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【摘要】本文通过荧光定量RT-PCR与常规RT-PCR，分别对191例临床粪便样本进行GⅠ、GⅡ型诺如病毒的快速检测，优化反应条件，筛选出最优反应体系，对两种方法的特异性、灵敏性进行检测分析。发现两种方法均可较好的检测出GⅠ、GⅡ型诺如病毒。其中常规RT-PCR阳性样本数为142，检出率为74.34%，最低检出限为103copies/μl，标准曲线均呈现出良好的线性关系，扩增效率分别为101.336%、103.558%；荧光定量RT-PCR的阳性样本为163，检出率为85.34%，最低检出限为102copies/μl，批内、批间重复试验的标准差范围为0.10～0.59，变异系数范围为0.43%～2.84%，重复性良好。两种方法检出率有显著差异（P＜0.05），且对星状病毒、腺病毒以及肠道病毒等均无交叉反应，GⅠ、GⅡ型诺如病毒之间也无交叉反应。荧光定量RT-PCR在灵敏度方面占优，建议在临床检测中应用。
【关键词】RT-PCR；荧光定量RT-PCR；GⅠ、GⅡ型诺如病毒
【中图分类号】R440 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）08-0239-03
1.前言
传统PCR需要分离染色，定量不准，因此在退火、延伸过程中对核酸中EB含量进行检测，从而对目标基因精确定量。此方法为非特异性的，仅能反映核酸总量。于是在接下来的几年中，研发出了实时荧光定量PCR技术，比原技术有了质的飞跃，使得DNA定量更高效，分析更准确，灵敏性更高。
因此对诺如病毒进行相应的检测尤为必要，主要检测方式有逆转录-聚合酶链反应(即RT-PCR)以及酶联免疫吸附实验 (即ELISA)。又因为该病毒不能体外培养，相关动物模型匮乏，变异型较多，为检测增加了难度。
2.实验方法
2.1 材料与方法
2.1.1 样品采集 191份粪便样本采集自山东省青岛市（可改），临床病例表现为腹泻、腹痛、呕吐, 部分患者出现寒战、发热。样品用PBS配制成20%粪便悬液，保存于-80℃。
2.1.2 试剂仪器 TIANamp Virus RNA Kit购自TIANGEN公司，PrimeScript RT Reagent Kit购自TaKaRa公司。
2.2 引物与探针
引物及探针设计如表1所示，由上海生工生物有限公司合成。
3.2 讨论
NV家族病毒种类多，变异多，又缺少相应的动物模型，早期研究只能用电镜检测，但此法灵敏度很低，且技术要求高，过程复杂。随着分子技术的不断发展，新技术方法不断被研发、运用，RT-PCR、ELISA等已被广泛运用，使得诺如病毒的检测方法更为高效、特异。ELISA较电镜法更为灵敏，但检出率较低，且假阳性较多，RT-PCR法则更加快速准确，继承了ELISA的高灵敏性，又降低了假阳性概率，因此广泛运用于诺如病毒的检测中。诺如病毒感染引发的疾病发病、传播较快，会在短时间内爆发，因此需要在较短时间内尽快检测数量巨大的临床样本，利用荧光定量RT-PCR可以达到这一目的。可对人体造成危害的GⅠ、GⅡ型诺如病毒分别有14、17个亚型，而设计出适合的引物和探针尤为重要。对常规RT-PCR检测诺如病毒的引物对比发现，Kojima等对衣壳蛋白保守区的引物设计GⅠ-SKF/GⅠ-SKR及Ⅱ型的相关设计，较为理想，而之前的实时荧光定量RT-PCR 引物和探针设计主要是针对 ORF1的聚合酶区段和ORF2的壳蛋白区段。Kageyama设计的引物和探针是针对NV RNA 的 ORF1-ORF2 交界处的N/S结构域设计的，适合用于 NV 的检测与分型，敏感性及特异性较好，灵敏度也较高，可达99%。
本文中采用常规RT-PCR与荧光定量RT-PCR均可较好的检测出GⅠ、GⅡ型诺如病毒，且特异性较好。其中，荧光定量RT-PCR检出限比常规RT-PCR提高约10倍。本文中采用的方法与基于Allglo探针的一步法效率没有明显差别。而比二步法的灵敏度高10倍。对191份临床样品进行检测的最终结果显示，常规RT-PCR阳性样本数为142，检出率为74.34%，荧光定量RT-PCR的阳性样本为163，检出率为85.34%，经统计学分析后发现，两种方法检出率有显著差异（P＜0.05）。同时对阳性样本进行测序分析，结果显示都为诺如病毒，证明RT-PCR法较为可靠。但对数量较多的临床样本来说，荧光定量RT-PCR敏感性更高，特异性更强，检测速度更快，同时可以完全闭管，极大的避免了假阳性概率，使得高通量测序变的可行，荧光探针也使该法更有效，省去了酶切分析、探针杂交验证等步骤，建议优先使用。
【参考文献】
[1]刘巍,隆文杰,石玲玲,等.应用实时荧光定量RT-PCR技术快速检测基因Ⅱ型诺如病毒[J].应用预防医学,2007,13(3):129-132.
[2]夏体娇,金敏,陈照立,等.荧光定量RT-PCR检测诺如病毒基因Ⅱ型方法的建立和评估[J].解放军预防医学杂志,2013,31(3):200-203.
论文作者:蒋邱逃1,孙华杰2
论文发表刊物:《医药前沿》2018年3月第8期
论文发表时间:2018/3/22
标签：定量论文; 荧光论文; 病毒论文; 检出论文; 引物论文; 探针论文; 阳性论文; 《医药前沿》2018年3月第8期论文;