后7天观察,无明显排斥反应表现,移植肝病理特征无明显排斥反应征象,血清细胞因子TNF-α、IL-4、IL-10表达不升高。(3)长期观察用药组Wistar→SD肝移植后大鼠,可长期存活,取肝作病理检查,无急性、慢性排斥反应征象,血清TNF-α、IL-4、IL-10浓度正常。 结论:(1)Wistar→SD肝移植模型具有强烈、稳定的急性排斥反应特征,可用于相关研究。(2)CTLA4-Ig在大鼠肝移植急性排斥反应模型中使用,有抗排斥反应的作用。(3)CTLA4-Ig在大鼠肝移植急性排斥模型中使用,有诱导免疫耐受的功能现象。(4)血清TNF-α、IL-4、IL-10浓度作为观察大鼠肝移植后排斥反应的指标,有一定的参考价值。
孙培龙[2]2013年在《携带HLA-G慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究》文中指出目的：人类白细胞抗原G(HLA-G)因为在母体胎儿之间的免疫耐受中发挥了关键性作用而被注意,提示它可能应用于器官移植。HLA-G在体外诱导表达已被证实有诱导免疫耐受的特性,移植术后患者体内HLA-G的表达已被证实与移植术后急性和慢性排斥反应发生率降低有关。我们使用转染携带人HLA-G基因的慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及大鼠移植肝脏,在体外及在体条件下探讨HLA-G的表达是否有直接保护移植肝脏免受排斥反应损伤的效果。方法：1、取260只健康雄性SD大鼠,分叁个阶段进行,先建立大鼠原位肝移植模型的手术训练和探索。手术熟练后,取40只SD大鼠和40只Wistar大鼠,建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、建立携带HLA-G的慢病毒表达体系。3、进行SD大鼠肝细胞原代培养。4、将携带人HLA-G的慢病毒转染SD大鼠原代培养肝细胞,转染后7天,通过免疫荧光、RT-PCR和Western Blot实验进行检测,分别从病毒转染、mRNA水平和蛋白水平全面评价HLA-G慢病毒转染的效果。5、采用kamada二套管法建立SD和Wistar大鼠的原位肝移植模型45例,随机分为叁组,每组15例。实验组在SD大鼠的供体肝脏取下后,从门静脉输注2ml包含有107TU/ml携带HLA-G基因的慢病毒,将携带人HLA-G的慢病毒转染大鼠供肝,与不加任何处理的对照组和术后规律使用FK506的对照组进行对比,对比术后叁组肝组织中的HLA-G的表达水平、术后第7天、第14天和第56天的AST和BIL值以及病理切片、术后生存天数。探讨携带HLA-G基因的慢病毒转染供肝,是否可对抗大鼠急性肝移植排斥反应。结果：1、经训练,成功建立SD至Wistar大鼠肝移植急性移植排斥反应模型。2、携带人HLA-G的慢病毒可成功转染SD大鼠原代培养肝细胞。3、转染携带有HLA-G'慢病毒的实验组术后7天大鼠的AST和BIL值,与术后使用FK506的对照组差别有显着性(P<0.05),与术后不加处理的对照组差别有极显着性(P<0.01)。转染携带有HLA-G慢病毒的实验组术后12天、56天大鼠的AST和BIL值,与术后使用FK506的对照组差别有显着性(P<0.01)；转染携带有HLA-G的实验组的AST和BIL值,与术后不加处理的对照组差别有极显着性(P<0.01)。对照组中位生存时间12.00天,FK506组中位生存时间70.50天,HLA-G组中位生存时间91.50天,各组之间差别有显着性(P<0.01)。提示这种治疗可延长受体大鼠的存活期。病理切片结果显示,转染携带有HLA-G慢病毒的实验组和术后使用FK506的阳性对照组,术后7天病理切片仅有轻度排斥反应,而术后不加任何处理的阴性对照组则显示为重度排斥反应。术后56天,FK506组病理切片显示存在轻度排斥反应,而HLA-G组无排斥反应。结论：1、转染携带有HLA-G慢病毒作为治疗性的手段用于大鼠肝移植急性排斥反应模型,能有效保护大鼠移植肝的功能和延长存活期。2、体外实验及动物实验均表明,肝细胞对慢病毒介导的基因转移易感,表明慢病毒对肝细胞有很高的转导效率,且转入的外源基因可长期表达。图16幅,表9个,参考文献316篇
祝哲诚[3]2003年在《免疫抑制剂联合供体骨髓输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究》文中进行了进一步梳理FK506、MMF、anti-CD28mAb联合供体骨髓输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究研究背景目前，器官移植已经成为临床治疗终末期疾病的有效和常规措施。然而，尽管由于外科技术的标准化、免疫抑制剂的不断研发和应用，在过去20年间，移植物的长期存活率仍未明显提高。免疫抑制剂的成功应用，有效地抑制了急性排斥反应，但不能有效地控制可导致移植物失功的慢性排斥反应的发生。而且，免疫抑制剂的长时间应用，不可避免地产生感染、肿瘤等并发症。因此，意味着移植物可长期存活的免疫耐受的诱导，成为移植学家和免疫学家所追求的目标。在啮齿类动物，已有许多可行的策略成功诱导出血管化移植物的长期存活。但应用这些策略过渡到临床，由于在大动物模型中得不到相同的结果，却受到了限制。回顾近年来这一领域的研究成果，多集中在拟通过建立供受体细胞的混合性嵌合状态，来诱导移植物的免疫耐受，尤其是通过新型的、无明显毒副作用的建立混合性嵌合的处理方案。本研究正是基于以上观点，试图建立一种无明显毒副作用、非骨髓抑制的处理方案，通过建立大鼠肝移植模型，采用以FK506、MMF、anti-CD28mAb为主并联合供者骨髓输注的处理措施，来诱导大鼠肝移植免疫耐受。同时，进一步分析其诱导长期存活的可能机制，包括移植物和外周血中细胞因子的表达、细胞凋亡的发生在免疫耐受诱导中的可能作用等。本部分研究的具体内容总结如下：第一部分目的：利用套管技术建立稳定的大鼠原位肝移植动物模型，模型的建立是本项研究的基础。方法：采用“二袖套法”完成200例次大鼠原位肝移植模型，同时结合自己的体会，对“二袖套法”进行适当改进，包括套管的制作、受体的麻醉、腹主动脉的灌注以及肝上、肝下下腔静脉、门静脉等血管的吻合。结果：肝上下腔静脉的吻合时间为10～15分钟，无肝期为12～18分钟，一周生存率可达75％以上。术后常见的并发症为出血、血栓形成、感染以及胆道梗阻。结论：技术的改进增加了生存率，包括供肝腹主动脉灌注，在供肝的质量上明显优于单纯门静脉灌注。另外，减少供肝的机械性损伤、避免套管的扭曲、提高血管的吻合质量以及缩短无肝期，都是减少术后并发症和提高移植物存活的关键。
林拥华[4]2010年在《术后腹腔细菌感染对原位肝移植大鼠细胞免疫功能的影响及胸腺肽α1的作用》文中指出肝移植已成为治疗终末期肝病最有效的手段,然而,感染仍是肝移植术后严重影响受体生存率和移植物存活率的主要并发症之一。由于受体术前基础疾病的严重性以及肝移植手术的特殊性,术后感染表现为病原菌种类复杂、病情凶险、死亡率极高。并且,感染与移植后排斥反应关系密切,病毒感染已被证实可促进移植后排斥反应的发生,而细菌感染与术后排斥反应的关系目前尚未完全清楚。重症感染时,机体免疫系统功能受到抑制,T细胞亚群比例失调、功能受损,呈现一种“免疫麻痹”现象,这一概念已得到越来越多证据的支持。在众多因素中,DCs的表达变化引起了广泛观注,它可通过异质性改变,影响效应性T细胞的活化,发挥免疫抑制效应。相对于此,免疫调理对脓毒症的治疗作用也越来越明确。但是,由于担心诱发排斥反应的发生,器官移植术后感染免疫调理治疗仍有争议。本研究采用大肠杆菌诱导近交系大鼠肝移植术后腹腔感染,在此基础上,给予胸腺肽α1免疫调理治疗,通过检测受体细胞免疫功能的变化,从而为临床治疗提供一定的基础理论依据。目的建立近郊系大鼠原位肝移植术后腹腔细菌感染模型,研究细菌感染对移植肝急性排斥反应的影响,进而研究其对受体T细胞免疫功能的影响及脾脏DCs的增殖情况和其生物学效应,并探讨胸腺肽α1对其的免疫调理作用。方法1.建立封闭群大鼠原位全肝移植模型:以Kamada经典二袖套法为基础,采用快速切取供肝,一针法连续缝合肝上下腔静脉,进行120例大鼠原位肝移植,观察各手术步骤操作时间、术后并发症及术后生存期。2.建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型:分3种移植组合:SD→SD组(同基因对照组),SD→Wistar组及DA→Lewis组,每组32例。分别于术后3、5、7、10天各随机处死4只,观察外周血肝功能变化(ALT和TBIL)与肝脏病理改变,将余大鼠留作生存分析。3.建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型并留置腹腔导管,于术后3天、5天两个时间点灌注ATCC25922大肠杆菌活菌,每个时间点分为5个感染组:2×108cfu/ml、2×107cfu/ml、5×106cfu/ml、1×106cfu/ml、5×105cfu/ml,1个对照组:腹腔灌注灭菌生理盐水2ml。于灌注前1d、灌注后1d、3d、5d、7d共5个时间点,每个时间点4只大鼠,另设8只大鼠观察感染后一般情况及生存时间。观察受体一般情况、腹水细菌培养及白细胞计数、外周血白细胞计数、TCO2、HCO3-、PH、ALT、TB以及肝肾肺HE染色,评价感染的状态及严重程度。4.以DA或LEW大鼠为供体,LEW大鼠为受体,建立大鼠肝移植模型,根据有无诱导感染分为4组:G1组为LEW→LEW,无感染组;G2组为LEW→LEW,感染组;G3组为DA→LEW,无感染组;G4组为DA→LEW,感染组。注菌时间为术后第叁天,浓度1×106cfu/mL。每组于感染前1d、感染后1、3、5d,即术后第2、4、6、8d,共4个时间点,每个时间点4只大鼠。通过观察肝脏病理改变、免疫组化法及荧光定量PCR检测移植肝内CXCR3、CXCL10变化及TUNEL法检测肝脏淋巴细胞凋亡情况,评价细菌感染对移植肝免疫排斥反应的影响。5.实验动物分组、处置及取材时间同步骤4,应用流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群比例,单相混合淋巴细胞培养鉴定其功能,ELISA法检测血清细胞因子改变,观察细菌感染对受体T淋巴细胞亚群、功能和分化的影响。6.实验动物分组、处置及取材时间同步骤4,通过免疫磁珠分选术分离受体脾脏DCs,流式细胞术检测其表型、单相混合淋巴细胞培养鉴定其功能的改变,观察细菌感染对受体脾脏DCs的影响。7.以DA大鼠为供体,LEW大鼠为受体,建立大鼠肝移植模型,根据有无诱导感染和/或药物干预分为4组:G1组为移植对照组;G2组在G1组基础上药物干预;G3组为感染组;G4组感染后药物干预组。感染诱导方法同步骤4,胸腺肽α1一次性2mg于术后6天或感染后72h注入腹腔。每组于感染前1d、胸腺肽α1处理后2d,即术后第8d,共2个时间点,每个时间点4只大鼠,每组另设6只大鼠观察生存期。观察大鼠一般情况、生存期、移植肝病理变化、外周血T细胞亚群比例及功能变化,探讨免疫调理对大鼠肝移植术后腹腔感染的治疗作用。8.统计学处理:应用SPSS16.0软件进行单因素方差分析、t检验、秩和检验、生存分析等,P<0.05判定为有统计学意义。结果1.大鼠原位肝移植至操作稳定阶段,各主要步骤的时间为:供体手术30.2±2.5min,修肝5.7±1.6 min,肝上下腔静脉吻合9.1±0.8 min,门静脉重建1.6±0.5 min,肝下下腔静脉重建1.5±0.4 min,无肝期15.4±1.1 min,胆道重建1.1±0.3 min,受体手术39.5±1.4 min。手术成功率100%,1周存活率97.7%,晚期并发症如胆道梗阻发生率为3.3%。2.SD→SD组均生存超过120d;SD→Wistar组中位生存时间为100d,95%可信区间为(83.369～116.631)d;两组差异无统计学意义(P=0.317);DA→Lewis组中位生存时间为12d,95%可信区间为(10.125～13.848)d,生存时间明显较SD→Wistar组缩短,差异有统计学意义(P=0.000)。SD→SD组血清ALT、TBIL浓度术后随时间的延长,逐渐下降,肝功能好转;SD→Wistar组血清ALT、TBIL浓度随时间延长,于术后5d下降相对较慢,随后逐步下降;DA→Lewis组血清ALT、TBIL浓度术后随时间的延长,呈进行性升高。至术后10d,ALT:SD-SD< SD-Wistar
罗海英[5]2008年在《输注CTLA4Ig基因修饰骨髓间充质干细胞诱导大鼠移植肝免疫耐受的实验研究》文中认为肝移植是治疗终末期肝病最佳方法,但排斥反应的存在及长期应用免疫抑制剂所带来的毒副作用又限制了该方法的广泛开展,因此,诱导供者特异性免疫耐受成为肝移植研究的重点。本课题构建了携带CTLA4Ig融合基因的重组腺病毒,在体外感染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),通过RT-PCR、Western Blot及细胞免疫荧光化学等方法证实CTLA4Ig可以以外分泌方式进行表达。该转基因干细胞在体外显示出强于未转基因MSCs的抑制混合淋巴细胞反应(MLR)的作用,且将其培养上清加入到MLR体系中可以抑制体系中IL-2的产生,证实在此抑制过程中CTLA4Ig发挥了一定作用。应用含有HGF等因子的条件诱导培养液对CTLA4Ig基因修饰的MSCs进行肝细胞定向诱导分化培养,结果证实诱导后的细胞不仅可以表达AFP、Alb、CK18等肝细胞特异性标志,而且还具有储存糖原和摄取/排泌染料的成熟肝细胞功能,这说明基因修饰后的MSCs仍然具有向肝细胞分化的潜能。此外,在诱导7天时,转基因MSCs仍然具有与未经诱导的转基因MSCs相同的抑制MLR作用。以雌性LEW大鼠为受体,雌性DA大鼠为供体建立大鼠肝移植排斥模型,于肝移植术后经门静脉输注CTLA4Ig基因修饰的雄性LEW大鼠骨髓间充质干细胞,结果发现在不应用免疫抑制剂的情况下受鼠可长期存活(>120天),肝脏生化指标检测证实移植肝基本维持正常功能,组织病理学检查发现移植肝在术后30天排斥反应消失,证实受者对移植肝发生了免疫耐受,通过皮肤移植和混合淋巴细胞反应进一步证实此耐受为供者特异性免疫耐受。本研究将骨髓间充质干细胞的免疫抑制特性和CTLA4Ig阻断T细胞活化的CD28/B7协同刺激通路的功能结合起来,通过诱导供者特异性免疫耐受为最终摆脱肝移植术后终身使用免疫抑制剂带来的毒副作用,提高术后生活质量提供新的细胞治疗方案。
李春满[6]2016年在《抑制树突状细胞CD80、CD86表达诱导大鼠肝移植排斥低反应》文中认为终末期肝病治疗难度大、效果差,肝移植让众多患者看到了一线希望。肝脏移植后排斥反应虽然没有其他器官(如心、肺、胰和肾等)严重,但排斥问题仍然不能避免,是一个需要解决的难题[1]。目前,已经有大量新型免疫抑制药物研制成功,其在临床应用后,使排斥反应的发生得到了很好的控制,但是需要长期乃至终生应用药物,这加重了患者的经济负担,同时可能导致机体的免疫功能低下,进而诱发感染性疾病、或促进肝炎和肿瘤复发。若能诱导受体对移植物的排斥低反应或特异性免疫耐受,将是解决这一难题的最理想的方法。器官移植细胞免疫的基础是受体T细胞对供体抗原的免疫识别、活化和增殖。抗原的识别需要抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC)的参与,其中,树突状细胞(dendritic cell,DC)是众多抗原提呈细胞中最重要的,同时,它也是目前发现的唯一的能激活初始型T细胞(naive T cells)的APC,有研究证实其具有激活Treg的作用[1,2]。事实上,较Tr为早,DC就因为在肝移植中被发现具有诱导耐受的作用而被引入移植耐受研究中,研究认为供肝大量存在的DC在移植后迁移入受体诱导了免疫耐受[3]。T细胞在同种异体移植排斥反应中起着核心作用。受体T细胞对供体抗原的识别包括直接识别和间接识别,目前,越来越多的研究证实T细胞间接识别途径在移植物慢性功能丧失的发生机制中起重要的作用。因此,阻断间接识别信号通路,进一步了解其分子生物学发生机制,有可能诱导抑制排斥低反应,甚至诱导移植特异性免疫耐受的发生。在间接识别途径中,抗原呈递细胞表面共刺激分子与T细胞表面的相应受体的结合,使受体T细胞活化,其中,CD80/CD86-CD28是最重要、研究最多的一条共刺激通路。为此,本课题拟采用RNA干扰技术抑制供体树突状细胞表面CD80和CD86的表达,收集体内、体外实验的结果,观察阻断T细胞间接识别通路对大鼠同种异基因肝脏移植的影响,并初步探讨其相关机制。第一部分大鼠树突状细胞体外扩增和鉴定[目的]获取大鼠叁种不同成熟状态(imDC、smDC和mDC)的骨髓源树突状细胞。[方法]体外利用rrGM-CSF和rrIL-4诱导大鼠骨髓来源单个核细胞定向分化为树突状细胞(DC)。再分别不加刺激剂、添加TNF-α和LPS诱导DCs分化成未成熟(imDC)、半成熟(smDC)和成熟(mDC)。并对叁种成熟状态的树突状细胞进行形态、细胞表型和功能状态(对异基因淋巴细胞和CD4+CD25+Treg细胞的激活能力)的鉴定,确认所获得imDC、smDC和mDC的可靠性。[结果]所得smDC形态介于imDC和mDC之间;其高表达MHC-Ⅱ、中度表达CD80/86等共刺激分子,表型更为接近mDC;smDC与imDC一样,对异基因淋巴细胞无激活能力,而激活CD4+CD25+Treg细胞增殖的能力为叁者之中最强。[结论]利用rrGM-CSF和rrIL-4联合诱导,可获得纯度高、功能稳定的imDC、smDC 和 mDC。第二部分RNA干扰阻断不同成熟状态大鼠DC细胞CD80/CD86基因表达的研究[目的]针对大鼠CD80和CD86基因,构建RNAi慢病毒载体,在体外观察其对大鼠不同成熟状态骨髓源性DC细胞表面分子表达的影响。[方法]筛选确定大鼠DC细胞CD80、CD86基因RNAi的有效靶序列,合成慢病毒载体。慢病毒感染体外培养的大鼠骨髓源性未成熟、半成熟树突状细胞(imDC、smDC),以荧光显微镜检测感染效率,以流式细胞仪检测CD80和CD86的表达变化情况,Western Blot实验检测CD80和CD86基因蛋白质表达水平的变化。[结果]重组质粒shRNA PCR,shRNA的Oligo DNA序列测序结果证实,构建的LV-GFP-shCD80和LV-GFP-shCD86慢病毒载体正确;复感指数MOI为20时,慢病毒imDC和smDC的感染率分别为79.98%±5.01%及81.38%±4.96%,感染效率高。流式检测提示,不论是imDC还是smDC,同时感染LV-GFP-shCD80和LV-GFP-shCD86的DC,在加脂多糖促成熟后,CD80和CD86的表达均比空白对照组DC低,有统计学显着性差异(p<0.01),同时OX62和MHC-Ⅱ的表达未受到影响。Western Blot检测提示慢病毒转染后,imDC和smDC的CD80、CD86基因的蛋白质表达量较阴性对照组显着降低,imDC的蛋白质表达量较smDC更低。[结论]大鼠CD80和CD86基因RNA干扰慢病毒载体构建正确,其能明显抑制加脂多糖促成熟后imDC和smDC表面CD80和CD86的表达的增加。第叁部分重组慢病毒预处理的供体DC阻断受体T细胞共刺激通路的体外研究[目的]在体外观察重组慢病毒处理DC的免疫反应活性,证实其具有诱导移植免疫耐受的作用,为下一步的体内实验提供理论依据。[方法]分离受体大鼠脾脏T淋巴细胞,行混合淋巴细胞实验,检测重组慢病毒处理的供者DC刺激受者T细胞增殖的能力。预先采用各组DC致敏受体大鼠,取致敏大鼠脾脏T细胞与重组慢病毒预处理的供体DC,行再次混合淋巴细胞实验,检测预致敏的受体T细胞针对供体抗原特异性的免疫活性。同时,流式细胞检测两次混合淋巴细胞反应中,DC诱导受体Treg增殖的能力。[结果]大鼠CD80/CD86基因RNA干扰慢病毒载体处理的供者imDC和smDC,明显抑制了受体T细胞的增殖反应,并且能够诱导产生针对供者抗原的免疫低反应,imDC组的效应比smDC组强。同时可以刺激CD4+CD25+T细胞增殖,smDC的作用强于imDC。[结论]重组慢病毒处理DC在体外有诱导移植免疫耐受的作用。第四部分建立大鼠原位肝移植急性排斥反应模型[目的]建立稳定的大鼠同种异体原位肝移植模型,观察Lewis→BN大鼠肝移植急性排斥反应的特点。[方法]采用改良“二袖套管法”,以SD大鼠进行训练,建立稳定的大鼠同种异体原位肝移植模型,随后,选择Lewis大鼠为供体,BN大鼠为受体,分为BN→BN肝移植非干预组、Lewis→BN肝移植非干预组、Lewis→BN肝移植干预组(围手术期短期饲喂治疗剂量的雷帕霉素),观察实验动物术后生存情况及生存时间,检测术后第1d、4d、7d、10d天肝功能、移植肝大体改变及病理改变。[结果].BN→BN组大鼠术后可长期存活,肝功能稳定无明显恶化,全段观察时间内病理切片无明显排斥反应或仅有轻微排斥反应;Lewis→BN非干预组大鼠术后早期死亡,肝功能急剧恶化,病理切片出现迅速而强烈的急性排斥反应;Lewis→→BN干预组大鼠在停药后逐渐死亡,生存期不超过2周,停药前肝功能逐渐恢复,停药后迅速恶化,病理切片有不同程度的排斥反应,停药前排斥反应轻,停药后迅速加重。[结论]Lewis→BN组大鼠肝移植排斥反应明显,可作为ROLT急性排斥模型。雷帕霉素可以有效抑制Lewis→BN组大鼠肝移植排斥反应。第五部分RNA干扰阻断CD80、CD86的不同成熟状态供体树突状细胞在大鼠肝移植模型中致排斥低反应的研究[目的]在建立同种异基因大鼠肝脏移植模型的基础上,探讨重组慢病毒处理的供体树突状细胞在体内诱导移植免疫低反应的可行性及其免疫学机制。[方法]以Lewis大鼠为供体,BN大鼠为受体,分为未成熟树突状细胞组、半成熟树突状细胞组、未成熟树突状细胞干扰组、半成熟树突状细胞干扰组。移植术前7天经尾静脉输注各种不同的供体树突状细胞预处理大鼠,行大鼠两袖套原位肝移植。观察肝脏移植大鼠的生存情况及存活时间,检测术后第1d、4d、7d、10d天肝功能变化、外周血细胞因子和Treg细胞增殖的情况、组织病理学改变。[结果]术前输注各种供体DC配合术后使用雷帕霉素,与单纯使用雷帕霉素比较,可以进一步延长受体大鼠术后生存时间,减轻移植术后肝功能损伤,减轻急性排斥反应的程度,停药后(10d)尤其明显。术前输注各种供体DC配合雷帕霉素,可以抑制Th1型细胞因子(IL-2和IFN-γ)、促进Th2型细胞因子(IL-2和IL-10)的分泌,诱导肝脏移植受体外周血中Treg细胞的产生。RNA干扰CD80/CD86的DC组上述各种反应优于未经RNA干扰组。[结论]术前输注各种供体DC配合术后使用雷帕霉素可以诱导移植免疫低反应。各种DC与雷帕霉素可能有协同作用。RNA干扰技术阻断共刺激通路确实对移植物产生了保护作用。通过体内外实验,我们证实供体imDC和smDC有诱导受体免疫低反应的能力,若使用RNAi技术阻断DC表面共刺激分子CD80/CD86的表达,则其诱导受体免疫低反应的能力增强,为DC诱导免疫耐受指出了一个研究方向。
彭勇[7]2005年在《核因子-κB圈套协同CTLA4-Ig抗大鼠肝移植急性排斥反应的研究》文中研究指明目的 (1)分离培养大鼠 Kupffer 细胞(KCs),观察在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下 KCs 的活化情况,以及 LPS 刺激前转 染 人 工 合 成 的 NF-κB 圈 套 寡 脱 氧 核 苷 酸 ( decoy oligodeoxyribonucleotide, decoy ODN)对 KCs 活化的抑制作用。(2)建立大鼠原位肝移植动物模型,总结手术技巧和方法,观察 Lewis(Lew)到 Brown Norway(BN)大鼠同种异体急性排斥反应(acute rejection, AR)的发生发展以及基本病理生理指标变化过程。(3)观察细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原 4-Ig(cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4-Ig,CTLA4-Ig)单独应用或与 NF-κB 圈套联合应用对大鼠急性排斥反应的抑制作用。通过以上叁部分实验,试图阐明 NF-κB 圈套协同CTLA4-Ig 抗大鼠肝移植急性排斥反应的确切机制。方 法 (1)胶原酶原位灌注法分离大鼠 KCs 并随机分为 3 组:正常对照组、LPS 刺激组及 NF-κB 圈套组,后者在 LPS 刺激前用脂质体将人工合成的 NF-κB 圈套(异硫氰酸荧光素标记)转染 KCs(4μg/1x105 KCs),并通过荧光显微镜鉴定转染效果。除对照组外,两个实验组培养液中加入终浓度为 1mg/L 的 LPS,于 LPS 刺激 6h 后,检测 KCs 吞噬功能改变(吞噬墨汁实验),免疫组化检测 NF-κB 细胞内易位情况,凝胶电迁移率改变分析法(EMSA)检测 NF-κB 蛋白结合活性,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测 KCs 膜表面 CD80 mRNA表达, ELISA 检测培养上清 TNF-α 和 IL-6 表达情况,确定 LPS 对 KCs的激活,以及 NF-κB 圈套对 KCs 活化的抑制作用。(2)用“两袖套法”建立大鼠原位肝移植动物模型,即肝上下腔静脉用缝合法连续吻合,门静脉、肝下下腔静脉用袖套法吻合,胆管内支架法完成胆道重建。实验分 3 组进行:正常对照组、同基因移植组(LEW-LEW)及同种异基因移植组(LEW-BN)。除观察大鼠存活率外,移植组受体分别于术后 3 d,5 d,7 d 和 10 d 活杀取标本,观察肝脏组织病理和超微结构变化,全自动生化分析法测定血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(Alb)水平变化,ELISA 检测血清 IL-2 含量,阐明肝移植急性排斥的发生发展过程,以及基本病理生理指标变化特征。(3)按上述方法建立大鼠肝移植急排模型(LEW-BN),实验分 4 组进行:急排组(术后不给予任何免疫抑制剂处理)、CTLA4-Ig 组(移植术后当天至术后第 7 天,每天腹腔内注射 CTLA4-Ig 0.25mg/kg 体重)、NF-κB圈套组(移植术前 2 天供体经尾静脉注射 120μg 脂质体包裹的 NF-κB圈套)、联合用药组(供、受体同时接受圈套和 CTLA4-Ig 治疗,用药方法和剂量同前两组)。除观察大鼠存活率外,各组大鼠于术后第 7d活杀动物,取其肝脏分离 KCs,荧光显微镜检测圈套的转染效果,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测 NF-κB 转录活性,RT-PCR 观察 KCs膜表面共刺激分子 CD80、CD40、CD54 mRNA 表达,原位杂交检测移植肝中 TNF-α、IFN-γ mRNA 表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测肝脏和脾脏细胞凋亡,同时观察肝脏组织病理、超微结构,及肝功变化。阐明 NF-κB 圈套协同 CTLA4-Ig抗大鼠肝移植急性排斥反应的分子机制。结果 (1)脂质体可以介导 NF-κB 圈套高效转染 KCs,转染后48 h 荧光显微镜下鉴定转染效果达 85%;在 LPS 刺激下,培养的 KCs表现出活化特性: 吞噬墨汁功能明显增强,免疫组化显示 NF-κB 由胞浆易位进入胞核,EMSA 显示细胞核内 NF-κB 活性明显增强,RT-PCR
成峰[8]2004年在《转座元介导转人白细胞介素-10基因抗大鼠肝移植排斥反应及其对大鼠部分肝移植肝再生影响的实验研究》文中研究指明第一部分 人白细胞介素-10基因的克隆及转座元系统的构建 研究背景：细胞介素-10最主要的特征是能够影响T淋巴细胞的生长与分化。由于其能够抑制小鼠IL-2、IFN-γ和TNF-α，故最初被称为细胞因子合成因子，在人类，白细胞介素-10可由多种类型的细胞产生，包括T淋巴细胞(尤其是Th2细胞)、B淋巴细胞、吞噬细胞和NK细胞。HIL-10可抑制IL-2、IFN-γ、(GM-CSF)粒-巨噬细胞集落刺激因子和Th1细胞的增殖，抑制抗原递呈分子和共刺激分子的表达影响DC细胞的抗原递呈作用，阻碍成熟的单核细胞向DC细胞转化。正是IL-10具有较强的抗炎作用和免疫抑制作用，IL-10归属于为Th2类细胞因子。这就决定了IL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病的基因治疗等方面有重要、广阔的临床应用前景。Sleeping Beauty转座元(SB)是近年发现的哺乳动物转座元，可在Sleeping Beauty转座酶作用下将所携带的外源基因整合到脊椎动物细胞染色体上，介导外源基因长期表达。目的：人白介素10基因的克隆和转座元系统的构建。方法：应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术，从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10cDNA，将测序正确的hIL-10cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体。 南京医科大学博士学位论文结果:构建的含目的基因的载体能抑制淋巴细胞转化，即获得具有生物学活性的lL一10蛋白的表达。结论:所构建的含目的基因的载体和转座元系统为下一步研究lL一10在移植免疫中的作用，提供了条件。关健词:人类白细胞介素一10克隆第二部分转座元介导转人白细胞介素一10基因杭大鼠肝移植排斥反 应的实验研究研究背景:目前临床应用的免疫抑制剂虽能使移植排斥反应得到有效控制，但由于其对受者免疫系统非选择性的广泛抑制，常引起感染、，讼血管疾病、代谢性疾病、肿瘤等诸多并发症。即使临床肝移植应用兔疫剂，仍有约40%一70%的病人会发生排斥反应，在此过程中细胞因子发挥重要的作用。Thl细胞因子如IL一2、TNF一a、和IFN一丫调节细胞免疫反应，而ThZ细胞因子如IL一4和IL一10则能够抑制Thl细胞的功能，抑制炎症反应。丁hl细胞通过上调MHC一I和MHC一11的表达、激活巨噬细胞和内皮细胞、上调细胞粘附分子的表达、促进白细胞的募集和激活。心脏、’肾脏和肝脏移植术后发生排斥反应时血浆卫NF一a水平明显增高。器官移植的动物实验研究表明ThZ类细胞因子如IL一4和IL一10能使移植物长期存活，其机制可能通过下调致炎症因子的表达。IL一10通过降低MHC一H类分子、B7分子的抗原递呈作用，从而抑制T细胞的激活。因此本实验在建立大鼠肝移植模型的基础上采用转座元介导hlL一10基因，经门静脉灌注供肝，试图其在移植免疫排斥中的作用，并观察与比较常规免疫抑制剂的作用。目的:研究SB转座元系统转hIL一10基因诱导同种异体大鼠扦移植 南京医科大学博士学位论又杭排斥反应的机制。方法:采用“二袖套”法建立SD一Wi Sta:同种异体大鼠急性排斥模型，实验分组:1.对照组:未进行任何治疗n=6;2.空白DOTAP组:n二6;3.DOTAP组治疗组:n=6; 4.转座元介导hlL一10基因治疗组:n=6;5.FKSO6治疗组:n=6。术后Zd、4d、7d、14d眼眶采血，收集血清，生化检测转氨酶水平。ELI SA检测DOTAP组治疗组和转座元介导 hIL一10基因治疗组hIL一10表达，R卫PCR检测移植物内细胞因子mRNA。原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡。同时观察各组大鼠肝移植后的生存期。结果:转座元介导hIL一10基因治疗组和FK506治疗组大鼠移植术获得长期存活。对照组及。OTAP组治疗组均呈H一111级排斥反应，而FK506及转座元介导hlL一10基因治疗组无排斥反应或轻度炎症细胞浸润。对照组和空白DOTAP组移植术后转氨酶明显高于SB转座元一hIL一10治疗组和FK506治疗组，RT一PCR和ELISA检测表明术后两周SB转座元-hIL10治疗组仍有高水平的IL一10的表达，高于DOTAP转基因组，ThZ类细胞因子IL一4在转座元介导hIL一10基因治疗组大鼠高表达，Thl类细胞因子IL一2和IFN一y在各实验组之间无明显差异。结论:比一10具有抗大鼠排斥反应的作用，延长大鼠生存期。其机理主要是通过过度表达的lL一10通过促进移植物内浸润T细胞凋亡而诱导特异性无反应性，抑制了免疫反应的识别阶段。 关健词:肝移植大鼠基因治疗细胞凋亡免疫耐受 南京医科大学博士学位论又第叁部分不同冷缺血时间及转座元介导hll产10基因对大鼠部分肝 移植术后肝再生的影响 前言研究背景:肝脏移植作为治疗终末期肝病的主要用段在过去20年内取得重大进步，对供肝的需求在日益扩大，全球性的供肝医乏严重阻碍了肝移植的发展。劈裂式及活体肝移植为解决供肝来源问题开拓了新的途径，两者部分肝脏移植至受体体内均有不同时间的冷缺血时间，移植后?
黄雄[9]2006年在《15d-PGJ_2在大鼠肝移植抗排斥和诱导免疫耐受中的作用研究》文中进行了进一步梳理目的 (1)了解15d-PGJ_2在大鼠肝移植中是否有抗排斥和诱导免疫耐受的作用；(2)了解15d-PGJ_2在大鼠肝移植中发生作用的机理。 方法 (1)在用“两袖套法”建立稳定的大鼠肝移植模型后，将大鼠分为非排斥组(LEW→LEW，A组)、排斥组(DA→LEW，B组)和排斥干预组(DA→LEW+PGJ_2，C组)。每组各13只，于术后14天每组8只取标本，另外5只留观生存率。(2)观察症状、肝脏组织病理改变、测定血浆总胆红素(TBIL)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)及白蛋白(ALB)水平。(3)用荧光定量PCR方法行肝PPARγmRNA测定；ELISA法测定血浆中细胞因子IL-2、IL-10的变化；MTT法检测T淋巴细胞增殖活性；TUNEL法检测肝组织中淋巴细胞的凋亡。 结果 (1)叁组大鼠肝移植主要手术步骤所需时间无明显差异。A组生存时间最长，B组最短，C组居中(P＜0.05)；(2)术后14天的肝功能和排斥反应情况，A组最好，C组次之，B组最差(P＜0.05)；(3)PPARγmRNA在干预组最高，与其它组有统计意义的区别(P＜0.05)，其它两组较低且区别没有统计意义；(4)IL-2在排斥组最高，非排斥组最低，干预组居
胡凡果[10]2013年在《干预供肝CIITA与MyD88基因表达抑制大鼠肝移植排斥反应的实验研究》文中进行了进一步梳理第一部分纳米载体HGPAEs的制备及检测目的：制备纳米载体组氮酸接枝聚(β-氨基酯)(HGPAEs)并观察其体内应用的安全性与有效性。方法：制备纳米载体组氨酸接枝聚(β-氨基酯)(HGPAEs),并对其进行性能测试；设置生理盐水组、纳米载体组和纳米载体质粒组,经门静脉注射体内转染大鼠肝脏,采取转染后第一天和第叁天肝脏标本和静脉血,应用全波长酶标仪检测方法评价体内肝脏转染效果,并检测大鼠肝肾功能变化。结果：成功制备了纳米载体组氨酸接枝聚(β-氨基酯)(HGPAEs),经验证其具有作为基因载体的必备条件；第一天和第叁天纳米载体质粒组的增强型绿荧光蛋白荧光强度均显着强于生理盐水对照组和纳米载体组(P<0.01),纳米载体质粒组第叁天荧光强度强于第一天(P<0.01)；转染术后第一天,与正常值比较,各组ALT、AST均显着升高(P<0.01),但各组间比较无明显差异(P>0.05),转染术后第叁天,各组生化指标均趋于正常。结论：纳米载体组氨酸接枝聚(β-氨基酯)制备简便,是一种安全高效的基因载体；以纳米载体为介导经门静脉注射的方法可使shRNA质粒在体内肝脏获得高效转染。第二部分纳米载体介导沉默基因CⅡTA和MyD88表达的体内研究目的：观察RNA干扰对免疫识别相关基因CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88表达的抑制效果。方法：设置生理盐水对照组、纳米载体组、纳米载体pHK-shRNA组和纳米载体pC Ⅱ TA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组、纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组叁个干预组,通过门静脉注射方法体内转染大鼠肝脏,转染后第叁天取肝脏,以荧光定量PCR(?)western blot分别检测肝脏转染后CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因mRNA和蛋白水平的表达变化。结果：荧光实时定量PCR和western blot检测显示纳米载体pC Ⅱ TA-shRNA组和纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组CⅡTA和MHC Ⅱ基因mRNA和蛋白表达均较生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组显着降低(P<0.01)；纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pC Ⅱ TA-pMyD88-shRNA组MyD88基因]mnRNA和蛋白表达较生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组也有显着降低(P<0.01)；而纳米载体组、纳米载体pHK-shRNA组与生理盐水组之间CⅡTA、MHCⅡ和MyD88基因无论mRNA还是蛋白表达均无显着性差异(P>0.05)。结论：以纳米载体(HGPAEs)为介导经门静脉注射的方法,应用针对CⅡTA和MyD88的shRNA质粒转染大鼠肝脏,可显着抑制肝脏CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因表达。第叁部分干预供体移植物抑制大鼠肝移植排斥反应的研究目的：观察抑制供体肝脏CⅡTA和MyD88基因的表达对高应答大鼠原位肝移植模型移植排斥反应的影响,探讨其抗排斥机制。方法：建立高应答大鼠原位肝移植模型；设置生理盐水组、纳米载体组、pHK-shRNA纳米载体组、纳米载体pC Ⅱ TA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pCⅡTA-pMyD88-shRNA组,各组采用经门静脉注射的方法干预供体大鼠肝脏,干预后3天取肝脏进行肝移植,每组各12只大鼠,于移植术后第5天随机选取6只大鼠取静脉血和移植肝脏,病理切片确定排斥反应分级,分别采用荧光定量PCR和western blot检测肝中CⅡTA、MHC-Ⅱ和MyD88基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,流式细胞术检测血中CD4/CD8细胞比例,ELISA去检测血清IL-2和IFN-γ浓度,并检测肝功能,其余6只用于观察存活期。结果：稳定建立高应答大鼠原位肝移植模型；与生理盐水组、纳米载体组和纳米载体pHK-shRNA组.相比,纳米载体pCⅡTA-shRNA组、纳米载体pMyD88-shRNA组和纳米载体pC Ⅱ TA-pMyD88-shRNA组大鼠存活时间明显延长(中位生存期16天、14天和21天vs10天、9天和8天,P<0.01),排斥反应病理分级明显降低(P [1]. 大鼠肝移植急性排斥模型的建立及CTLA4-Ig抗排斥和诱导免疫耐受的实验研究[D]. 智星. 四川大学. 2004 [2]. 携带HLA-G慢病毒转染大鼠原代培养肝细胞及对抗大鼠肝移植排斥反应的研究[D]. 孙培龙. 中南大学. 2013 [3]. 免疫抑制剂联合供体骨髓输注诱导大鼠肝移植免疫耐受的实验研究[D]. 祝哲诚. 复旦大学. 2003 [4]. 术后腹腔细菌感染对原位肝移植大鼠细胞免疫功能的影响及胸腺肽α1的作用[D]. 林拥华. 福建医科大学. 2010 [5]. 输注CTLA4Ig基因修饰骨髓间充质干细胞诱导大鼠移植肝免疫耐受的实验研究[D]. 罗海英. 吉林大学. 2008 [6]. 抑制树突状细胞CD80、CD86表达诱导大鼠肝移植排斥低反应[D]. 李春满. 昆明医科大学. 2016 [7]. 核因子-κB圈套协同CTLA4-Ig抗大鼠肝移植急性排斥反应的研究[D]. 彭勇. 重庆医科大学. 2005 [8]. 转座元介导转人白细胞介素-10基因抗大鼠肝移植排斥反应及其对大鼠部分肝移植肝再生影响的实验研究[D]. 成峰. 南京医科大学. 2004 [9]. 15d-PGJ_2在大鼠肝移植抗排斥和诱导免疫耐受中的作用研究[D]. 黄雄. 四川大学. 2006 [10]. 干预供肝CIITA与MyD88基因表达抑制大鼠肝移植排斥反应的实验研究[D]. 胡凡果. 天津医科大学. 2013参考文献：