张雪峰1 胡燕1 陈海红2（ 1 江苏省海门市人民医院 江苏南通 2 2 6 1 0 0 ； 2 江苏省海门市中医院 江苏南通 2 2 6 1 0 0 ）
【摘要】目的：建立清咽润喉止咳糖浆的微生物限度检查方法, 并对方法进行验证。方法：采用培养基稀释法(0.2m L / 皿) 进行细菌限度检查, 采用常规法进行霉菌及酵母菌限度检查；采用常规法进行控制菌( 大肠埃希菌) 检查。结果：验证实验中各类菌的回收率均大于70%。结论：该方法有效可行, 可用于该品种的微生物限度检查。
【关键词】 清咽润喉止咳糖浆 微生物限度检查 方法验证【中图分类号】R927 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）36-0028-02清咽润喉止咳糖浆（苏药制字Z04001344）是临床使用多年的医院制剂, 由青果、玄参、麦冬、杏仁、等十三味药组成, 具有清咽润喉、润肺止咳之功效, 临床主要用于慢性咽炎、咽痒咽干，干咳无痰等症的治疗。根据《中国药典》2010 年版( 一部) 微生物限度检查法规定, 在建立药品的微生物限度检查法时, 应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法和控制菌检查方法的验证, 以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定和控制菌的检查, 笔者查阅了有关文献[1、2] 并经过多次实验, 确定了清咽润喉止咳糖浆微生物限度的检查方法, 更进一步保证了该制剂的质量。
1 仪器与材料PYX-DHS 细菌培养箱（上海市医疗器械一厂）；MJ-160B 霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；B s -600L 电子天平（上海友声衡器有限公司）；Z F - Ⅰ型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；SWCJ-IC 型净化工作台（苏州吴净空调净化设备厂）。
试验菌种：大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44102]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）[CMCC(B) 26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63501]、白色念珠菌（Candidaalbicans）[CMCC(F) 98001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003], 由中国药品生物制品检定所提供。
营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、改良马丁液体培养基、胆盐乳糖培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基、MUG 培养基、改良马丁琼脂培养基, 由中国药品生物制品检定所提供。
2 方法[3]2.1 菌液制备2.1.1 取经35℃培养18 ～ 24h 的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜营养肉汤培养物1m L , 用0.9% 无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5 ～ 10-7, 约为50 ～ 100cfu?mL-1, 做活菌计数备用。
2.1.2 取经25℃培养24 ～ 48h 的白色念珠菌改良马丁液体培养物1m L , 用0.9% 无菌氯化钠溶液10 倍稀释至10-5 ～ 10-6, 约为50 ～100cfu?mL-1, 做活菌计数备用。
2.1.3 取经25℃培养1 周的黑曲霉改良马丁斜面培养物, 加0.9%无菌氯化钠溶液10 倍稀释至10-4, 约为50 ～ 100c f u ? m L -1, 做活菌计数备用。
2.2 供试液制备 取供试品10g 加p H7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液90mL, 摇匀, 作为1:10 供试液备用。
2.3 细菌、霉菌和酵母菌计数方法（平皿法）的验证2.3.1 试验组 取1:10 供试液1mL 和上述制备好的阳性对照菌液1m L 置平皿中, 加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基( 白色念珠菌用改良马丁琼脂培养基) , 混合均匀, 放置凝固后, 置规定的温度培养至规定的时间, 逐日观察结果, 做菌落计数。
2.3.2 菌液组 分别取实验菌lmL 注入平皿中, 立即琼脂培养基,每种实验菌平行制备2 个平皿, 待凝固后, 置规定的温度培养至规定的时间, 逐日观察结果, 做菌落计数。
2.3.3 供试品对照组 取“2.2 项下” 1:10 供试液lmL 置平皿中,立即倾注琼脂培养基, 待凝固后, 置规定的温度培养至规定的时间, 逐日观察结果, 测定供试品本底菌数。
2.3.4 稀释剂对照组 取pH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液1mL置平皿中, 加入营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基( 白色念珠菌用改良马丁琼脂培养基) , 混合均匀, 放置凝固后, 置规定的温度培养至规定的时间, 逐日观察结果。
2.3.5 回收率的计算 试验组的加菌回收率（%）=( 试验组平均菌落数- 供试品对照组平均菌落数)/ 菌液组平均菌落数×100%；稀释对照组的加菌回收率（%）= 稀释对照组的平均菌落数/ 菌液组平均菌落数×100%。结果见表1。
表1 清咽润喉止咳糖浆细菌、霉菌和酵母菌回收率的测定（平皿法）.jpg)
2.4 培养基稀释法：取1:10 供试液2mL, 每毫升供试液等量分注5个平皿, 每10 个平皿为1 组, 即按培养基0.2m L 稀释法进行微生物限度检查方法验证。取上述制备好的金黄色葡萄球菌阳性对照菌液1m L ,分组注入平皿中, 倾注琼脂培养基, 混匀, 凝固后, 倒置培养。计算回收率。经实验证明, 采用培养基0.2mL 稀释法, 金黄色葡萄球菌的回收率均>70％ , 故细菌可采用培养基稀释法进行微生物限度检查。结果见表2。
表2 清咽润喉止咳糖浆细菌回收率测定（培养基稀释法0.2mL/ 皿）.jpg)
2.5 控制菌检查方法的验证2.5.1 供试液的制备 同“2.2”项下1:10 供试液的制备。
2.5.2 试验组 取1:10 供试液10m L , 加入上述大肠埃希菌液50～ 100cfu, 置100mL 胆盐乳糖培养基中,35 ～ 37℃培养24h。取上述培养物0.2mL, 接种至含5mL MUG 培养基的试管中培养, 于5h、24h 在366nm 紫外线下观察有荧光反应。沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色。
2.5.3 阴性菌对照组 取1:10 供试液10mL, 加入上述金黄色葡萄球菌50 ～ 100c f u , 置100m L 胆盐乳糖培养基中,35 ～ 37℃培养24h。
取上述培养物0.2mL , 接种至含MU G 培养基的试管中培养, 于5h、24h 在366n m 紫外线下观察无荧光反应。沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液, 液面呈试剂本色。结果见表3。
表3 控制菌( 大肠埃希菌) 检查方法验证结果.jpg)
上述验证结果表明, 试验组检出了大肠埃希菌而阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌。说明可采用常规法对本品进行控制菌( 大肠埃希菌)检查。
2.6 结果 根据以上实验得出该品种微生物限度检查方法为：取供试品10g 加pH7.0 无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液90mL, 摇匀, 作为1:10供试液。采用培养基稀释法(0.2m I / 皿) 进行细菌限度检查, 采用常规法进行霉菌及酵母菌限度检查；控制菌( 大肠埃希菌) 检查亦采用常规法。
3 讨论由于本供试品对金黄色葡萄球菌具有明显抑制作用, 采用常规法不能消除其抑菌性, 故采用培养基稀释法(0.2m/ 皿) 进行微生物限度检查方法验证, 经过3 次独立平行实验, 结果显示金黄色葡萄球菌的回收率均>70％ , 因此可采用培养基0.2mL 稀释法进行清咽润喉止咳糖浆细菌的微生物限度检查。
参考文献[1] 宋嵩文, 黎强, 庞兴寿, 等. 咳特灵胶囊微生物限度检查方法的验证[J]. 中国药师.2008,11(11):1379-1380[2] 汤大妹, 汪键, 赵勤, 等. 参味合剂微生物限度检查方法的验证. 实用临床医药杂志.2010,14(1):69-70[3] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. 一部. 北京：化学工业出版社,2010：附录79-88
论文作者:张雪峰1 胡燕1 陈海红
论文发表刊物:《中外健康文摘》2013年36期
论文发表时间:2014-4-2